本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种γδt细胞的培养方法。
背景技术：
近年来，随着细胞分子生物学和基因工程改造等技术的飞速发展，细胞免疫治疗已成为继手术、化疗和放疗三大常规治疗之后的第四种肿瘤治疗的新模式。通过大量的基础生物学研究和临床实验等安全性、有效性数据结果显示，基因修饰化免疫细胞治疗(car-t/tcr-t)方法明显优于t细胞过继免疫治疗和树突状细胞(dc细胞)免疫治疗。
car-t疗法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy)，嵌合抗原受体t细胞疗法，在治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤上有显著的效果。它的基本原理是通过分离获得病人自体的t细胞，通过基因工程改造编辑t细胞，使t细胞表达相关肿瘤抗原特异性的scfv抗体片段的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。通过与肿瘤细胞表面特异性的抗原受体结合，激活t细胞后释放大量细胞因子、肿瘤杀伤因子等清除肿瘤细胞。
按t细胞表面受体(tcr)的不同，t细胞可分为αβt细胞和γδt细胞，其中，αβt细胞占t细胞总数的95％以上，γδt细胞则至占t细胞总数的2-5％，且主要分布于黏膜相关淋巴组织中。在过去研究中，人们对γδt细胞的功能及认知有限，但随着生物技术的快速发展，γδt细胞的生理功能和作用机制却被不断发现。研究发现，γδt细胞所具备的非mhc限制杀伤肿瘤细胞的特征使之可以成为一种理想的细胞制剂原料，可以在无抗原呈递细胞(apc细胞)的作用下，直接启动对肿瘤细胞的杀伤，并且对有免疫逃逸倾向低表达mhc分子的肿瘤细胞，也具备良好的杀伤效果。
然而，目前却并没有一种专门针对γδt细胞而设的细胞培养方法，将具有普遍广泛性的t细胞培养方法用于γδt细胞的培养明显不具备针对性，且十分不利于γδt细胞的扩增以及对肿瘤细胞的杀伤活性。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种专门针对γδt细胞而设的γδt细胞的培养方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种γδt细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的制备
从150-250ml外周血中分离获得单个核细胞，用添加有anti-cd3antibody与anti-cd28antibody的无血清培养基充分重悬后，调整单个核细胞密度为(2-3)x106细胞/ml，再将装有上述培养液的细胞培养瓶于培养箱中培养3天；
(2)t细胞的扩增培养
第4天，向细胞培养瓶中补加50-100ml不添加抗体的无血清培养基；
第8天，向细胞培养瓶中补加100-200ml不添加抗体的无血清培养基；
第12天，t细胞扩增培养结束；
(3)γδt细胞的筛选
使用γδt细胞阳性筛选试剂盒对上述t细胞进行筛选，将分选后的γδt细胞转移至新的细胞培养瓶中，并补加γδt细胞培养基，再于培养箱中培养3天；其中，γδt细胞培养基具体为添加有5-15mg/l转铁蛋白、5-15％人ab血清或自体血浆或胎牛血清fbs、100-200mmβ-巯基乙醇、5-15mg/l胰岛素、50-200u/mlil-2、50-200u/mlil-4、2-5mm丙酮酸钠和100-200um异戊烯焦磷酸的rpmi-1640培养基；
(4)γδt细胞的扩增培养
第4天，向细胞培养瓶中补加50-100mlγδt细胞培养基；
第8天，向细胞培养瓶中补加100-200mlγδt细胞培养基；
第12天，γδt细胞的扩增培养结束；
(5)离心收集γδt细胞
离心收集γδt细胞，同时使用流式抗体鉴定γδt细胞表型。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)和步骤(3)中于36-38℃、4％-6％co2培养箱中培养。
作为本发明的优选方式之一，所述培养箱的具体培养条件为37℃，5％co2。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)和步骤(2)中无血清培养基具体为kbm581无血清培养基。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中添加有anti-cd3antibody与anti-cd28antibody的无血清培养基的配方为：50-200u/mlil-2、2ug/mlanti-cd3antibody、4ug/mlanti-cd28antibody、100-200mmβ-巯基乙醇、2-5mm丙酮酸钠、5-15mg/l转铁蛋白、5-15mg/l胰岛素、1mm维生素c、5mm谷氨酰胺。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中不添加抗体的无血清培养基的配方为：50-200u/mlil-2、100-200mmβ-巯基乙醇、2-5mm丙酮酸钠、5-15mg/l转铁蛋白、5-15mg/l胰岛素、1mm维生素c、5mm谷氨酰胺。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中γδt细胞阳性筛选试剂盒具体为美天旎γδt细胞阳性筛选试剂盒。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中于500gx10min离心条件下离心收集γδt细胞。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中使用fitc-anti-tcrγδ流式抗体鉴定γδt细胞表型。
作为本发明的优选方式之一，所述细胞培养瓶具体为t175细胞培养瓶。
作为本发明的优选方式之一，所述γδt细胞培养基的配制方法为：将其他组分加入基础培养基rpmi-1640粉末中，加入超纯水，使各组分充分溶解，调ph值至7.2-7.4，用超纯水定容后，0.22微米过滤除菌，0-4℃保存。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)提供了一种专门针对γδt细胞而设的细胞培养方法，扩增γδt细胞12天，其扩增倍数达到60倍，表型鉴定结果为γδt阳性细胞比例达到95％以上，并且，培养出的γδt细胞对k562肿瘤细胞的杀伤活性在25:1时达到90％以上；
(2)外周血单个核细胞的制备、t细胞的扩增培养过程中均采用“无血清培养基”，克服了目前采用含血清培养基培养t细胞带来的最终质量缺陷(由于血清成分非常复杂、血清批次间差异大，并且可能含有病原性物质，对细胞制品质量造成严重影响)。
附图说明
图1是实施例1-3中γδt细胞的培养方法的流程图；
图2是实施例4中t细胞培养过程中的扩增曲线图；
图3是实施例4中γδt细胞培养过程中的扩增曲线图；
图4是实施例4中γδt细胞的表型鉴定结果图；
图5是实施例4中不同比例浓度下γδt细胞对k562肿瘤细胞的杀伤活性表示曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例的一种γδt细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的制备
从150ml外周血中分离获得单个核细胞，用添加有anti-cd3antibody与anti-cd28antibody的kbm581无血清培养基(50u/mlil-2、2ug/mlanti-cd3antibody、4ug/mlanti-cd28antibody、100mmβ-巯基乙醇、2mm丙酮酸钠、5mg/l转铁蛋白、5mg/l胰岛素、1mm维生素c、5mm谷氨酰胺)充分重悬后，调整单个核细胞密度为2x106细胞/ml，再将装有上述培养液的t175细胞培养瓶于36℃、4％co2培养箱中培养3天；
(2)t细胞的扩增培养
第4天，向t175细胞培养瓶中补加50ml不添加抗体的kbm581无血清培养基(50u/mlil-2、100mmβ-巯基乙醇、2mm丙酮酸钠、5mg/l转铁蛋白、5mg/l胰岛素、1mm维生素c、5mm谷氨酰胺)；
第8天，向t175细胞培养瓶中补加100ml不添加抗体的kbm581无血清培养基(50u/mlil-2、100mmβ-巯基乙醇、2mm丙酮酸钠、5mg/l转铁蛋白、5mg/l胰岛素、1mm维生素c、5mm谷氨酰胺)；
第12天，t细胞扩增培养结束；
(3)γδt细胞的筛选
使用美天旎γδt细胞阳性筛选试剂盒对上述t细胞进行筛选，将分选后的γδt细胞转移至新的t175细胞培养瓶中，并补加γδt细胞培养基，再于36℃、4％co2培养箱中培养3天；其中，γδt细胞培养基具体为添加有5mg/l转铁蛋白、5％人ab血清或自体血浆或胎牛血清fbs、100mmβ-巯基乙醇、5mg/l胰岛素、50u/mlil-2、50u/mlil-4、2mm丙酮酸钠和100um异戊烯焦磷酸的rpmi-1640培养基，配制方法为：将其他组分加入基础培养基rpmi-1640粉末中，加入超纯水，使各组分充分溶解，调ph值至7.2，用超纯水定容后，0.22微米过滤除菌，0℃保存；
(4)γδt细胞的扩增培养
第4天，向t175细胞培养瓶中补加50mlγδt细胞培养基；
第8天，向t175细胞培养瓶中补加100mlγδt细胞培养基；
第12天，γδt细胞的扩增培养结束；
(5)离心收集γδt细胞
500gx10min离心条件下收集γδt细胞，同时使用fitc-anti-tcrγδ流式抗体鉴定γδt细胞表型。
实施例2
如图1所示，本实施例的一种γδt细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的制备
从250ml外周血中分离获得单个核细胞，用添加有anti-cd3antibody与anti-cd28antibody的kbm581无血清培养基(200u/mlil-2、2ug/mlanti-cd3antibody、4ug/mlanti-cd28antibody、200mmβ-巯基乙醇、5mm丙酮酸钠、15mg/l转铁蛋白、15mg/l胰岛素、1mm维生素c、5mm谷氨酰胺)充分重悬后，调整单个核细胞密度为3x106细胞/ml，再将装有上述培养液的t175细胞培养瓶于38℃、6％co2培养箱中培养3天；
(2)t细胞的扩增培养
第4天，向t175细胞培养瓶中补加100ml不添加抗体的kbm581无血清培养基(200u/mlil-2、200mmβ-巯基乙醇、5mm丙酮酸钠、15mg/l转铁蛋白、15mg/l胰岛素、1mm维生素c、5mm谷氨酰胺)；
第8天，向t175细胞培养瓶中补加200ml不添加抗体的kbm581无血清培养基(200u/mlil-2、200mmβ-巯基乙醇、5mm丙酮酸钠、15mg/l转铁蛋白、15mg/l胰岛素、1mm维生素c、5mm谷氨酰胺)；
第12天，t细胞扩增培养结束；
(3)γδt细胞的筛选
使用美天旎γδt细胞阳性筛选试剂盒对上述t细胞进行筛选，将分选后的γδt细胞转移至新的t175细胞培养瓶中，并补加γδt细胞培养基，再于38℃、6％co2培养箱中培养3天；其中，γδt细胞培养基具体为添加有15mg/l转铁蛋白、15％人ab血清或自体血浆或胎牛血清fbs、200mmβ-巯基乙醇、15mg/l胰岛素、200u/mlil-2、200u/mlil-4、5mm丙酮酸钠和200um异戊烯焦磷酸的rpmi-1640培养基，配制方法为：将其他组分加入基础培养基rpmi-1640粉末中，加入超纯水，使各组分充分溶解，调ph值至7.4，用超纯水定容后，0.22微米过滤除菌，4℃保存；
(4)γδt细胞的扩增培养
第4天，向t175细胞培养瓶中补加100mlγδt细胞培养基；
第8天，向t175细胞培养瓶中补加200mlγδt细胞培养基；
第12天，γδt细胞的扩增培养结束；
(5)离心收集γδt细胞
500gx10min离心条件下收集γδt细胞，同时使用fitc-anti-tcrγδ流式抗体鉴定γδt细胞表型。
实施例3
如图1所示，本实施例的一种γδt细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的制备
从200ml外周血中分离获得单个核细胞，用添加有anti-cd3antibody与anti-cd28antibody的kbm581无血清培养基(120u/mlil-2、2ug/mlanti-cd3antibody、4ug/mlanti-cd28antibody、150mmβ-巯基乙醇、3mm丙酮酸钠、10mg/l转铁蛋白、10mg/l胰岛素、1mm维生素c、5mm谷氨酰胺)充分重悬后，调整单个核细胞密度为2.5x106细胞/ml，再将装有上述培养液的t175细胞培养瓶于37℃、5％co2培养箱中培养3天；
(2)t细胞的扩增培养
第4天，向t175细胞培养瓶中补加75ml不添加抗体的kbm581无血清培养基(120u/mlil-2、150mmβ-巯基乙醇、3mm丙酮酸钠、10mg/l转铁蛋白、10mg/l胰岛素、1mm维生素c、5mm谷氨酰胺)；
第8天，向t175细胞培养瓶中补加150ml不添加抗体的kbm581无血清培养基(120u/mlil-2、150mmβ-巯基乙醇、3mm丙酮酸钠、10mg/l转铁蛋白、10mg/l胰岛素、1mm维生素c、5mm谷氨酰胺)；
第12天，t细胞扩增培养结束；
(3)γδt细胞的筛选
使用美天旎γδt细胞阳性筛选试剂盒对上述t细胞进行筛选，将分选后的γδt细胞转移至新的t175细胞培养瓶中，并补加γδt细胞培养基，再于37℃、5％co2培养箱中培养3天；其中，γδt细胞培养基具体为添加有10mg/l转铁蛋白、10％人ab血清或自体血浆或胎牛血清fbs、150mmβ-巯基乙醇、10mg/l胰岛素、120u/mlil-2、120u/mlil-4、3mm丙酮酸钠和150um异戊烯焦磷酸的rpmi-1640培养基，配制方法为：将其他组分加入基础培养基rpmi-1640粉末中，加入超纯水，使各组分充分溶解，调ph值至7.3，用超纯水定容后，0.22微米过滤除菌，2℃保存；
(4)γδt细胞的扩增培养
第4天，向t175细胞培养瓶中补加75mlγδt细胞培养基；
第8天，向t175细胞培养瓶中补加150mlγδt细胞培养基；
第12天，γδt细胞的扩增培养结束；
(5)离心收集γδt细胞
500gx10min离心条件下收集γδt细胞，同时使用fitc-anti-tcrγδ流式抗体鉴定γδt细胞表型。
实施例4
本实施例用以说明上述实施例制备过程中t细胞、γδt细胞的扩增情况，γδt细胞的表型鉴定情况，以及γδt细胞对k562肿瘤细胞的杀伤活性。
参见图2，图2为t细胞培养过程中的扩增曲线图，由图可知，扩增t细胞12天，其扩增倍数达到17倍；
参见图3，图3为γδt细胞培养过程中的扩增曲线图，由图可知，扩增γδt细胞12天，其扩增倍数达到60倍；
参见图4，图4为使用fitc-anti-tcrγδ流式抗体鉴定γδt细胞表型的表型鉴定结果图，由图可知，γδt阳性细胞比例达到95％以上；
参见图5，图5为不同比例浓度下γδt细胞对k562肿瘤细胞的杀伤活性表示曲线图，由图可知，培养出的γδt细胞对k562肿瘤细胞具有极高的杀伤活性，且在25:1(γδt细胞：k562肿瘤细胞)时达到90％以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。