本发明属于遗传工程
技术领域：
，具体涉及一种合成基因及其构建烟草多基因定点突变载体的方法与应用。
背景技术：
：多基因突变体在植物基础功能研究及作物育种中有着重要意义。传统获得多突变体的方法是通过单突变体间的相互杂交、子代分离来完成。但是此方法存在以下问题：1、基因突变的位点随机性，并不能都能得到所需基因位点的单突变体；2、通过杂交重组得到多突变体，若几个基因间存在紧密连锁，则几乎无法获得多突变体；3、整个过程耗时耗力。crispr-cas9是编辑基因组简单、高效且应用广泛的工具。该系统主要利用内切酶cas9及定位的向导grna(sgrna)分子，对基因组中特定的dna序列进行精细改造，在特定的位置敲除或者插入基因。在植物中，获得稳定的多突变体植株需要用转基因技术将cas9及多个grna功能元件导入来发挥功能。因此，如何将多个grna元件（包含sgrna）及cas9序列整合在一个双元载体上，是植物中实现多基因同时敲除的关键。这里有个难点，如何保证串联在载体上的多个grna元件在体内表达的时候，能够被体内的系统进行正确的分解成单个的grna在生物体内，dna分子上的trna基因经过转录生成trna前体，然后被精确加工成成熟的trna。所以我们利用这个体系，在体外设计trna+grna+trna的合成基因，这个基因一旦转化到植物体内，可以被体内的rna内切酶识别，将合成基因的前体切成trna和grna。利用这个体系可以保证多个grna在大量表达的同时也能够正确的被分割。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种合成基因；第二目的在于提供所述的合成基因构建烟草多基因定点突变载体的方法；第三目的在于提供所述的合成基因的应用。本发明的第一目的是这样实现的，所述合成基因的序列是以trna+sgrna+grna的核苷酸序列顺序合成的一个或多个基因重复序列。本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：a、通过合成基因构建crispr/cas9载体：根据基因序列设计多个靶位点sgrna1-n序列，合成bsai+（trna+sgrna1-（n-1）+grna）+trna+sgrnan+bsai基因序列；b、合成后的基因序列连接进无bsai酶切位点的puc57-kan大肠杆菌克隆载体上；c、pcr扩增合成基因片段：根据合成基因插入puc57-kan大肠杆菌克隆载体位置，利用通用引物m13和高保真酶以puc57-kan质粒为模板扩增合成基因片段；d、bsai酶切电泳切胶回收合成基因；e、bsai酶切电泳切胶回收pore-crispr/cas9植物表达载体；f、通过t4连接酶将合成基因与pore-crispr/cas9植物表达载体连接起来。本发明的第三目的是这样实现的，所述的合成基因在构建烟草多基因定点突变载体并转化烟草植株同时获得多个目的基因定点突变中的应用。本发明采用pore-crispr/cas9载体，利用化学合成一段靶位点基因序列，省却了大量的载体构建中间过程的同时还能少合成一个grna序列；不仅如此，为方便载体构建，在合成基因两端添加了bsai的酶切位点与载体连接接头；最终在构建载体的时候只需通过1次pcr、酶切、连接过程就能够简便的构建出所需多基因突变的植物表达载体；在保证突变效率的同时，大量简化了中间步骤，加快了实验进程。该构建载体的方法具有良好的应用推广前景。附图说明图1为ntab1和ntab2基因突变靶序列；图2为puc57-kan和pore-crispr/cas9酶切图；图3为ntab1在sgrna1后的突变；图4为ntab2在sgrna2后的突变；图5为ntab3、4、5基因突变靶序列；图6为pcr产物酶切图；图7为ntab3在sgrna1后的突变；图8为ntab4在sgrna2后的突变；图9为ntab5在sgrna3后的突变；图10为ntab6、7基因突变靶序列；图11为pcr产物酶切图；图12为ntab6在sgrna1后的突变；图13为ntab7在sgrna2后的突变；图14为pore-crispr/cas9表达载体示意图；图15为puc57-kan质粒结构图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述合成基因的序列是以trna+sgrna+grna的核苷酸序列顺序合成的一个或多个基因重复序列。所述合成基因的序列5’端与3’端需要加上限制性内切酶bsai的酶切位点：5’…ggtctcn▼…3’3’…ccagagn(n)4▲…5’。所述合成基因的序列5’端与3’端在限制性内切酶bsai的酶切位点后需要加上与pore-crispr/cas9载体连接的接头（5’gatt和3’gtttt），顺序如下：5’-bsai(ggtctcn▼)+gatt-3’+（trna+sgrna1-（n-1）+grna）+trna+sgrnan+5’-▼gtttt+bsai(gagacc)-3’。所述的合成基因连接进无限制性内切酶bsai酶切位点的克隆载体上。本发明所述的合成基因构建烟草多基因定点突变载体的方法，包括以下步骤：a、通过合成基因构建crispr/cas9载体：根据基因序列设计多个靶位点sgrna1-n序列，合成bsai+（trna+sgrna1-（n-1）+grna）+trna+sgrnan+bsai基因序列；b、合成后的基因序列连接进无bsai酶切位点的puc57-kan大肠杆菌克隆载体上；c、pcr扩增合成基因片段：根据合成基因插入puc57-kan大肠杆菌克隆载体位置，利用通用引物m13和高保真酶以puc57-kan质粒为模板扩增合成基因片段；d、bsai酶切电泳切胶回收合成基因；e、bsai酶切电泳切胶回收pore-crispr/cas9植物表达载体；f、通过t4连接酶将合成基因与pore-crispr/cas9植物表达载体连接起来。pcr扩增体系为50µl，其中包含10.0µl的5xbuffer（10mmtris-hcl，50mmkcl，1.5mmmgcl2，ph8.3@25℃。），4µl的2.5mmdntps（takarabiotechnologyco.ltd.,dalian,china），2µl浓度10µm的m13上下游引物，0.5µl的2000u/ml高保真dna聚合酶（neb），20-50ng模板puc57-kan质粒dna，最后用ddh2o补齐50µl。pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min，30个循环（95℃变性30ｓ，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5min，4℃保存。本发明所述的合成基因构建烟草多基因定点突变载体的方法，具体操作如下：1、多基因靶序列人工合成：按照bsai+gatt+（trna+sgrna1-（n-1）+grna）+trna+sgrnan+gtttt+bsai顺序设计好的基因序列交与公司进行化学合成，要求合成好的基因序列连接进puc57-kan大肠杆菌质粒。2、多基因靶序列pcr扩增：pcr扩增体系为50µl，其中包含10.0µl的5xbuffer（10mmtris-hcl，50mmkcl，1.5mmmgcl2，ph8.3@25℃。），4µl的2.5mmdntps（takarabiotechnologyco.ltd.,dalian,china），2µl浓度10µm的m13上下游引物，0.5µl的2000u/ml高保真dna聚合酶（neb），20-50ng模板puc57-kan质粒dna，最后用ddh2o补齐50µl。反应条件为：95℃预变性5min，30个循环（95℃变性30ｓ，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5min，4℃保存。3、摇菌：3.1、配制lb液体培养基（称取12.5glbbroth于1l试剂瓶，加入500ml蒸馏水，121℃高温高压灭菌20min）。3.2、取3mllb液体培养基于15ml离心管中，加入100mg/ml卡那霉素（kanamycin）溶液3ul，加入含有合成多敲除基因的靶位点序列puc57-kan大肠杆菌菌液2-3ml。37℃、220rpm培养过夜。4、质粒提取：（qiagenplasmidmidikit）4.1、根据提取质粒量的需求，准备相应数量的离心管置于冰上备用。4.2、摇过夜培养的菌从培养管中倒入预冷的离心管中，13200rpm离心30-60s收集菌体，弃上清。4.3、在含有菌体的离心管中加入250μl的solutionⅰ，盖紧管盖，置蜗旋振荡器上剧烈振荡至菌体全部悬浮；快速加入250μlsolutionⅱ，立即上下轻柔翻转混匀4-8次，静置5min；再快速加入350μlsolutionⅲ，立即上下轻柔翻转混匀5-6次，放冰上静置5min；13200rpm离心10min。4.4、取质粒提取试剂盒离心柱、编号，将离心管中的上清移入离心柱中，13200rpm离心1min，弃废液。4.5、在离心柱中加入500μlwashingbufferⅰ，13200rpm离心1min，弃废液；加入700µlwashingbufferⅱ，13200rpm离心1min，弃废液；空管13200rpm离心1min。4.6、将离心柱套进新的离心管里，取50μl去离子水滴入离心柱中心，静置1min，12000rpm离心1min；然后将离心管中液体重新吸取出来滴入离心柱，静置1min，12000rpm再次离心1min；弃离心柱，留下含有液体离心管，标明日期与样品名称；-20℃冰箱储存备用。5、质粒与pcr产物酶切：酶切体系20µl质粒或多基因靶序列pcr产物10µlbsai酶1µl10×buffer2µl去离子水7µl37℃酶切4小时6、酶切回收——得到目标片段（多基因敲除靶位点序列）利用qiaquickgelextractionkit回收试剂盒回收电泳后dna片段。6.1、制备琼脂糖凝胶，将水浴锅或金属浴温度设定为50℃。6.2、加入20μl酶切产物至琼脂糖凝胶中的上样孔，220v电泳25min，eb染色10min。6.3、在紫外切胶仪中切取含有目标条带的胶块（切胶的位置要尽量贴近目标条带，每切一个胶条要流水冲洗刀片，避免交叉污染），切好的胶块装入离心管中，称重后记下胶块重量。6.4、换算要加入的qgbuffer的量，即：qgbufferμl＝胶重（g）ｘ3ｘ1000μl。6.5、向离心管中加入qgbuffer，置50℃水浴10min，每隔3min翻转2-3次。6.6、再向离心管中加入相应体积异丙醇，即：异丙醇μl＝胶重（g）ｘ1000μl。6.7、取qiagen胶回收试剂盒，将上一步骤中溶液加入离心柱，13200rmp离心1min，弃废液。6.8、向步骤4.7中的离心柱中加入500μl的qgbuffer，13200rmp离心1min，离心后弃废液，加入750μlpebuffer到离心柱上，13200rmp离心1min，离心后弃废液，空管再离心1min。6.9、将离心柱套入新离心管上，加50-100μl去离子水（注意水要滴在离心柱中心，但枪尖不能碰触离心柱表面。），静置1min，13200rmp离心1min；吸取离心管中的液体复滴于离心柱中，静置1min，取新离心管套在离心柱上，13200rmp离心1min；离心后弃离心柱，（可在真空离心机上将体积浓缩为20μl）盖紧离心管，标明编号与日期，-20℃冰箱储存备用。7、pore-crispr/cas9植物表达载体酶切含有pore-crispr/cas9植物表达载体的大肠杆菌按照步骤3和4后，获得pore-crispr/cas9质粒，获得的空载体质粒按照下列酶切体系进行处理：酶切体系20µl质粒10µlbsai酶1µl10×buffer2µl去离子水7µl37℃酶切4小时。酶切后的载体按照步骤4的流程回收。8、多基因敲除pore-crispr/cas9植物表达载体连接体系10µl空载体片段2µl靶位点片段1µlt4连接酶1µl10×buffer1µl去离子水5µl25℃连接1小时。9、大肠杆菌转化9.1、取大肠杆菌dh5α感受态细胞于冰上解冻，解冻后取40µl于离心管，加入10µl连接产物，轻弹混匀，冰浴30min。9.2、离心管放入42℃水浴锅热激30ｓ，然后冰浴2min。9.3、吸取500µlsoc培养基（socmedium）加入到离心管中，37℃、220rpm摇菌1h。9.4、摇好的菌液1200rpm离心1min，弃200µl上清液，剩余菌液重悬后涂板（卡那霉素抗性，称取20glbbrothagar于试剂瓶，加入500ml去离子水，121℃高温高压灭菌20min。灭菌好后待冷却到50℃左右，加入kana母液各500µl，混匀，倒入多个培养皿平板后待用）。9.5把涂好的板放入37℃温箱培养过夜。10、阳性菌落筛选pcr体系：体系10µl引物jc-f0.3µl反向引物sgrna0.3µlmix5µl去离子水4.4µl选用pore-crispr/cas9载体上距离bsai酶切位点上游的一段序列作为上游引物：5'-ttaggtttacccgccaata-3'，与sgrnan基因靶位点引物dna的反向引物配合pcr检测阳性菌落。pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送测序验证。11、pore-crispr/cas9表达载体的农杆菌转化及烟草的遗传转化11.1、挑取测序正确的菌落，进行小摇(5ml)扩繁培养。提取质粒后转化农杆菌lba4404。11.2、菌株在含卡那霉素抗性的lb培养基平板上进行筛选培养，按照步骤8.中的方法筛选阳性农杆菌斑进行测序。11.3、挑取测序正确的农杆菌斑进行大摇(500ml)扩繁培养，离心收集菌体，用ms液体培养液重悬菌体，测量菌液的od值达到0.5后，浸染烟草叶盘8-10min。11.4、侵染后的叶盘在25℃、黑暗条件共培养2天，被侵染的烟草叶盘转移至含有naa、6-ba和卡那霉素(50mg/l)以及头孢噻肟钠(500mg/l)的ms固体培养基中进行筛选，最终获得含抗性基因的阳性烟草小苗。本发明所述的合成基因的应用为所述的合成基因在构建烟草多基因定点突变载体并转化烟草植株同时获得多个目的基因定点突变中的应用。实施例1针对ntab1和ntab2基因设计了2条sgrna序列，sgrna1：agcactaggagggaaaagaa；sgrna2：gggatctcacagacaatgat。然后按照图1所示合成突变这2个基因的靶位点基因序列。通过提取扩繁后puc57-kan大肠杆菌质粒（质粒中含多基因敲除靶位点序列），如图2所示，经bsai酶切后，白色箭头标记的dna条带显示的是合成基因的条带。切胶回收合成基因后，用t4连接酶将bsai酶切后的pore-crispr/cas9（图2黑色箭头标记的位置）植物表达载体连接起来，连接产物转化大肠杆菌，通过筛选测序验证后，获得敲除多基因crispr/cas9载体。构建好的载体转化烟草，通过测序检测ntab1和ntab2基因（如图3、4）在靶位点处出现双峰。说明突变这2个基因获得成功。实施例2针对ntab3、4、5基因设计了2条sgrna序列，sgrna1：agtgtttggaaaaccctagg；sgrna2：tggagtgtttggaaaaccct：sgrna3：gcacttgaaaccctagccct。然后按照图5所示合成突变这2个基因的靶位点基因序列。以m13为引物，以含有合成基因的puc57-kan质粒为模板在高保真dna聚合酶的作用下pcr扩增合成基因片段（图6左边箭头）。扩增的基因片段利用bsai酶切后，经电泳（图6右边箭头）、切胶后回收即为带接头的合成基因序列。然后将pore-crispr/cas9载体同样进行bsai酶切（如图2黑色箭头），经过电泳、切胶回收后得到线性化的粘性末端。利用t4连接酶将合成基因序列和线性化的载体连接起来就构成了敲除这2个基因的敲除载体。载体转化农杆菌后，再转化烟草。通过测序检测这3个基因在靶位点处出现双峰（如图7、8、9）。说明突变这2个基因获得成功。实施例3针对ntab6、7基因设计了2条sgrna序列，sgrna1：aacattaggaggaaaacgca；sgrna2：gacattaggaggaaaacgca。然后按照图10所示合成突变这2个基因的靶位点基因序列。以m13为引物，以含有合成基因的puc57-kan质粒为模板在高保真dna聚合酶的作用下pcr扩增合成基因片段（图11左边箭头）。扩增的基因片段利用bsai酶切后，经电泳、切胶后回收即为带接头的合成基因序列（图11右边箭头）。然后将pore-crispr/cas9载体同样进行bsai酶切（如图2.黑色箭头），经过电泳、切胶回收后得到线性化的粘性末端。利用t4连接酶将合成基因序列和线性化的载体连接起来就构成了敲除这2个基因的敲除载体。载体转化农杆菌后，再转化烟草。通过测序检测这2个基因在靶位点处出现双峰（图12、13）。说明突变这2个基因获得成功。sequencelisting<110>云南省烟草农业科学研究院<120>一种合成基因及其构建烟草多基因定点突变载体的方法与应用<130>2018<160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>1434<212>dna<213>ntab1和ntab2基因突变靶序列<400>1atggacagcgttccatattacaagatccctcgcatgtccaagcttcgtaagcggccccct60gcccaagacgtgagtgaggagtatatagccaagtaccagttagccactagtaaaatgagg120gaattagacaaagacccatttgatcctcttggcttcaagcaacaagctaatatccattgt180gcttattgcaacgatgcttacacaatgggtgaccaaaagttacaagttcaccaatcgtgg240cttttcttcccgtttcatagatggtacttgtacttctacgagagaatcttgggctccctc300atcgatgatccaacttttgctctgccatattggaactgggaccatccaagcggcatgcgt360ttgcctgctatgttcgatgtcgaaggttcttccctctacgatgcaagacgtaatccacat420gtccgtaatggaaccataatcgatcttggttttttcggtgatgaagtcaaaactaatgaa480atacagatgataactaacaacttaattctaatgtatcgtcaaatgataactaatgctcca540tgcccgctgttgttcttcggagagccttacagattcggatctaaacccaatccggggcag600ggaaccattgaaaacattcctcatactccggttcacatttggactggtactgtgcggtgt660acggatttgggtaattgtgtgccatcatacggtgaggatatgggtaatttctactcagct720ggtttagacccagttttttacagccaccacgccaatgtggaccgcatgtggaatgaatgg780aaagcactaggagggaaaagaagggatctcacagacaatgattggttaaactcggagttc840tttttctacgatgaaaaccgcgacccatggcgtgtgaaagtccgagactgtttggacagc900aagaagatggggtatgattacgaaccgaaagccacaccatggcgtaactttaagccaggg960aaaaagaccacaccgggcaaggtgaatctacgttcagttaagccagccagcaaggtattc1020ccactctcaaatctggacagagcaatttgctttagcatagagaggccagctacatcaagg1080agtcagcaggagaaagatgaatttgaggaggtgctaacattcaagaatttaaagtatgat1140gatagcaagtatataaagtttgatgtgttcgtcaatgcagacaagactgtgaatgcagat1200gacattgacaagaaagaatatgcagggagctataccagcttgccacatgttcatggacct1260aatagtggcaatcatgcggttgaagtacaagaattcaagctagccatcactgaactgcta1320gaggactgtggtttggaagatgaagacattattgcggtaactgtggttccaaagacgggg1380ggcgaagtggtcagcatcaacagtgtgttgattgaacttaaggattgttattaa1434<210>2<211>1788<212>dna<213>ntab1在sgrna1后的突变<400>2atggcttcttcttctactctacctttatgcaccagcaaaactcccttttcttcctccgcc60gccaaatatttatttgcaaaaccctctcagcttttcctcaatggaaaacgtaaccaaagt120ttcaaggtttcatgcacgggcgagcatgatggaaaccttgacgcaattaaagaaggagtt180gttgaccgaaggattgtccttttgggtttaggagggctgtatggcgcagctaatcttgtg240ccattagcctctgctgctcccgtaccaccccccaatctaaactcatgtggaacggccacg300ataacggatggtccagctgtaccatatagttgttgcccccctaaaccggatgatatggac360agcgttccatattacaagatccctcgcatgtccaagcttcgtaagcggcccgctgcccaa420aacgtgactgaggagtatatagccaagtaccagttagccactagtaaaatgaaggaatta480gacaaagaccaacttgatcctcttggcttcaagcaacaagctaatatccattgtgcttat540tgcaacgatgcttacacaatgggtgacaaaaagttgcaagttcacgaatcgtggcttttc600ttcccatttcatagatggtacttgtatttttacgagagaatcgtaggctccctcatcgat660gatccaacttttgctctgccatattggaactgggacaatccaagcggcatgcgtttgcct720tatatgttcgatgtcgaaggttcttccttgtacgatgcaagacgtaatccacatgtccgt780aatggaaccataatcgatcttggttttttcggtgatgaagtcaaaactaatgaactacag840atgataactaacaacttaattctaatgtatcgtcaaatgataactaacgctccatgcccg900ctgttgttcttcggagagccttatagattcggatctaatcccgaacctgggatgggaacc960attgaaaacatccctcacaatccggtccacatttggactggtactgtgcgggggacggat1020ttgggtaatggtgcgaaatcatacggtgaggatatgggtaatttctactcaactgcttta1080gacccagtttttttctgccaccacgccaatgtggaccgcttgtggaatgaatggaaagca1140ctaggagggaaaagaagggatctaagagacaaagattggttaaactcggagttctttttc1200tacgatgaaaaccgcgacccatggcgt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