本发明涉及牡蛎的深加工领域，尤其是涉及牡蛎多糖的制备方法。
技术背景
多糖为一类天然产物，广泛存在于植物、微生物、动物等有机物中。多糖在临床上、食品工业、发酵工业以及石油工业有着广泛的应用。同时随着海洋动物资源的进一步开发，海洋动物多糖由于其独特的结构和多种生物活性越来越受到人们的关注。牡蛎（ostreagigastnunb）及其近缘动物的全体，是海产贝壳。在亚热带、热带沿海都适宜蚝的养殖，我国分布很广，北起鸭绿江，南至海南岛，沿海皆可产蚝。蚝乃软体有壳，依附寄生的动物，咸淡水交界所产尤为肥美。牡蛎是软体动物，有两个贝壳，一个小而平，另一个大而隆起，壳的表面凹凸不平。肉供食用，又能提制蚝油。肉，壳，油都可入药，也叫蚝或海蛎子。牡蛎俗称海蛎子，是世界第一大养殖贝类，也是我国四大养殖贝类。牡蛎中含有海洋生物特有的多种活性物质，其中含有的多糖，具有调节机体免疫、抑制肿瘤、延缓衰老、降血糖、血脂、等生物活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供牡蛎多糖的制备方法，本制备方法简单易行，可以大大降低蛋白质变性胶状物包裹住牡蛎多糖的几率，从而可以大大降低牡蛎多糖被分离出去的量，提高牡蛎多糖的得率与含量，降低产物中蛋白质的含量，提高多糖纯度。
本发明针对
背景技术：
中提到的问题，采取的技术方案为：牡蛎多糖的制备方法，包括：水提、热水提、碱提、酶解、脱蛋白，具体包括以下步骤：
水提：将牡蛎鲜肉绞碎、匀浆，用丙酮脱脂和低温干燥得脱脂粉，取脱脂粉加20-25倍质量体积的常温蒸馏水，室温搅拌3-5小时，离心，将残渣按上述方法重复提取，合并提取液，浓缩；加入4-5倍质量的95-98%乙醇，1-4℃沉淀过夜，次日离心，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮脱水，45-48℃下减压干燥即得牡蛎水提粗多糖；通过脱脂并水提后，可以去除水溶性蛋白质，并且为进一步的脱除蛋白提供有利条件；
热水提：将上述室温提取后的残渣加入15-18倍质量体积蒸馏水，60-66℃温度下磁力搅拌2-3小时，离心，浓缩，加入4-5倍质量体积的95-98%乙醇，1-4℃沉淀过夜，次日离心，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮脱水，45-48℃下减压干燥即得牡蛎热水提粗多糖；通过热水提纯，可以提高水溶性蛋白质的溶解度，进一步分离富集出粗多糖中的蛋白质；
碱提：将上述热水提取后的残渣加入6-8倍体积2.5-3.0%的氢氧化钠溶液，60-65℃磁力搅拌2-3小时，用稀盐酸中和至中性，离心，浓缩，以3.5kda透析袋透析48-72小时，取袋内液浓缩后加入4-5倍质量体积的95-98%乙醇，1-4℃沉淀过夜，次日离心，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮脱水，45-48℃下减压干燥即得牡蛎碱提粗多糖；通过碱提，可以更进一步地将多余的蛋白质分离出去，为进一步的酶解做好准备；
酶解：将牡蛎粗多糖合并，用纯水配制成质量分数为8-10%的溶液，调节ph至8.2-8.4，加入胰蛋白酶终质量分数为0.3-0.5%，在52-55℃温度下保温反应4-5小时；反应完毕后用稀盐酸调中性后在95-98℃灭酶12-18分钟，冷却至室温，调节ph至2.3-2.4，加入胃蛋白酶至终质量分数为0.5-0.7%，在37-40℃温度下保温反应3-4小时，反应完毕后经稀氢氧化钠溶液中和，低温浓缩至10-15%即得酶解液；先后经碱性蛋白酶与酸性蛋白酶酶解，将牡蛎粗多糖中剩余的蛋白质水解为小蛋白和多肽，并经后续脱蛋白除去，可以大大提高成品中的牡蛎多糖的含量与纯度；牡蛎多糖能够对细菌细胞膜产生影响，改变细胞膜流动性和通透性，破坏细胞细胞膜的超分子结构而造成细胞内成分流失，也可以作用于细菌细胞壁影响细菌新陈代谢，从而起到抑菌效果；
脱蛋白：将氯仿、正丁醇、乙酸按照体积比45-48:10-15:1的比例混合均匀，混合溶液中还含有1.5-1.8‰的酒石酸二甲酯，酒石酸二甲酯中l-酒石酸二甲酯与d-酒石酸二甲酯的比例为15.6-15.7:1；在不断搅拌下，按照体积比1:7-8的比例将酶解液倒入混合溶液中，密封后用磁力搅拌器搅拌45-60分钟，倒入分液漏斗中，静止分层后收集上层溶液，并离心分离出少量变性蛋白质，按上述步骤重复操作4-5次，使提取液中的蛋白质脱除完全，合并上清液经低温浓缩即得牡蛎多糖；氯仿、正丁醇的混合溶液可以将游离蛋白与多肽转变为不溶性物质，经离心去除，可以达到去除牡蛎多糖中蛋白质的目的，乙酸和适当比例的l-酒石酸二甲酯与d-酒石酸二甲酯可以作用于蛋白质变性胶状物，降低蛋白质变性胶状物包裹住牡蛎多糖的几率，从而可以大大降低牡蛎多糖被分离出去的量，提高牡蛎多糖的得率与含量，降低产物中蛋白质的含量，提高多糖纯度。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1）乙酸和适当比例的l-酒石酸二甲酯与d-酒石酸二甲酯可以作用于蛋白质变性胶状物，降低蛋白质变性胶状物包裹住牡蛎多糖的几率，从而可以大大降低牡蛎多糖被分离出去的量，提高牡蛎多糖的得率与含量，降低产物中蛋白质的含量，提高多糖纯度；
2）先后经碱性蛋白酶与酸性蛋白酶酶解，将牡蛎粗多糖中剩余的蛋白质水解为小蛋白和多肽，并经后续脱蛋白除去，可以大大提高成品中的牡蛎多糖的含量与纯度；牡蛎多糖能够对细菌细胞膜产生影响，改变细胞膜流动性和通透性，破坏细胞细胞膜的超分子结构而造成细胞内成分流失，也可以作用于细菌细胞壁影响细菌新陈代谢，起到抑菌效果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
牡蛎多糖的制备方法，包括以下步骤：
1）将牡蛎鲜肉绞碎、匀浆，用丙酮脱脂和低温干燥得脱脂粉，取脱脂粉加20倍质量体积的常温蒸馏水，室温搅拌3小时，离心，将残渣按上述方法重复提取，合并提取液，浓缩；加入4倍质量的95%乙醇，1℃沉淀过夜，次日离心，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮脱水，45℃下减压干燥即得牡蛎水提粗多糖；2）将上述室温提取后的残渣加入15倍质量体积蒸馏水，60℃温度下磁力搅拌2小时，离心，浓缩，加入4倍质量体积的95%乙醇，1℃沉淀过夜，次日离心，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮脱水，45℃下减压干燥即得牡蛎热水提粗多糖；
3）将上述热水提取后的残渣加入6倍体积2.5%的氢氧化钠溶液，60℃磁力搅拌2小时，用稀盐酸中和至中性，离心，浓缩，以3.5kda透析袋透析48小时，取袋内液浓缩后加入4倍质量体积的95%乙醇，1℃沉淀过夜，次日离心，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮脱水，45℃下减压干燥即得牡蛎碱提粗多糖；4）将牡蛎粗多糖合并，用纯水配制成质量分数为8%的溶液，调节ph至8.2，加入胰蛋白酶终质量分数为0.3%，在52℃温度下保温反应4小时；反应完毕后用稀盐酸调中性后在95℃灭酶12分钟，冷却至室温，调节ph至2.3，加入胃蛋白酶至终质量分数为0.5%，在37℃温度下保温反应3小时，反应完毕后经稀氢氧化钠溶液中和，低温浓缩至10%即得酶解液；5）将氯仿、正丁醇、乙酸按照体积比45:10:1的比例混合均匀，混合溶液中还含有1.5‰的酒石酸二甲酯，酒石酸二甲酯中l-酒石酸二甲酯与d-酒石酸二甲酯的比例为15.6:1；在不断搅拌下，按照体积比1:7的比例将酶解液倒入混合溶液中，密封后用磁力搅拌器搅拌45分钟，倒入分液漏斗中，静止分层后收集上层溶液，并离心分离出少量变性蛋白质，按上述步骤重复操作4次，使提取液中的蛋白质脱除完全，合并上清液经低温浓缩即得牡蛎多糖。
实施例2：
牡蛎多糖的制备方法，包括以下步骤：
1）水提：将牡蛎鲜肉绞碎、匀浆，用丙酮脱脂和低温干燥得脱脂粉，取脱脂粉加25倍质量体积的常温蒸馏水，室温搅拌5小时，离心，将残渣按上述方法重复提取，合并提取液，浓缩；加入5倍质量的98%乙醇，4℃沉淀过夜，次日离心，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮脱水，48℃下减压干燥即得牡蛎水提粗多糖；通过脱脂并水提后，可以去除水溶性蛋白质，并且为进一步的脱除蛋白提供有利条件；
2）热水提：将上述室温提取后的残渣加入18倍质量体积蒸馏水，66℃温度下磁力搅拌3小时，离心，浓缩，加入5倍质量体积的98%乙醇，4℃沉淀过夜，次日离心，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮脱水，48℃下减压干燥即得牡蛎热水提粗多糖；通过热水提纯，可以提高水溶性蛋白质的溶解度，进一步分离富集出粗多糖中的蛋白质；
3）碱提：将上述热水提取后的残渣加入8倍体积3.0%的氢氧化钠溶液，65℃磁力搅拌3小时，用稀盐酸中和至中性，离心，浓缩，以3.5kda透析袋透析72小时，取袋内液浓缩后加入5倍质量体积的98%乙醇，4℃沉淀过夜，次日离心，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮脱水，48℃下减压干燥即得牡蛎碱提粗多糖；通过碱提，可以更进一步地将多余的蛋白质分离出去，为进一步的酶解做好准备；
4）酶解：将牡蛎粗多糖合并，用纯水配制成质量分数为10%的溶液，调节ph至8.4，加入胰蛋白酶终质量分数为0.5%，在55℃温度下保温反应5小时；反应完毕后用稀盐酸调中性后在98℃灭酶18分钟，冷却至室温，调节ph至2.4，加入胃蛋白酶至终质量分数为0.7%，在40℃温度下保温反应4小时，反应完毕后经稀氢氧化钠溶液中和，低温浓缩至15%即得酶解液；先后经碱性蛋白酶与酸性蛋白酶酶解，将牡蛎粗多糖中剩余的蛋白质水解为小蛋白和多肽，并经后续脱蛋白除去，可以大大提高成品中的牡蛎多糖的含量与纯度；牡蛎多糖能够对细菌细胞膜产生影响，改变细胞膜流动性和通透性，破坏细胞细胞膜的超分子结构而造成细胞内成分流失，也可以作用于细菌细胞壁影响细菌新陈代谢，从而起到抑菌效果；
5）脱蛋白：将氯仿、正丁醇、乙酸按照体积比48:15:1的比例混合均匀，混合溶液中还含有1.5-1.8‰的酒石酸二甲酯，酒石酸二甲酯中l-酒石酸二甲酯与d-酒石酸二甲酯的比例为15.7:1；在不断搅拌下，按照体积比1:8的比例将酶解液倒入混合溶液中，密封后用磁力搅拌器搅拌60分钟，倒入分液漏斗中，静止分层后收集上层溶液，并离心分离出少量变性蛋白质，按上述步骤重复操作5次，使提取液中的蛋白质脱除完全，合并上清液经低温浓缩即得牡蛎多糖；氯仿、正丁醇的混合溶液可以将游离蛋白与多肽转变为不溶性物质，经离心去除，可以达到去除牡蛎多糖中蛋白质的目的，乙酸和适当比例的l-酒石酸二甲酯与d-酒石酸二甲酯可以作用于蛋白质变性胶状物，降低蛋白质变性胶状物包裹住牡蛎多糖的几率，从而可以大大降低牡蛎多糖被分离出去的量，提高牡蛎多糖的得率与含量，降低产物中蛋白质的含量，提高多糖纯度。
实施例3：
牡蛎多糖的制备方法，包括：水提、热水提、碱提、酶解、脱蛋白，具体包括以下步骤：
水提：将牡蛎鲜肉绞碎、匀浆，用丙酮脱脂和低温干燥得脱脂粉，取脱脂粉加24倍质量体积的常温蒸馏水，室温搅拌4小时，离心，将残渣按上述方法重复提取，合并提取液，浓缩；加入4倍质量的96%乙醇，2℃沉淀过夜，次日离心，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮脱水，46℃下减压干燥即得牡蛎水提粗多糖；通过脱脂并水提后，可以去除水溶性蛋白质，并且为进一步的脱除蛋白提供有利条件；
热水提：将上述室温提取后的残渣加入16倍质量体积蒸馏水，65℃温度下磁力搅拌2.5小时，离心，浓缩，加入4倍质量体积的96%乙醇，1-4℃沉淀过夜，次日离心，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮脱水，46℃下减压干燥即得牡蛎热水提粗多糖；通过热水提纯，可以提高水溶性蛋白质的溶解度，进一步分离富集出粗多糖中的蛋白质；
碱提：将上述热水提取后的残渣加入7倍体积2.8%的氢氧化钠溶液，64℃磁力搅拌2.5小时，用稀盐酸中和至中性，离心，浓缩，以3.5kda透析袋透析60小时，取袋内液浓缩后加入4倍质量体积的96%乙醇，2℃沉淀过夜，次日离心，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮脱水，46℃下减压干燥即得牡蛎碱提粗多糖；通过碱提，可以更进一步地将多余的蛋白质分离出去，为进一步的酶解做好准备；
酶解：将牡蛎粗多糖合并，用纯水配制成质量分数为9%的溶液，调节ph至8.3，加入胰蛋白酶终质量分数为0.4%，在54℃温度下保温反应4小时；反应完毕后用稀盐酸调中性后在96℃灭酶15分钟，冷却至室温，调节ph至2.3，加入胃蛋白酶至终质量分数为0.6%，在38℃温度下保温反应3.5小时，反应完毕后经稀氢氧化钠溶液中和，低温浓缩至12%即得酶解液；先后经碱性蛋白酶与酸性蛋白酶酶解，将牡蛎粗多糖中剩余的蛋白质水解为小蛋白和多肽，并经后续脱蛋白除去，可以大大提高成品中的牡蛎多糖的含量与纯度；牡蛎多糖能够对细菌细胞膜产生影响，改变细胞膜流动性和通透性，破坏细胞细胞膜的超分子结构而造成细胞内成分流失，也可以作用于细菌细胞壁影响细菌新陈代谢，从而起到抑菌效果；
脱蛋白：将氯仿、正丁醇、乙酸按照体积比45:14:1的比例混合均匀，混合溶液中还含有1.6‰的酒石酸二甲酯，酒石酸二甲酯中l-酒石酸二甲酯与d-酒石酸二甲酯的比例为15.6:1；在不断搅拌下，按照体积比1:7的比例将酶解液倒入混合溶液中，密封后用磁力搅拌器搅拌45分钟，倒入分液漏斗中，静止分层后收集上层溶液，并离心分离出少量变性蛋白质，按上述步骤重复操作4次，使提取液中的蛋白质脱除完全，合并上清液经低温浓缩即得牡蛎多糖；氯仿、正丁醇的混合溶液可以将游离蛋白与多肽转变为不溶性物质，经离心去除，可以达到去除牡蛎多糖中蛋白质的目的，乙酸和适当比例的l-酒石酸二甲酯与d-酒石酸二甲酯可以作用于蛋白质变性胶状物，降低蛋白质变性胶状物包裹住牡蛎多糖的几率，从而可以大大降低牡蛎多糖被分离出去的量，提高牡蛎多糖的得率与含量，降低产物中蛋白质的含量，提高多糖纯度。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。