本发明涉及一种用于降低敌百虫毒性的类球红细菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术：
：敌百虫是我国水产养殖中广泛使用的杀虫剂，广泛用于水产动物寄生虫病的防治。然而，在实际应用中，敌百虫在碱性水体时，毒性增强，经常导致水产动物出现中毒事故。除此之外，敌百虫的过量反复使用也容易导致其在水环境中的残留，严重影响水产品的质量安全，对水生生物产生毒害，进而对水生生态系统和人类健康产生潜在的危害。因此，如何减少水产养殖中因敌百虫使用导致的中毒事故的发生率具有重要意义。本领域的研究人员一直希望能够开发出可以耐受敌百虫的毒性的同时，还能够降低或减弱水环境中敌百虫的毒性效应的微生物菌种。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种类球红细菌xr12，该类球红细菌xr12保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2017826。本发明另一方面还提供了上述类球红细菌xr12在水产养殖领域的应用。在本发明的一个优选实施方案中，所述类球红细菌xr12在降低水产养殖的水环境中的敌百虫毒性的应用。本发明再一方面提供了上述类球红细菌xr12在水环境治理领域的应用。在本发明的一个优选实施方案中，所述类球红细菌xr12在降低水环境中的敌百虫毒性的应用。本发明提供了一种新菌株——类球红细菌xr12，其不仅对于水环境或者说水产养殖环境中的敌百虫具有很强的耐受性，更重要的是具有降低水环境或者说水产养殖环境中的敌百虫的毒性作用的效果，可以应用于水产养殖领域或水环境治理领域。附图说明图1为本发明的菌株xr12在光学显微镜下的照片。具体实施方式以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式使得本发明将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。一、下面介绍本申请发明人从自然环境中分离筛选获得本发明的类球红细菌(rhodobactersphaeroides)xr12的操作过程。1)初筛：将5g频繁使用过渔用敌百虫的养殖池淤泥(采自上海青浦某养殖场)，与100ml含敌百虫浓度为1000mg/l的无菌普通营养肉汤培养基加入到250ml的三角烧瓶中混匀，25℃震荡培养18h；然后再在含敌百虫浓度为1000mg/l的无菌普通营养琼脂培养基的平板上进行划线分离与纯化；再将数个分离出的菌株放置于含敌百虫浓度2000mg/l的无菌普通营养琼脂培养基平板上，若生长情况良好，作为筛选出的候选菌株(具有潜在可降低敌百虫毒性作用的优良菌株)；2)初筛的候选菌株的形态观察：然后将筛选出来的候选菌株接种于100ml无菌普通营养肉汤培养基(不含敌百虫)的250ml的三角烧瓶中，25℃震荡培养18-24小时后获得的培养液即为候选菌株的培养液。菌株的浓度可以采用稀释涂布无菌普通营养琼脂培养基平板法进行测定，然后采用简单染色法对候选菌株的形态进行显微观察。3)通过耐受性实验进一步筛选：采用二倍稀释法测定候选菌株对敌百虫的耐受力(以敌百虫对候选菌株的最小杀菌浓度作为判断标准)。将敌百虫溶液(终质量浓度为1000mg/ml)分别加入含有2ml无菌营养肉汤的试管中，至终质量浓度分别为30720、15360、7680、3840、1920、960、480、240、120、60、30、15、7.5、3.75、1.88、0.94、0.47、0.24、0.12、0.06、0.03、0mg/l，并以空白无菌普通营养肉汤培养基作为空白对照，然后分别接种候选菌株的培养液至终浓度5.0×105cfu/ml，于25℃恒温培养24h后观察结果，把无菌生长、稀释度最大的敌百虫的质量浓度作为具有候选菌株对敌百虫的最大耐受浓度。通过对高浓度敌百虫的耐受性实验，筛选出了具有潜在可降低敌百虫毒性作用的优良菌株xr12。二、关于菌株xr12的鉴定过程如下：1)分子生物学鉴定根据细菌16srrna序列，采用系统发育分析对菌株xr12进行分子鉴定。具体来说，采用天根生化科技有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取菌株xr12的基因组dna；再采用天根生化科技有限公司的pcr扩增试剂盒扩增该菌株xr12的16srrna序列，其中，扩增采用的正向引物序列为5’-agagtttgatcctggctcag-3’(如seqidno.1所示)，反向引物序列为：5’-ggttaccttgttacgactt-3’(如seqidno.2所示)，具体操作按照试剂盒说明书进行。扩增条带使用天根生化科技有限公司的dna纯化回收试剂盒进行切胶回收。回收的样品送至上海杰李生物技术有限公司进行序列测定。通过测序确定菌株xr12的16srrna为1338bp大小的片段，具体序列如seqidno.3所示。将该序列与genbank中已知细菌的16srrna序列进行相似性比对，结果显示菌株xr12与红细菌属的已知菌株具有99％～100％同源性，在此基础上，从红细菌属的系统发育树进一步鉴定菌株xr12为类球红细菌(rhodobactersphaeroides)。2)菌株形态鉴定菌株xr12的菌体呈杆状，部分为长杆状，在形态上与常见类球红细菌呈卵球形有所不同。菌株xr12在40倍光学显微镜下的照片参见图1。三、关于菌株的保藏本发明的具有降低敌百虫毒性作用的菌株xr12，属类球红细菌(rhodobactersphaeroides)，已于中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏日期：2017年12月20日；保藏编号：cctccno：m2017826。四、本发明具有降低敌百虫毒性作用的菌株xr12对于敌百虫的耐受性的测试采用二倍稀释法测定候选菌株对敌百虫的耐受力(以敌百虫对候选菌株的最小杀菌浓度作为判断标准)。将敌百虫溶液(终质量浓度为1000mg/ml)分别加入含有2ml无菌营养肉汤的试管中，至终质量浓度分别为30720、15360、7680、3840、1920、960、480、240、120、60、30、15、7.5、3.75、1.88、0.94、0.47、0.24、0.12、0.06、0.03、0mg/l，并以空白无菌普通营养肉汤培养基作为空白对照，然后分别接种候选菌株的培养液至终浓度5.0×105cfu/ml，于25℃恒温培养24h后观察结果，把无菌生长、稀释度最大的敌百虫的质量浓度作为具有候选菌株对敌百虫的最大耐受浓度。以同等条件下类球红细菌菌株red1对敌百虫的耐受力作为对照。实验结果见下表1。菌株xr12对敌百虫的最大耐受力可达7680mg/l，与对照菌株(类球红细菌red1，来源于国家水生动物病原库(上海海洋大学)对敌百虫的最大耐受力(3840mg/l)相比，本发明的菌株xr12对敌百虫的耐受性更强。表1菌株xr12与对照菌株red1对敌百虫的耐受力浓度(mg/l)菌株xr12菌株red1浓度(mg/l)菌株xr12菌株red10++30++0.03++60++0.06++120++0.12++240++0.24++480++0.47++960++0.94++1920++1.88++3840+-3.75++7680--7.5++15360--15++30720--注：+表示菌生长；-表示菌不生长五、本发明具有降低敌百虫毒性作用的菌株xr12的安全性测定和降低敌百虫毒性的效果的测定首先，测定候选菌株的安全性：测定方法参照《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》(gb/t13267—1991)进行，具体来说，在盛有0.1m3根据gb/t13267—1991制备的标准稀释水的玻璃水族缸中进行，每缸放入健康斑马鱼10尾。试验组每24h向各水族缸中加入菌浓度为1.0×1011cfu/ml的菌株xr12的培养液至剂量为0.1、1、10、100、1000、10000mg/l，对照组不添加任何物质。然后在连续加入菌株的培养液4天后的1、2、4、8、16、24、48、72、96h对鱼体反应能力、游动能力、呼吸能力等指标进行观察，记录各浓度组斑马鱼的死亡数目及任何不正常的行为，计算菌株xr12对斑马鱼的lc50，每个浓度设3个平行，试验期间条件控制在24～26℃、do>4mg/l、ph7.2。实验结果参见下表2，菌株xr12对斑马鱼的安全性测试结果。表2菌株xr12对斑马鱼的急性毒性结果以剂量为0.1-10000mg/l连续加入1.0×1011cfu/ml菌株xr12的培养液4天，试验组和对照组斑马鱼也未出现鱼体反应迟钝、侧翻、游动和呼吸能力减弱以及死亡等不正常现象，均生长良好，说明菌浓度为1.0×1011cfu/ml的菌株xr12对斑马鱼的96h-lc50大于10000mg/l。然后，测定敌百虫对斑马鱼半数致死剂量；测定方法参照《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》(gb/t13267—1991)进行，具体来说，在盛有0.1m3根据gb/t13267—1991制备的标准稀释水的玻璃水族缸中进行，每缸放入健康斑马鱼10尾。试验组向各水族缸中敌百虫至终浓度10、20、30、40mg/l，对照组不添加任何物质，然后在加入敌百虫后的24、48、72、96h对鱼体反应能力、游动能力、呼吸能力等指标进行观察，记录各浓度组斑马鱼的死亡数目及任何不正常的行为，计算敌百虫对斑马鱼的96h-lc50。试验期间条件控制在24～26℃、do>4mg/l、ph7.2。最后，在添加了本发明的具有降低敌百虫毒性作用的菌株xr12之后，测定敌百虫对斑马鱼的半数致死剂量，由此测定本发明的菌株xr12降低敌百虫毒性的效果。具体来说，在盛有0.1m3根据gb/t13267—1991制备的标准稀释水的玻璃水族缸中进行，每缸放入健康斑马鱼10尾。试验组向各水族缸中加入菌浓度为1.0×1011cfu/ml的菌株xr12的培养液至剂量为10mg/l，与此同时在加入菌株xr12的玻璃水族缸中加入终浓度为10、20、30、40mg/l敌百虫，空白对照组不添加任何物质。然后在试验开始后的24、48、72、96h对鱼体反应能力、游动能力、呼吸能力等指标进行观察，记录各浓度组斑马鱼的死亡数目及任何不正常的行为，计算添加菌株xr12的敌百虫对斑马鱼的96h-lc50。试验期间条件控制在24～26℃、do>4mg/l、ph7.2。以同等条件下添加对照菌株类球红细菌菌株red1的敌百虫对斑马鱼的急性毒性试验作为对照。实验结果见下表3。表3添加菌体浓度为1.0×1011cfu/ml的菌株xr12培养液后，敌百虫对斑马鱼的96h-lc50为49.13mg/l，比未添加任何菌株的敌百虫对斑马鱼的96h-lc50提高了96.68％，比添加对照菌株red1的敌百虫对斑马鱼的96h-lc50提高了391.3％，说明菌种xr12的加入明显降低了敌百虫对斑马鱼的毒性，而且也显著优于对照菌株red1(此外，对照菌株red1不仅没有产生降低敌百虫毒性的效果，而且还增强了敌百虫的毒性，说明了并非所有的类球红细菌菌株都具有降低敌百虫毒性的作用)。综上，本发明的发明人筛选的类球红细菌xr12不仅对于水环境或者说水产养殖环境中的敌百虫具有很强的耐受性，更重要的是具有降低水环境或者说水产养殖环境中的敌百虫的毒性作用的效果。因此，本发明的类球红细菌xr12可以应用于水产养殖领域。优选的，本发明的类球红细菌xr12可以应用于降低水产养殖的水环境中的敌百虫的毒性。本发明的类球红细菌xr12还可以应用于水环境治理领域。优选的，本发明的类球红细菌xr12可以应用于降低水环境中的敌百虫的毒性。应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>上海海洋大学连云港市海洋与渔业发展促进中心<120>一种用于降低敌百虫毒性的类球红细菌及其应用<130>2018-shou-1<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>rna<213>人工合成<400>1agaguuugauccuggcucag20<210>2<211>19<212>rna<213>人工合成<400>2gguuaccuuguuacgacuu19<210>3<211>1338<212>rna<213>类球红细菌<400>3uaccaugcaagucgagcgaagucuucggacuuagcggcggacgggugaguaacgcguggg60aacaugcccaaagguacggaauagccccgggaaacugggaguaauaccguaugugcccuu120cgggggaaagauuuaucgccuuuggauuggcccgcguuggauuagguaguugguggggua180auggccuaccaagccgacgauccauagcugguuugagaggaugaucagccacacugggac240ugagacacggcccagacuccuacgggaggcagcaguggggaaucuuagacaaugggcgca300agccugaucuagccaugccgcgugaucgaugaaggccuuaggguuguaaagaucuuucag360gugggaagauaaugacgguaccaccagaagaagccccggcuaacuccgugccagcagccg420cgguaauacggagggggcuagcguuauucggaauuacugggcguaaagcgcacguaggcg480gacuggaaagucaggggugaaaucccggggcucaaccccggaacugccuuugaaacuccc540agucuugaggucgagagaggugaguggaauuccgaguguagaggugaaauucguagauau600ucggaggaacaccaguggcgaaggcggcucacuggcucgauacugacgcugaggugcgaa660agcguggggagcaaacaggauuagauacccugguaguccacgccguaaacgaugaaugcc720agucgucgggcagcaugcuguucggugacacaccuaacggauuaagcauuccgccugggg780aguacggccgcaagguuaaaacucaaaggaauugacgggggcccgcacaagcgguggagc840augugguuuaauucgaagcaacgcgcagaaccuuaccaacccuugacauggcgaucgcgg900uuccagagaugguuccuucaguucggcuggaucgcacacaggugcugcauggcugucguc960agcucgugucgugagauguucgguuaaguccggcaacgagcgcaacccacguccucaguu1020gccagcauucaguugggcacucuggggaaacugccggugauaagccggaggaaggugugg1080augacgucaaguccucauggcccuuacggguugggcuacacacgugcuacaauggcagug1140acaauggguuaaucccaaaaagcugucucaguucggauuggggucugcaacucgacccca1200ugaagucggaaucgcuaguaaucgcguaacagcaugacgcggugaauacguucccgggcc1260uuguacacaccgcccgucacaccaugggaauugguucuacccgaaggcggugcgccaacc1320ucgcaagaggaggcagcg1338sequencelisting<110>上海海洋大学连云港市海洋与渔业发展促进中心<120>一种用于降低敌百虫毒性的类球红细菌及其应用<130>2018-shou-1<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>rna<213>人工合成<400>1agaguuugauccuggcucag20<210>2<211>19<212>rna<213>人工合成<400>2gguuaccuuguuacgacuu19<210>3<211>1338<212>rna<213>类球红细菌<400>3uaccaugcaagucgagcgaagucuucggacuuagcggcggacgggugaguaacgcguggg60aacaugcccaaagguacggaauagccccgggaaacugggaguaauaccguaugugcccuu120cgggggaaagauuuaucgccuuuggauuggcccgcguuggauuagguaguugguggggua180auggccuaccaagccgacgauccauagcugguuugagaggaugaucagccacacugggac240ugagacacggcccagacuccuacgggaggcagcaguggggaaucuuagacaaugggcgca300agccugaucuagccaugccgcgugaucgaugaaggccuuaggguuguaaagaucuuucag360gugggaagauaaugacgguaccaccagaagaagccccggcuaacuccgugccagcagccg420cgguaauacggagggggcuagcguuauucggaauuacugggcguaaagcgcacguaggcg480gacuggaaagucaggggugaaaucccggggcucaaccccggaacugccuuugaaacuccc540agucuugaggucgagagaggugaguggaauuccgaguguagaggugaaauucguagauau600ucggaggaacaccaguggcgaaggcggcucacuggcucgauacugacgcugaggugcgaa660agcguggggagcaaacaggauuagauacccugguaguccacgccguaaacgaugaaugcc720agucgucgggcagcaugcuguucggugacacaccuaacggauuaagcauuccgccugggg780aguacggccgcaagguuaaaacucaaaggaauugacgggggcccgcacaagcgguggagc840augugguuuaauucgaagcaacgcgcagaaccuuaccaacccuugacauggcgaucgcgg900uuccagagaugguuccuucaguucggcuggaucgcacacaggugcugcauggcugucguc960agcucgugucgugagauguucgguuaaguccggcaacgagcgcaacccacguccucaguu1020gccagcauucaguugggcacucuggggaaacugccggugauaagccggaggaaggugugg1080augacgucaaguccucauggcccuuacggguugggcuacacacgugcuacaauggcagug1140acaauggguuaaucccaaaaagcugucucaguucggauuggggucugcaacucgacccca1200ugaagucggaaucgcuaguaaucgcguaacagcaugacgcggugaauacguucccgggcc1260uuguacacaccgcccgucacaccaugggaauugguucuacccgaaggcggugcgccaacc1320ucgcaagaggaggcagcg1338当前第1页12