本发明属于先天性心脏病检测试剂技术领域，具体涉及一种用于检测先天性心脏病的基因panel及应用。
背景技术：
先天性心脏病(congenitalheartdisease，chd)是最常见的出生缺陷。患有先天性心脏病的新生儿如果未进行及时的干预和治疗，其中大约有1/3会在出生后1个月内因严重的病情和畸形而夭折，危害极其严重。先天性心脏疾病是新生儿最常见的先天性缺陷疾病。先天性心脏病是指新生儿在出生前心脏大血管结发生异常，包括主动脉瓣膜狭窄、主动脉缩窄、ebstein畸形、动脉导管未闭、肺动脉瓣狭窄、室间隔缺损(包括房间隔缺损及室间隔缺损)、法洛四联症和完全性大动脉转位等。在西方国家，每出生1000个新生儿，就有6-8个新生儿患有先天性心脏病，先天性心脏病常导致新生儿的死亡。在亚洲，先天性心脏病的发病率为9.3‰。先天性心脏病新生儿如果未进行及时的干预，危害极其严重，将会缺氧和休克等，甚至死亡。流行病学研究表明环境因素和遗传因素共同作用导致了先天性心脏病的发生，其中遗传因素起重要作用。对先心胎儿进行遗传学检测既可明确遗传背景、为遗传咨询提供重要的信息，对再次生育夫妇进行风险评估；也对先天性心脏病胎儿预后判断以及外科手术的效果具有指导价值。
临床上现有的检测先天性心脏病的主要手段是超声心动图，尤其是胎儿超声心动图的检查可在胎儿时期诊断先天性心脏病，避免难治先心病患儿的出生。对于可治愈的先心、或已经出生的先心患儿可以通过手术来纠正其心脏结构的异常。但是对于由于遗传缺陷而导致的先天性心脏病患者，可能存在着其他方面的异常，即使手术能够纠正其结构异常，其功能仍未有改善，仍会导致预后不佳。对先心胎儿进行遗传学检测具有重要的临床价值，首先，可为胎儿预后以及外科手术的取舍提供指导意见；其次，明确病因，为遗传咨询提供重要的信息，并可为再次妊娠进行风险评估。另外，利用超声心动图对胎儿进行检测需要到孕22-24周，如果诊断出胎儿有严重的先天性心脏病需要引产，对孕妇本人及家庭的身心都会带来极大的痛苦和压力。
基因检测最早可于11周进行，可以早期诊断，减少对孕妇的伤害及早做决策是否终止妊娠。然而现有技术中，对于基因突变检测目前临床中尚无高效的检测手段，亟需一种新技术能够有效检测导致先天性心脏病的基因突变。
技术实现要素：
本发明提供的一种用于检测先天性心脏病的基因panel及应用，能够有效检测导致先天性心脏病的基因突变，最早可于1-13周进行检测。
本发明的目的是提供一种用于检测先天性心脏病的基因panel，包括77个基因，所述77个基因对应的名称如下：
43个心脏病合并综合征相关的基因：
20个单纯心脏病相关基因：
14个单纯心脏病/综合征相关基因：
本发明的另一个目的是提供一种所述的基因panel在制备孕早期胎儿先天性心脏病检测试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明提供一种用于检测先天性心脏病的基因panel及应用，具有以下有益效果：
(1)鉴于国内外目前尚无针对胎儿的先天性心脏病全面系统的基因panel的缺陷，本发明提供了一种用于检测先天性心脏病的基因panel及应用，对先天性心脏病不同类型的相关基因设计了靶向捕获探针，其中包含了77个基因。并且，本发明利用羊水/绒毛膜穿刺获得胎儿细胞后进行dna提取，捕获，建库，pcr扩增，测序等过程对胎儿的基因进行检测，进行生物信息学分析，如突变频率、突变性质、生物学危害性、保守性等进行评估，寻找胎儿致病的基因突变。该技术具有通量高、速度快、等显著的优点。
(2)本发明的77个基因panel可一次性对多个与先天性心脏病相关的基因进行检测，能够显著提高先天性心脏病的突变位点的阳性检出率，能够用于先天性心脏病的病因学探讨和产前分子遗传学诊断，为先天性心脏病胎儿的优生优育和遗传咨询提供重要的判断依据。对胎儿进行靶向外显子捕获测序可以高效、全面、快速的检测致病突变，无疑对临床有很大指导意义。
(3)利用本发明的77个基因panel可在孕早期(1-13孕周)对胎儿进行先天性心脏病的基因检测，可为胎儿预后以及外科手术的取舍提供指导意见；也可以明确病因，为遗传咨询提供重要的信息，并可为再次妊娠进行风险评估；还可以减轻孕妇及家属的身体、心理及精神压力、减轻家庭及社会的经济负担。目前已经检测44例患有先天性心脏的胎儿，并有6例检测出致病突变，1例可疑致病突变位点，本方法具有较好的创新性及实用性。
附图说明
图1为实施例1中利用本发明77个基因panel检测先天性心脏病的测序结果。
图1a为c.2550_2554del(chd7)基因，图1b为c.574_579delagcggc(cited2)基因，图1c为c.2168+1g>a(myh6)基因，图1d为c.11248c>t(kmt2d)基因，图1e为c.2107a>c(zfpm2)基因，图1f为c.12140_12168del(kmt2d)基因，图1g为c.1078t>g(jag1)基因。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供了一种用于检测先天性心脏病的基因panel，包括77个基因，所述77个基因对应的名称、相应的染色体编号和登录号(ncbi，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)如表1所示。
表177个基因名称、相应的染色体编号和登录号
实施例1
我们利用上述的77个基因探针对44例患有先天性心脏病的胎儿进行靶向外显子捕获测序，具体步骤如下：
步骤1、提取待测样品的gdna并进行超声破碎
按照常规方法提取gdna，gdna样本要求：无降解或轻微降解；无rna等杂质；od260/280＝1.8～2.0；用qubit检测gdna样本的浓度；
取500-1000nggdna样本，加水至21μl；超声破碎gdna至片段主峰250-300bp，获得dna片段，避免在超声破碎过程中gdna过热；取1μl超声破碎后的gdna通过2％琼脂糖凝胶电泳检查dna片段的主峰是否在150-200bp。
步骤2、末端修复
超声破碎后的获得dna片段，样本按照下列反应体系加样，轻微混匀，瞬时离心后置于低温金属浴上，启动pcr反应程序，等待温度降至20℃，将反应体系放入pcr仪，等待程序结束后获得末端修复体系，进入下一步操作。
反应体系(25μl)：
dna片段19μl
end-repair&adenylationbuffer(市售的末端修复缓冲液)3.5μl
end-repair&adenylationenzymemix(市售的末端修复酶液)2.5μl
pcr反应程序：
20℃30min
65℃30min
10℃1min
步骤3、接头连接
将步骤2获得的末端修复体系按照下列反应体系加样，记录adaptoroligomix的index编号与样本的对应关系，轻微混匀，瞬时离心后置于低温金属浴上，启动pcr反应程序，等待温度降至22℃，将反应体系放入pcr仪，等待程序结束后获得接头连接体系，进入下一步操作。
反应体系(37μl)：
反应程序：
22℃30min
步骤4、磁珠纯化连接体系
将步骤3获得的接头连接体系中加入17.5μlagencourtampurexp(市售)，充分混匀，室温静置，5minagencourtampurexp使用前需混匀；纯化体系瞬时离心后放置于磁力架上5min，直至上部液体澄清，用移液器吸取上清并丢弃，注意不要吸到磁珠；取200μl80％乙醇沿管壁缓慢加入，静止30s后移去上清，重复此步骤一次；瞬时离心，置于磁力架上，去除残留液体，放置2min至磁珠干燥；加入12μlnuclease-freewater，移液器混匀磁珠，静置2min后置于磁力架上，吸取上清备用；
步骤5、按照以下反应体系进行pcr扩增，反应结束后获得pcr体系。
pcr扩增反应体系如下(25μl)：
纯化产物11.5μl
2×pcrmastermix12.5μl
引物1μl
步骤5中的引物根据表1中的基因名称的序列，利用引物序列设计软件设计均可，此处不予赘述。
pcr扩增反应程序如下：
步骤6、磁珠纯化pcr体系
pcr体系中加入25μlagencourtampurexp，充分混匀，室温静置5min；纯化体系瞬时离心后放置于磁力架上5min，直至上部液体澄清，用移液器吸取上清并丢弃，注意不要吸到磁珠；取200μl80％乙醇沿管壁缓慢加入，静止30s后移去上清，重复此步骤一次；瞬时离心，置于磁力架上，去除残留液体，放置2min至磁珠干燥；加入25μltebuffer，移液器混匀磁珠，静置2min后置于磁力架上，吸取上清液备用，或-20℃保存；
步骤7、构建文库
将步骤6获得的上清液进行文库检测和构建文库，其中qubit定量需求的样品量为25μl，浓度>15ng/μl；q-pcp定量需求的样品量为25μl，浓度>10nm；最终获得dna片段大小分布在基因300-600bp的文库(agilent2100检测主峰430bp)。
步骤8、探针捕获和测序对比
采用罗氏nimblegen公司根据表1的基因设计的seqezexomeenrichmentkitv2.0捕获探针进行正常人全外显子组捕获。v2.0捕获探针覆盖人基因组中19119个基因的编码区，总共捕获区间大小是40mb。并对捕获的基因进行测序分析。另外对步骤7所得的文库进行测序分析，比较待测样本dna与正常正常人dna的区别。
我们44例待测样本进行检测，其中6例得到明确诊断，发现致病突变为c.2550_2554del(chd7),c.574_579delagcggc(cited2),c.2107a>c(zfpm2),c.2168+1g>a(myh6),c.12140_12168del(kmt2d)和c.11248c>t(kmt2d)。1例可疑致病突变c.1078t>g(jag1)。其诊断率为13.6％(6/44)。进行一代测序验证后与靶向捕获测序结果一致。利用本发明77个探针检测先天性心脏病的测序结果如图1所示，其中图1a为c.2550_2554del(chd7)基因的测序结果，图1b为c.574_579delagcggc(cited2)基因，图1c为c.2168+1g>a(myh6)基因，图1d为c.11248c>t(kmt2d)基因，图1e为c.2107a>c(zfpm2)基因，图1f为c.12140_12168del(kmt2d)基因，图1g为c.1078t>g(jag1)基因。
需要说明的是，上述是实施例1中adaptoroligomix、agencourtampurexp等试剂均够自华大基因有限公司。需要说明的是，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。