人VASN蛋白抗原表位、抗原模拟表位及其用途的制作方法

本发明涉及蛋白质工程、分子生物学、免疫学及细胞生物学领域，具体而言，本发明涉及人vasn蛋白(vasorin)抗原表位及其制备方法和用途。

背景技术：

人vasn蛋白(vasorin)，又称slit-like2(slitl2)蛋白，属于典型的i型跨膜糖蛋白，其胞外结构域经去整合素-金属蛋白酶17(adisintegrinandmetalloprotease17，adam17)剪切、脱落，成为可溶性形式。人vasn蛋白在主动脉的血管平滑肌细胞有较高水平的表达，在肾脏、胎盘组织也有表达，其它组织则表达水平低[ikeday，etal.(2004)pnas101(29)：10732-10737]。而已有研究表明，乳腺癌细胞高表达vasn蛋白[jmalapeira，etal.(2010)oncogene，30：1912-1922]。westcott等人发现vasn等基因高表达，可以促进乳腺癌细胞的侵袭；进而利用基因芯片检测三阴乳腺癌患者肿瘤组织样品，结果显示，高表达vasn等基因的患者预后差[westcottjm，etal.(2015)jclininvest125(5)：1927-43]。malapeiraj等人研究结果显示，可溶性vasn(solublevasn，svasn)蛋白可以结合tgf-β，抑制其介导的上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymaltransition，emt)[malapeiraj，etal.(2011)oncogene30(16)：1912-22]。li等人研究表明，肝癌细胞、肝癌组织中异常高表达vasn；人肝细胞l02过表达vasn蛋白，能够促进其增值与迁移；敲低人肝癌细胞hepg2的vasn，则促进其凋亡、抑制其迁移[lis，etal.(2015)oncotarget6(12)：10045-59]。此外，人肝癌细胞hepg2培养上清的外泌体中vasn蛋白水平明显高于正常肝细胞l02外泌体中的vasn。hepg2细胞来源的外泌体vasn蛋白可以转运至人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，huvec)中，促进huvec细胞的迁移[huanga，etal.(2015)intjbiolsci11(8)：961-9]。上述研究结果提示，vasn可能通过促进肿瘤细胞生长和肿瘤血管形成，参与肿瘤的发生发展过程。

抗原表位作为激发特异性免疫应答的物质基础，对于免疫反应的相关研究具有重要意义。蛋白质间相互作用是通过其表面关键氨基酸残基组成的相互作用位点即功能结构域(domain)发生物理上的接触来实现的。这些关键位点的获得不仅可以加深对分子识别过程的认识，而且有利于深入了解信号传导通路的生物学机制，对合理化药物设计也具有重要价值。模拟表位(mimotope)，通常指能够模拟抗原表位的多肽结构，它具有与天然抗原相似的反应原性，与适当的载体偶联后，还可能具有相似的免疫原性，(但在天然抗原中可能并无与之相同或相似的序列)[deroos，etal.(2001)combchemhighthroughputscreen4(1)：75-110]。对于一些难以获得或尚不确定的抗原，人们很难甚至无法确定其抗原表位，而通过获得“模拟表位”，便有可能解决上述问题，尤其推动了构象型表位和非蛋白抗原表位的研究。“模拟表位”概念的出现，不仅为抗原表位的分析、疫苗研发开辟了一条新的思路，而且也为蛋白间相互作用研究提供了线索。

噬菌体展示技术是1985年由dr.smith建立，并迅速发展成为推动模拟表位研究的一项关键技术，其将多肽或蛋白质的编码基因克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达而展示在噬菌体表面。运用该项技术，将随机排列的外源肽(通常6～15个氨基酸残基组成)展示在噬菌体表面，构成多样性为10⁷以上的随机肽库[melitabietal(2001)curropinchembiol，5(3)：314-324]。进而通过亲和纯化的生物淘选过程，从噬菌体肽库中筛选出靶分子(如抗体、蛋白分子、多糖、脂类、小分子化合物等)的结合肽，这些结合肽与天然抗原可能高度同源或者完全不同，但都具有与天然抗原相似的抗原性和免疫原性，这些结合肽即是“模拟表位”。在抗原表位研究中，噬菌体展示技术具有很强的优势，不仅简便、快捷，而且应用范围广泛，适于构象型表位、非蛋白抗原表位以及尚不明确的抗原研究。

基于目前的研究现状，申请人拟通过功能性抗体策略拮抗vasn生物学功能，以抑制肿瘤的发展，而获得vasn关键的显性抗原表位对于功能性抗体的制备至关重要。鉴于此，申请人进行了大量研究和探索，通过下述试验策略获得了vasn功能性抗原表位，具体而言：申请人以重组表达的可溶性vasn蛋白为抗原，制备和纯化了几株抗vasn蛋白的单克隆抗体；elisa、免疫印迹、免疫共沉淀等实验检测了其特异性和亲和力，结果显示，其中的21号抗体特异性高、亲和力强；transwell和细胞增殖实验显示，21号抗体能够显著抑制hepg2细胞的迁移与增殖。以线性随机十二肽库与21号抗体孵育，经生物淘洗获得了与抗体特异结合的噬菌体克隆。进而，通过elisa与竞争elisa实验挑选出阳性噬菌体克隆，测定阳性克隆展示肽序列。序列比对分析结果显示，模拟表位肽与vasn蛋白430-441位氨基酸序列高度同源(clcpegftglyc，seqidno：1)，其共有序列为xxxlpxftglxx(seqidno：2)，其中x代表任意一种氨基酸。然后申请人合成了其中两条肽vp1(sltlppftglag，seqidno：3)和vp2(tqfsitppftgs，seqidno：4)。elisa与竞争elisa实验结果表明，两条表位肽均能与21号抗体结合，即该多肽为vasn模拟表位肽。进一步地，申请人通过transwell实验和cck-8实验，确定小肽vp1、vp2能够拮抗21号抗体抑制hepg2细胞迁移和增殖的生物学功能，表明小肽vp1、vp2是vasn蛋白功能性表位肽，由此完成本发明。

技术实现要素：

1.本发明提供了一种人vasn蛋白的抗原表位，其对应于vasn蛋白430-441位氨基酸序列：

vasn(430-441)clcpegftglyc(seqidno：1)。

2.本发明提供了一种人vasn蛋白的抗原模拟表位，其具有以下氨基酸序列结构模式：

xxxlpxftglxx(seqidno：2)。

3.本发明提供的vasn蛋白的抗原表位及抗原模拟表位所示的多肽氨基酸序列，其大写英文字母分别代表二十种已知天然l-型氨基酸残基或其d-型异构体的一种，即a代表丙氨酸残基，c代表半胱氨酸残基，r代表精氨酸残基，n代表天冬酰胺残基，d代表天冬氨酸残基，q代表谷氨酰胺残基，e代表谷氨酸残基，h代表组氨酸残基，w代表色氨酸残基，y代表酪氨酸残基，f代表苯丙氨酸残基，t代表苏氨酸残基，s代表丝氨酸残基，l代表亮氨酸残基，g代表甘氨酸残基，p代表脯氨酸残基，v代表缬氨酸残基，k代表赖氨酸残基，m代表甲硫氨酸残基，i代表异亮氨酸残基。其中大写英文字母x代表二十种已知天然l-型氨基酸残基或其d-型异构体的任意一种。

4.本发明所述的人vasn蛋白抗原表位及其抗原模拟表位，其特征在于所示序列中的有些氨基酸可以根据氨基酸的相似性进行相互替代，其中：谷氨酰胺残基(q)，谷氨酸残基(e)，天冬氨酸残基(d)或天冬酰胺残基(n)之间可以相互替代；色氨酸残基(w)，酪氨酸残基(y)或苯丙氨酸残基(f)之间可以相互替代；赖氨酸残基(k)和精氨酸残基(r)之间可以相互替代；丝氨酸残基(s)和苏氨酸残基(t)之间可以相互替代；丙氨酸残基(a)和甘氨酸残基(g)之间可以相互替代；亮氨酸残基(l)和甲硫氨酸残基(m)之间可以相互替代。

5.本发明所述的任意一种序列的多肽，可以是以任何形式获得的，如展示在噬菌体或其他微生物载体上、或体外化学合成、或用基因工程方法重组表达。

6.本发明所述的任意一种序列的多肽，无论以任何形式在制备肿瘤抗体药物或肿瘤疫苗以及在其他医药领域中的应用。

附图说明

图1：表示鉴定挑取的噬菌体单克隆结合vasn21号抗体的elisa实验结果；

图2：表示噬菌体展示肽的序列比对结果；

图3：表示检测阳性噬菌体克隆的竞争elisa实验结果；

图4：表示合成的抗原表位肽vp1、vp2结合21号抗体的elisa实验结果；

图5：表示合成的抗原表位肽vp1、vp2抑制vasn与21号抗体的竞争elisa实验结果；

图6：表示蛋白vp1-bsa、vp2-bsa拮抗21号抗体抑制hepg2细胞迁移的transwell实验结果；

图7：transwell实验细胞计数统计结果(*p＜0.05)；

图8：表示蛋白vp1-bsa、vp2-bsa拮抗21号抗体抑制hepg2细胞增殖的cck-8实验结果(*p＜0.05)。

具体实施方式

为了更清楚地阐述本发明，具体提供了下述阐述性的实施方案，本领域的技术人员应该理解，本发明并不仅仅限定于下述实施例，任何与本发明的实施例等同的变体也包括在本发明中。

实施例1、噬菌体展示肽库筛选抗vasn蛋白的21号抗体结合肽

ph.d.-12肽库试剂盒购自neb公司，库容量为2.7×10⁹，滴度为1.5×10¹³/μl，escherichiacolier2537为宿主菌。筛选过程参见噬菌体展示肽库使用说明书。每轮筛选以抗vasn蛋白的21号抗体(每孔0.5μg)包被，每孔投入1×10¹¹噬菌体。噬菌体富集程度通过“投入/产出比”计算。经过三轮筛选，挑取阳性克隆测序。阳性噬菌体克隆与21号抗体的特异性结合通过elisa测定。21号抗体(每孔0.5μg)包被96孔板(nunc公司)4℃过夜。倾去不结合的抗体，3％bsa37℃封闭1小时。每孔投入1×10⁹噬菌体37℃孵育2小时。洗涤液(pbs-0.05％tween20)洗板5次，共3分钟。抗m13单抗(1∶5000稀释，amershambiosciences公司)37℃孵育1小时。洗涤方法同上，以tmb(sigma)为底物检测结合的抗m13单抗，450nm检测光吸收，结果见图1。由图1可知，共挑选了19个克隆，其中17个为阳性克隆。

实施例2、vasn抗原表位的获得

挑取了14个阳性噬菌体克隆进行测序，获得了5条展示肽序列(见表1)。通过比对这些结合肽序列，申请人发现其与vasn的430-441位氨基酸序列相似性高(见图2)。

表1噬菌体展示肽序列测定结果

实施例3、噬菌体展示肽与21号抗体结合的特异性检测

通过竞争elisa进一步确定阳性噬菌体克隆，挑选其中出现频次最高的两个噬菌体克隆进行检测，分别命名为克隆vp1(seqidno：3)、vp2(seqidno：4)。利用21号抗体(每孔0.2μg)包被96孔板(nunc公司)，系列稀释的vasn蛋白与1×10⁹个噬菌体vp1、vp2分别混合孵育，抗m13单抗(1∶5000稀释，amershambiosciences公司)检测结合的噬菌体，结果见图3。

实施例4、抗原表位肽vp1、vp2的抗原性检测

申请人合成了其中出现频次最高的两条序列，其具体的氨基酸序列为：sltlppftglag(seqidno：3)和tqfsitppftgs(seqidno：4)，分别命名为vp1、vp2，并与bsa偶联，即蛋白vp1-bsa、vp2-bsa。vp1-bsa、vp2-bsa与21号抗体的特异性结合通过elisa实验测定。96孔板(nunc公司)包被蛋白vp1-bsa、vp2-bsa和vasn蛋白，以及阴性对照蛋白(每孔1μg)。加入系列稀释的21号抗体，以hrp标记的羊抗鼠igg(康为世纪公司)为二抗，结果见图4。由图4可知，vp1和vp2为21号抗体的结合肽。

实施例5、抗原表位肽vp1、vp2与21号抗体结合的特异性检测

96孔板(nunc公司)包被vasn蛋白((每孔0.5μg)，加入21号抗体和系列稀释的vp1-bsa或vp2-bsa蛋白孵育混合物，以hrp标记的羊抗鼠igg(康为世纪公司)为二抗，结果见图5。图5可知，vp1和vp2表位肽均能抑制vasn与21号抗体的结合，表明vp1和vp2表位肽与21号抗体结合具有特异性。

实施例6、抗原表位肽vp1、vp2的生物学活性检测

通过transwell实验，检测vp1-bsa、vp2-bsa蛋白拮抗21号抗体的生物学功能。具体地，当向transwell小室上室中加入终浓度20μg/ml的21号vasn抗体时，hepg2细胞迁移能力显著降低。当终浓度20μg/ml的21号vasn抗体与终浓度10μg/ml的vp1-bsa或vp2-bsa蛋白同时加入时，hepg2细胞的迁移能力显著回升(见图6，7)。由图6，7可知，抗原表位肽vp1和vp2能够拮抗21号抗体抑制hepg2细胞迁移的生物学功能。

通过cck-8实验，检测vp1-bsa蛋白拮抗21号抗体的生物学功能。具体地，当向96孔板中加入终浓度40μg/ml的21号vasn抗体时，hepg2细胞增殖能力显著降低。当终浓度40μg/ml的21号vasn抗体与终浓度40μg/ml的vp1-bsa蛋白同时加入时，hepg2细胞的增殖能力显著回升(见图8)。由图8可知，抗原表位肽vp1能够拮抗21号抗体抑制hepg2细胞增殖的生物学功能。

综上可知，本申请的人vasn蛋白的两个抗原表位肽vp1(seqidno.3)和vp2(seqidno：4)，具有拮抗vasn抗体抑制肝癌细胞迁移和增殖的功能。