本发明涉及人类y精子的筛选方法(以下有时也称为“本申请的筛选方法”)、人类y精子的筛选用试剂盒(以下有时也称为“本申请的筛选用试剂盒”)，所述人类y精子的筛选方法包括测定人类精子在含有透明质酸酶(hyaluronidase)、孕酮(progesterone)(也称为“黄体激素”)及聚乙烯吡咯烷酮(pvp；polyvinylpyrrolidone)这三种成分(以下有时也称为“本申请的三种成分”)的生理性水溶液(以下有时也称为“本申请的生理性水溶液”)中的直线前进速度(日语为“直進速度”)的工序和检测该精子的尾部的弯曲状态的工序，所述人类y精子的筛选用试剂盒包含本申请的生理性水溶液。
背景技术：
人类等哺乳动物的性别是由来自父本和母本的两种性染色体(x染色体及y染色体)的组合决定的。女性的配子即卵子均具有x染色体，而男性的配子即精子存在具有x染色体的精子(x精子)和具有y染色体的精子(y精子)这2种。因此，若x精子与卵子进行授精，则出生xx型(纯合型)的女婴，若y精子与卵子进行授精，则出生xy型(杂合型)的男婴。
不仅在日本，在其他国家期望生育男婴的情况也并不少见。作为从精子中筛选y精子的方法，报道了例如基于x精子和y精子的移动速度及生存时间的差异的方法、基于阴道内ph差异的方法、基于比重差异的方法、无载体电泳法、使用了单克隆y抗体的方法等。然而，这些方法的有用性并未得到确认。另外，使用流式细胞术对x精子和y精子进行筛选的方法是已知的。虽然该方法的有用性得到了确认，但在所使用的激光的安全性、由dna结合色素所导致的染色体异常、dna合成能力的降低、细胞周期的延迟等而对精子造成损伤方面存在问题。此外，还报道了如下方法：对精子照射光，并对透过精子的光的光谱、被精子反射的光的光谱进行分析，由此在不对精子造成损伤的状态下筛选y精子(专利文献1)。然而，该文献中并未就筛选出y精子的情况进行具体的公开。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2004-101323号公报
技术实现要素：
发明所要解决的课题
本发明的课题在于，提供对精子造成的损伤少、且可比较简便地对y精子进行筛选的方法等。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本申请发明人持续进行了深入研究。在此过程中，发现在测定人类精子在含有透明质酸酶、孕酮及pvp的生理性水溶液中的运动速度、并对该精子尾部的弯曲状态进行检测时，运动速度更快、且尾部弯曲程度低、尾部鞭打频率(日语为“尾部振動数”)小的精子是y精子的概率高达大于90％，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]人类y精子的筛选方法，其特征在于，测定人类精子在含有透明质酸酶、孕酮及聚乙烯吡咯烷酮的生理性水溶液中的运动速度，并检测所述精子的尾部的弯曲状态。
[2]如上述[1]所述的筛选方法，其特征在于，进一步测定人类精子的头部的大小。
[3]如上述[1]或[2]所述的筛选方法，其特征在于，运动速度包括直线速度。
[4]用于人类y精子的筛选的试剂盒，其特征在于，包含含有透明质酸酶、孕酮及聚乙烯吡咯烷酮的生理性水溶液。
另外，作为本发明的其他实施方式，可举出：用于筛选人类y精子的含有透明质酸酶、孕酮及pvp的生理性水溶液；透明质酸酶、孕酮及pvp在制备用于筛选人类y精子的本申请的生理性水溶液中的应用。
发明效果
使用本申请的筛选方法、本申请的筛选用试剂盒时，能够比较简便且高效率地从人类精子中筛选人类y精子，并且几乎不对精子造成损伤。因此，本发明在借助人工授精(aih)、体外受精(ivf)、显微授精(icsi)等的妊娠中有助于生育男婴。
附图说明
[图1]为人类精子从a处移动至b处时的直线速度、曲线速度及平均路径速度(averagepathvelocity，日语为“進行方向性平均速度”)的示意图。
[图2]为示出了对5种样品(比较例1～3样品[图中的1～3]、实施例1样品[图中的4]、及比较例4样品[图中的5])中的人类精子的运动性进行分析得到的结果(n＝20)的图。图2a～g分别示出了对vsl(直线速度，straightlinevelocity)、vcl(曲线速度，curvilinearvelocity)、vap(平均路径速度)、str(前向性(日语为“直線性”)[＝直线速度/平均路径速度])、lin(直线性(日语为“直進性”)[＝直线速度/曲线速度])、alh(头部侧摆幅值，amplitutdeoflateralheaddisplacement)、及bcf(头部鞭打频率，beatcrossfrequency)进行测定所得的结果。
[图3]图3a为示出了筛选得到的人类y精子的核被dapi(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色的情况的图像，图3b为示出了筛选得到的人类y精子未被x染色体着丝粒fish探针染色的情况的图像，图3c为示出了筛选得到的人类y精子被y染色体着丝粒fish探针染色的情况的图像。
[图4]为实施例1样品中的人类y精子的相位差显微镜图像(图4b)和比较例1样品中的人类精子(x精子与y精子接近1:1)的相位差显微镜图像(图4a)。
具体实施方式
作为本申请的筛选方法，只要是包括测定人类精子在含有本申请的三种成分的生理性水溶液中的运动速度、且对该精子尾部的弯曲状态进行检测的工序的体外方法即可，不受特别限定，不包括将筛选得到的y精子注入子宫内的工序等所谓由医生进行的医疗行为。
另外，作为本申请的筛选用试剂盒，是用途被限定为“用于人类y精子的筛选”的、包含本申请的生理性水溶液的试剂盒。该试剂盒中，除了该类试剂盒中通常使用的成分例如后述任选成分以外，通常还包含记载有y精子的筛选方法(例如，筛选运动速度更快、且尾部弯曲程度低、及/或尾部鞭打频率小的精子作为y精子的内容)的说明书等附加文件。
本说明书中，所谓“y精子”，是指精子(单倍体)中具有y染色体的精子，区别于具有x染色体的精子(x精子)。
作为本申请的生理性水溶液中的透明质酸酶，只要是适合测定人类精子的运动速度、检测该精子尾部的弯曲状态的透明质酸酶即可，不受特别限定，可以是由哺乳动物(例如，人类、牛、猪、绵羊)精制得到的透明质酸酶，也可以是重组透明质酸酶，优选人源重组透明质酸酶。透明质酸酶可按照已知的方法例如文献“bookbinderlh,hofera,hallermf,zepedaml,kellerga,limje,etal.arecombinanthumanenzymeforenhancedinterstitialtransportoftherapeutics.jcontrolrelease.2006aug28；114(2):230-41.”中记载的方法来制备。另外，也可使用sageivf公司制、jxenergy公司制、astec公司制、cookmedical公司制、origio公司制等的art(assistedreproductivetechnology；辅助生殖技术)用途的透明质酸酶市售品。
作为本申请的生理性水溶液中的透明质酸酶的浓度，不受特别限定，通常为4(u/ml)以上，优选为10(u/ml)以上，更优选为20(u/ml)以上，进一步优选为30(u/ml)以上。另外，从性价比、避免对人类精子带来不良影响的观点考虑，通常为80(u/ml)以下，优选70(u/ml)以下，更优选60(u/ml)以下，进一步优选50(u/ml)以下。
作为本申请的生理性水溶液中的孕酮，只要是适合测定人类精子的运动速度、检测该精子尾部的弯曲状态的孕酮即可，不受特别限定，可以是天然来源的孕酮，也可以是人工合成的孕酮(合成黄体酮[progestin])。孕酮可按照已知的方法例如专利文献(日本特表平1-503217号公报)中记载的方法进行化学合成，可按照专利文献(日本特表平4-500303号公报、日本特开2001-69991号公报等)中记载的方法通过酶处理来制备。另外，也可使用askapharmaceuticalco.,ltd.(あすか製薬社)制、sigma-aldrich公司制、持田制药株式会社制等的孕酮的市售品。
作为本申请的生理性水溶液中的孕酮的浓度，不受特别限定，通常为1(μm)以上，优选为2(μm)以上，更优选为4(μm)以上，进一步优选为6(μm)以上。另外，从性价比、避免对人类精子带来不良影响的观点考虑，通常为100(μm)以下，优选60(μm)以下，更优选40(μm)以下，进一步优选20(μm)以下。
作为本申请的生理性水溶液中的pvp，只要是适合测定人类精子的运动速度、检测该精子尾部的弯曲状态的pvp即可，不受特别限定，可以是天然来源的pvp，也可以是人工合成的pvp。pvp可按照已知的方法例如专利文献(日本特开2008-255147号公报)中记载的方法进行合成。另外，也可使用sageivf公司制、jxenergy公司制、astec公司制、cookmedical公司制、origio公司制等的art用途的pvp市售品。
作为本申请的生理性水溶液中的pvp的浓度，不受特别限定，通常为1(％)以上，优选为2(％)以上，更优选为3(％)以上，进一步优选为4(％)以上。另外，从性价比、避免对人类精子带来不良影响的观点考虑，通常为15(％)以下，优选14(％)以下，更优选13(％)以下，进一步优选12(％)以下。
作为本申请的生理性水溶液涉及的生理性水溶液，为以使其渗透压与体液、细胞液的浸透压几乎相同的方式利用钠、钾等对盐、糖的浓度等进行调节的等渗水溶液即可，不受特别限定，具体而言，可举出含血清或无血清的培养液、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、tris缓冲生理盐水、hepes缓冲生理盐水、林格液(乳酸林格液、乙酸林格液、碳酸氢盐林格液等)、5％葡萄糖水溶液等。作为上述含血清的培养液，可举出含有0.1～30(v/v)％的血清(胎牛血清[fetalbovineserum；fbs]、小牛血清[calfbovineserum；cs]等)的动物细胞培养用培养液(dmem、emem、imdm、rpmi1640、αmem、f-12、f-10、m-199、aim-v、quinn’sadvantage卵裂培养液等)，另外，作为上述无血清培养液，可举出添加有适量(例如，1～30％)的市售的b27补充剂(-胰岛素)(lifetechnologies公司制)、n2补充剂(lifetechnologies公司制)、b27补充剂(lifetechnologies公司制)、knockout血清替代物(invitrogen公司制)等血清替代物的上述动物细胞培养用培养液等。
作为本申请的生理性水溶液，除了本申请的三种成分以外还可以含有任选成分。作为该任选成分，可举出例如透明质酸酶以外的蛋白质分解酶(例如，精虫头粒蛋白(acrosin)、弹性蛋白酶)、孕酮以外的激素(例如，雌激素、褪黑素)、pvp以外的水溶性高分子化合物(例如，聚乙二醇、甘油、透明质酸)、等渗剂(例如，葡萄糖、d-山梨糖醇、d-甘露糖醇、乳糖、氯化钠等)、螯合剂(例如，edta、egta、柠檬酸、水杨酸酯)、助溶剂、保存剂、抗氧化剂、氨基酸(例如，脯氨酸、谷氨酰胺)、蛋白质(例如，来自人类、牛等的血清或来源于血清的成分[白蛋白])等。本说明书中，所谓“任选成分”，是指可以含有也可以不含有的成分。
作为上述运动速度，例如，可举出选自由直线速度、曲线速度及平均路径速度组成的组中的1种或2种以上的速度，优选包括直线速度。此处，所谓“直线速度”，是指人类精子在本申请的生理性水溶液中从某处(a处)移动至另一处(b处)时每单位时间的从a处至b处的移动距离(参见图1的粗线)，另外，所谓“曲线速度”，是指每单位时间的从a处至b处的路程(参见图1的点线)，另外，所谓“平均路径速度”，是指每单位时间的从a处至b处的路径路程(日语为“進行方向性の道のり”)(参见图1的虚线)。
本申请的生理性水溶液中的人类y精子的运动速度比本申请的生理性水溶液中的人类x精子的运动速度更快。另外，本申请的生理性水溶液中的人类y精子的尾部弯曲程度小于本申请的生理性水溶液中的人类x精子的尾部弯曲程度，及/或本申请的生理性水溶液中的人类y精子的尾部鞭打频率小于本申请的生理性水溶液中的人类x精子的尾部鞭打频率。因此，作为本申请的筛选方法，优选包括下述比较工序的方法：所述工序是将本申请的生理性水溶液中的人类精子的运动速度的值和该精子的尾部弯曲程度的值及/或该精子的尾部鞭打频率的值与各自的对照值(为方便起见，有时也分别称为“对照值(i)”、“对照值(ii)”及“对照值(iii)”)进行比较的步骤，本申请的生理性水溶液中的人类精子的运动速度的值大于“对照值(i)”、且该人类精子的尾部弯曲程度的值小于“对照值(ii)”及/或该人类精子的尾部鞭打频率的值小于“对照值(iii)”时，表示该人类精子为y精子的可能性高。进而，作为本申请的筛选方法，优选包括下述工序的方法：将本申请的生理性水溶液中的人类精子的运动速度的值大于“对照值(i)”、且尾部弯曲程度的值小于“对照值(ii)”及/或尾部鞭打频率的值小于“对照值(iii)”的人类精子作为y精子进行分离。
作为上述“对照值(i)”，只要是用于判定(判断)本申请的生理性水溶液中的人类精子的运动速度是否大于本申请的生理性水溶液中的人类x精子的运动速度的指标(对照)值即可，例如，可举出基于本申请的生理性水溶液中的人类精子(x精子及y精子)的运动速度的平均值、本申请的生理性水溶液中的人类x精子的运动速度的平均值、本申请的生理性水溶液中的人类x精子及y精子的运动速度而利用roc曲线(其是使用统计分析软件得到的)等算出的阈值。
作为上述“对照值(ii)”，只要是用于判定(判断)本申请的生理性水溶液中的人类精子的尾部弯曲程度是否小于本申请的生理性水溶液中的人类x精子的尾部弯曲程度的指标(对照)值即可，例如，可举出基于本申请的生理性水溶液中的人类精子(x精子及y精子)的尾部弯曲程度的平均值、本申请的生理性水溶液中的人类x精子的尾部弯曲程度的平均值、本申请的生理性水溶液中的人类x精子及y精子的尾部弯曲程度而利用roc曲线(其是使用统计分析软件得到的)等算出的阈值。
作为上述“对照值(iii)”，只要是用于判定(判断)本申请的生理性水溶液中的人类精子的尾部鞭打频率是否小于本申请的生理性水溶液中的人类x精子的尾部鞭打频率的指标(对照)值即可，例如，可举出基于本申请的生理性水溶液中的人类精子(x精子及y精子)的尾部鞭打频率的平均值、本申请的生理性水溶液中的人类x精子的尾部鞭打频率的平均值、本申请的生理性水溶液中的人类x精子及y精子的尾部鞭打频率而利用roc曲线(其是使用统计分析软件得到的)等算出的阈值。
本申请的筛选方法中，也可以基于测得的运动速度，进一步测定前向性(直线速度/平均路径速度)的比值、直线性(直线速度/曲线速度)的比值，并基于这些值来判断本申请的生理性水溶液中的人类精子是否为y精子。
人类y精子的头部比人类x精子的头部小。因此，作为本申请的筛选方法，优选还包括下述工序的方法，所述工序为针对已测定本申请的生理性水溶液中的运动速度、且已检测精子尾部的弯曲状态的人类精子，进一步测定精子头部的大小，更优选还包括下述比较工序的方法，所述比较工序为将测得的人类精子的头部直径的值与对照值(以下为方便起见，有时也称为“对照值(iv)”)进行比较的步骤，且本申请的生理性水溶液中的人类精子的头部直径的值小于“对照值(iv)”时，表示该人类精子是y精子的可能性高。
作为上述“对照值(iv)”，只要是用于判定(判断)测定对象的人类精子的头部大小是否小于人类x精子的头部大小的指标(对照)值即可，例如，可举出基于人类精子(x精子及y精子)的头部直径的平均值、人类x精子的头部直径的平均值、人类x精子及y精子的头部直径而利用roc曲线(其是使用统计分析软件得到的)等算出的阈值。作为该阈值，例如，使用人类精子(x精子及y精子)的头部直径的平均值的情况下，例如为5.3(μm)、优选为5.2(μm)、更优选为5.1(μm)、进一步优选为5.0(μm)、更进一步优选为4.9(μm)、特别优选为4.8(μm)、特别更优选为4.7(μm)、最优选为4.6(μm)。
人类精子的运动速度、头部的大小可通过例如下述方法测定：使用精子运动分析装置(smas；spermmotilityanalysissystem)(ditect公司制)在显微镜下对人类精子进行实时观察，基于得到的图像数据，利用使用了计算机的图像分析软件进行测定。另外，人类精子尾部的弯曲状态可如下所述进行测定：在相位差显微镜上安装能够以每秒200格进行拍摄的高速摄像机，对拍摄得到的图像进行分析。
以下，通过实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例
根据who(世界卫生组织)的精子运动性基准(参见表1)，将符合a级及b级的人类精子移至含有40u/ml透明质酸酶(sageivf公司制)、10μm孕酮(sigma-aldrich公司制)及5％的pvp(jxenergy公司制)的培养液(含有5％的hsa[人血清白蛋白]的quinn’sadvantage卵裂培养液)(实施例1样品)中。需要说明的是，作为对照，将人类精子移至不含透明质酸酶、孕酮及pvp的培养液(比较例1样品)、含有40u/ml透明质酸酶的培养液(比较例2样品)、含有10μm孕酮的培养液(比较例3样品)、及含有5％的pvp的培养液(比较例4样品)中。
[表1]
使用精子运动分析装置(smas)(ditect公司制)对人类精子的运动速度进行了分析。结果显示，实施例1样品(参见图2的“4”)、比较例4样品(参见图2的“5”)中的人类精子与比较例1～3样品(参见图2的“1～3”)中的人类精子相比，运动速度(直线速度、曲线速度及平均路径速度)下降(参见图2a～c)、前向性及直线性上升(参见图2d及e)、头部侧摆幅值及头部鞭打频率减小(参见图2f及g)。
运动速度下降的实施例1样品及比较例4样品这二者适合进行运动速度更快的人类精子的筛选。接着，针对实施例1样品及比较例4样品中的人类精子中运动速度更快的精子，对尾部的弯曲状态进行了观察，结果观察到比较例4样品中的精子的尾部均是弯曲的，而在实施例1样品中的精子中，观察到尾部的弯曲程度更小、且尾部的鞭打频率更小的精子(尾部的波形呈大致直线状的人类精子)。筛选这样的人类精子，使用检测x精子及y精子的试剂盒“vysiscepxspectorumorange/yspectorumgreendirectlabeledfluorescentdnaprobekit”(abbott公司制)，按照制品附带的说明书进行fish分析，结果显示91.2±5.5％(571[y精子]/626[全部精子]，n＝40)是y精子(参见图3)。
另外，还发现上述筛选得到的y精子头部直径4.6(μm)(336个精子的平均值)小于来自比较例1样品的未经筛选的人类精子(x精子与y精子接近1:1)的头部直径5.3(μm)(251个精子的平均值)(参见图4)。另外，确认到实施例1样品中的y精子的直线速度的平均值为40(μm/秒)(n＝90)，比实施例1样品中的a级+b级的精子的直线速度的平均值(25.9[μm/秒])(参见图2a的“4”)更快。
以上结果表明，对含有透明质酸酶、孕酮及pvp的生理性水溶液中的人类精子中运动速度更快、且尾部弯曲程度更低、尾部鞭打频率更小的精子进行筛选时，该精子是y精子的概率高达大于90％。
产业上的可利用性
本发明在借助人工授精、体外受精、显微授精等的妊娠中有助于生育男婴。