本发明属于藻类生长繁殖技术领域，具体涉及用于研究藻类生长和繁殖的微流控芯片。
背景技术：
近年来水体富营养化后，绿潮和赤潮等藻类大规模爆发事件频发，已经是一个全球性的问题。大型海藻过度繁殖会引起的绿潮，绿潮严重时整个近海岸的海面全部被藻体覆盖，消耗水中的氧气，造成水体浮游动物和植物的死亡。并且可能形成沼泽地，产生h2s气体，对整个海洋的生态系统都造成严重伤害。另一方面，绿潮也会影响人们的近海岸活动，损害水产业，影响航运交通等。所以研究藻类爆发的机制来解决绿潮或者赤潮形成的环境问题十分重要。
已有的研究表明，有些能快速繁殖的藻类，主要是由于它有多种繁殖方式，包括有性繁殖、无性繁殖和营养繁殖。绿潮的主要形成藻浒苔，主要靠生殖细胞的无性繁殖得以大规模生长。几乎所有的浒苔细胞都可以转化成生殖细胞囊，一个孢子囊约产生8个孢子，一个配子囊约产生16个配子。据研究1cm2的浒苔（单面）约能产生106-107个孢子和配子，1g浒苔（鲜重）理论上能长成108-109个新藻体。两个异性配子可以结合成合子从而长成新的藻体，也可以和孢子一样通过无性繁殖长成新的藻体，并且孢子或配子在合适的条件下还能进行自我复制，分裂出大量个体。总之，一旦拥有合适的生长条件藻体就会爆发性增长。并且孢子或者配子相对于成熟藻体对环境的因素的变化更加敏感，更容易产生环境胁迫。所以研究藻类的生殖细胞对揭开绿潮或者赤潮的形成机理十分重要。
在对藻类生殖和生长做过的研究中还有一些问题需要解决优化：不能实现原位培养，培养基控制不精准；空间分辨率不能满足藻细胞或亚细胞结构形态变化（孢子或配子的分化，两个配子的结合过程等）的观察；不能实时观察藻体的生长状态；藻的生殖细胞不能自动分离。这些问题都有希望通过微流控解决。微流控芯片技术(microfluidics)是能把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。
目前藻类的研究方法局限于宏观研究方法，生殖细胞的产生释放机理尚未明确，所以爆发机制有待探究。微流控芯片已经广泛的应用到动物细胞的培养研究中，但很少应用到植物细胞领域。为此本发明设计了一种微流控芯片从微米尺度上研究藻类生长生殖。设计的芯片满足藻类生长，生殖细胞放散和捕获，及生殖细胞单独选择性培养的需要。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种可对流体精细操控，并且制作方法简单、通用性强的微观研究藻类生长和生殖的微流控芯片。
本发明提供的用于研究藻类生长和生殖的微流控芯片，以光学透明材料为基材，采用微流控连续灌注系统，从微观层面上实现藻类生殖细胞的自动分离，实时监测藻细胞一系列生长和生殖变化，解决了传统研究方法在营养液不均匀扩散和有害代谢物积累的问题。具体而言，就是利用微流控芯片的气压控制阀门控制藻体生长单元和生殖细胞捕获单元，使游离的生殖藻细胞进入生殖细胞捕获单元，从而实现单个生殖藻细胞的捕获和选择性培养。本发明可以将芯片置于相连了计算机和高速ccd的荧光倒置显微镜下，从而采集分析荧光强度的变化，试剂或者抗体与生殖细胞的特异性结合产生的光学信号都可被光敏器件阵列采集并传输到微处理器（计算机）中和标准品的数据库作比较，从而实现自动化检测。
本发明提供的用于研究藻类生长和生殖的微流控芯片，可以根据实际需要设置若干个平行模块(例如6-10等)，每个模块结构为三层：样品通道层、阀门控制层、基片层。基片层是整个微流控芯片的基底，用支撑阀门控制层和样品通道层；样品通道层用于容纳藻细胞及营养液，阀门控制层用于控制样品通道层液体的流动及藻类的运动；其中，样品通道层包括四个部分:样品进口、藻体生长观察腔室、生殖细胞捕获腔室、样品出口，四个部分依次串联；藻体生长观察腔室为高度为300-800μm、宽度为300-800μm的长方体，用于在线观察藻体生长情况，并为藻细胞的生长提供足够的空间，同时为生殖细胞放散口的形成提供足够空间距离；生殖细胞捕获腔室为高度为10-30μm、直径为50-150μm的圆柱形管道，用于自动分离、捕获生殖细胞；样品进口用于注入培养基，注入培养基采用注射器，自动进样器与装有培养基的注射器相连；样品出口与废液槽相连，用于排出废液。
本发明中，阀门控制层包括两个控制阀门，分别设置于生殖细胞捕获腔室的前后；两个控制阀门分别有阀门控制入口；通过气压泵或者电子元件控制阀门，进而控制藻体生长观察腔室和生殖细胞捕获腔室样品通道层的阀门开关。该阀门为半透阀，藻的生殖细胞（孢子和配子）不能通过，培养液体可以自由通过。
设生殖细胞捕获腔室后的阀门为第一阀门，生殖细胞捕获腔室前的阀门为第二阀门；当气压泵从阀门控制入口充入气体时，相应的阀门工作，此时液体可以自由通过，但藻体细胞不能通过。当第一阀门1工作，第二阀门2不工作时，藻体细胞释放的生殖孢子可以被生殖细胞捕获腔室捕获。当第二阀门2工作，第一阀门1不工作时，由样品出口注入培养液，可以实现藻体生殖细胞的单独培养。
本发明中，藻体生长观察腔室的高度和深度都比较大，为藻细胞的生长提供足够的空间，同时为生殖细胞放散口的形成提供足够空间距离。进样时，液体培养基携带释放出来的游离的生殖细胞进入生殖细胞捕获单元；生殖细胞在细胞捕获单元中呈点状分布，捕获到的游离的生殖细胞会很快在细胞捕获单元贴壁附着，因此生殖细胞能在细胞捕获单元被捕获。
本发明中，生殖细胞捕获腔室也可以作为生殖细胞单独培养单元。生殖细胞收集完毕后，从原出样口注入培养基，不同类型的培养基使藻体表现出不同的状态。藻的生殖细胞可能发展为新的丝状体、繁殖体、或者进行克隆式自我复制。本发明也可以对附着态的藻体生殖细胞进行多环芳烃或者重金属等环境胁迫，进而用荧光分析法实现藻体抗氧化酶的原位自动化检测。
本发明中，微流控芯片的基材为具有柔韧性的光学透明材料，包括：聚二甲基硅氧烷聚合物（pdms）；硬质高分子聚合物：聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基苯烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚丙烯；无机材料：石英、玻璃。模具材料为硅片。
本发明还提供微流控芯片的制作方法，具体步骤如下：
（1）基片准备：单晶硅片用piranha溶液清洗去氧化，用氮气吹干后，用az50xt系列正胶经旋涂机甩胶后，在恒温加热板上软烘，使光刻胶固化；
（2）曝光显影：将样品管道层和阀门控制层的掩膜放置在甩涂好的基片上，经过紫外曝光机曝光后，置于正胶显影液中显影；
（3）二次曝光：将显影后的硅片，用su-82150系列经旋涂机甩胶后，在恒温加热板上软烘，使光刻胶固化。然后对藻体观察腔室进行二次曝光，置于加热板上后烘固化；
（4）将曝光烘焙后的硅片置于负胶显影液中显影，用异丙醇检验显影完毕，氮气吹干；
（5）硬烘：硅片置于加热板上加热固定；
（6）浇注：将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂按5:1和20:1分别混匀，倒在相应的模具上，在烘箱内固化剥离；
（7）键合：将阀门层与样品管道层校准键合后形成微通道腔，再与基片层键合。
本发明还提供的上述微流控过滤芯片的使用方法，具体步骤如下：
（1）从藻体母本中挑取少量的藻体作为实验样本，确保藻体细胞处于相同的生长状态，体细胞中没有形成孢子囊和配子囊；
（2）切取藻体顶端的片段约200μm-500μm，将切去后的藻体片段植入微流控芯片的藻类观察区域；
（3）藻体样本植入成功后，将样品进口与装入了培养基的注射器相连，样品出口与废液槽相连；
（4）将芯片置于连接了计算机和高速ccd的倒置显微镜下，将装有培养基的注射器与自动进样器相连接，进样速度为25μl/l-60μl/l，通过气压泵控制捕获腔室两端的气动阀门的开关与闭合，从而捕获藻体生殖细胞。
当单独研究生殖细胞时，将原来的出样口改成进样口，原来的进样口改成出样口，进样速度约为25μl/l-60μl/l，注入不同的培养基或者进行不同的环境胁迫，从而实现生殖细胞的单独培养，单独培养后用荧光检测法对藻体生殖细胞抗氧化酶进行原位检测。
本发明设计了一个生殖细胞捕获芯片，具有藻体生长观察腔室和生殖细胞捕获腔室，并将该芯片与自动进样器、荧光成像系统组成了一个基于微流控技术的藻体细胞自动培养及监测体系。该体系采用微流控连续灌注系统，使细胞处于营养丰富的状态，提高了藻体细胞的生长速率，并且最大程度避免了藻细胞生长周期内的人为操作，实现了藻体长时间自动实时监控记录。本发明提供的微流控芯片具有对流体精细操控的优势，并且制作方法简单，通用性强，可与各种设计结合使用。
上述微流控滤芯可用于藻体在线观察、藻体生殖细胞分离、藻体生殖细胞单独培养等领域。
附图说明
图1为用于研究藻类生长和生殖的微流控芯片的三层结构图。管道层由高度不同的微腔室组成，藻体观察腔室的高度高于生殖细胞捕获腔室，藻体细胞在生殖细胞捕获腔室中只能以单层细胞形式排列。在生殖捕获腔室两侧各有一个气动阀门，通过气压泵控制阀门，可以实现生殖细胞的捕获和单独培养。
图2为用于研究藻类生长和生殖的微流控芯片的平面图。当气压泵从阀门控制入口充入气体时，相应的阀门工作，此时液体可以自由通过，但藻体细胞不能通过。当阀门1工作，阀门2不工作时，藻体细胞释放的生殖孢子可以被生殖细胞捕获腔室捕获。当阀门2工作，阀门1不工作时，由样品出口注入培养液，可以实现藻体生殖细胞的单独培养。
具体实施方式
（1）基片准备：单晶硅片放在piranha溶液（98%浓硫酸：30%双氧水）清洗15min去氧化，用去离子水冲洗干净后氮气吹干，并在200℃烘焙30min。
（2）甩胶：将准备好的基片高压吸附旋涂机（spin-coaterkw-4a，chemattechnology，inc.）旋涂位置，用az50xt系列胶倒在基片中央，2000r/min旋转2min，静置10min减少硅片表面的气泡。
（3）前烘：将涂好胶的硅片依次置于65℃、90℃和65℃的加热板上烘烤2min、7min和2min。
（4）曝光：将样品管道层和阀门控制层的掩膜放置在甩涂好的基片上，用紫外曝光机曝光。
（5）显影：显影在通风橱中进行，将硅片置于正胶显影液中，先在1/3浓度的显影液中显影至硅片外围的胶往里收缩，然后放置1/5浓度的显影液完毕。用去离子水冲洗干净，氮气吹干。
（6）二次曝光：样品通道层基片经第一次曝光后，用su-82150系列经旋涂机甩胶后，在恒温加热板上软烘，使光刻胶固化。用藻体观察单元的掩膜对其原管道，进行二次曝光。
（7）后烘：将硅片依次在65℃和95摄氏度加热板上后烘2min和5min，冷却至室温。
（8）同样在通风橱中用负胶显影液（主要成分是丙二醇甲醚醋酸酯pgmea）显影，用异丙醇检验显影完毕，氮气吹干。
（9）硬烘：样品通道层硅片置于加热板上120℃加热固定。
（10）pdms聚合物浇注：将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂按5:1混合均匀，倒在经三氯基氯硅烷处理过的样品通道层的硅片上，真空泵除尽气泡后，置于80℃烘箱里烘烤1h固化。
（11）阀门层和玻片基底层：将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂按20:1混合均匀，分别倒在阀门硅片和玻片上，用2000r/min在旋涂机上甩胶1min，然后80℃烘箱里烘烤1h固化。
键合及制作：将样品通道层与阀门层芯片与硅片剥离，将阀门层与样品管道层校准键合后形成微通道腔，在80℃烘箱里烘烤1h使之紧密键合在一起。打孔后再与玻片层键合，最后烘箱80℃过夜固化。
把切取好的藻体样品用注射泵灌注到芯片的藻体观察腔室里，芯片的进样口连接进样器灌注不同的样品溶液。释放出来的生殖细胞随着液体进入生殖细胞捕获腔室。通过气压控制阀门的开关，将生殖细胞捕获在腔室里。生殖细胞捕获完毕后，停止进样，从原出样口灌注特定的样品溶液，对生殖细胞的做单独的环境胁迫探究。并且采用荧光分析法分析生殖细胞抗氧化酶活性的变化。