本发明涉及法医学技术领域，具体涉及一种用于鉴定人体液的组织来源的mirnas复合扩增体系及其专用引物组合。
背景技术：
人体液(如静脉血、精液、月经血、阴道分泌物、唾液、尿液和汗液等)是法医鉴定各类案件中涉及较多的生物检材，鉴定人体液的组织来源可为刑事侦查提供有力的证据。传统的鉴定体液的组织来源主要是基于酶促反应和免疫学检测，这种方法由于种属或组织特异性的限制，大部分实验均为假定实验和确证实验。此外，对于阴道分泌物、月经血及汗液的鉴定都是不确定的。随着分子生物学领域的不断发展，越来越多的基于分子领域的检测技术被用于鉴定体液的组织来源。大量mrna标记被成功用于静脉血、唾液、精液、阴道分泌物、尿液及汗液的组织来源的鉴定。xu等(xuy，xiej，caoy，etal.developmentofhighlysensitiveandspecificmrnamultiplexsystem(xcyr1)forforensichumanbodyfluidsandtissuesidentificantion[j].plosone，2014，9：e100123.)建立了针对静脉血、尿液、汗液等10种体液，由16个mrna位点组成的复合体系进行体液鉴定。宋凤(宋凤.法医学体液斑鉴定的rna标记研究[d].四川：四川大学，2016.)通过逆转录-终点法pcr建立的19个mrna位点的荧光复合体系在静脉血、精液、唾液、阴道分泌物及月经血五种体液样本中均获得了检测结果。
然而，mrna受湿度、紫外光、温度及环境影响易降解的特点限制了其在法医学体液来源鉴定领域的应用范围。mirna是一类广泛存在于真核细胞中约由18-24个核酸组成的内源性非编码小分子rna，在多数生物进程中扮演十分重要的调节作用，其具有组织特异性、分子小、拷贝数高且不易降解的特点，即使在极端温度、强酸、强碱条件下其含量和分子结构均无明显变化，满足检测降解检材的需求，成为继mrna之后的用于解决法医学关注的热点；但其拷贝数高、分子量小的特点，使得其检测难度较大。
目前，基于mirnas进行的体液鉴定研究主要运用荧光定量pcr技术(qpcr)检测mirnas在各体液中的表达差异，并借助统计学方法对结果进行分析。受到检测方法的局限，qpcr需针对每个目标基因进行逆转录或扩增反应。这不仅会消耗大量的检材和试剂，而且会加剧在反应过程中的可能性，对于结果判定造成混淆。荧光毛细管电泳可通过一个反应对多种体液的多个mirna进行扩增和检测，从而用于体液鉴定。vandermeer等(vandermeerd，uchimotoml，williamsg.simultaneousanalysisofmicro-rnaanddnafordeterminingthebodyfluidoriginofdnaprofiles[j].journalofforensicsciences，2013，58(4):967-971.)和li等(liy，zhangj，weiw，etal.astrategyforco-analysisofmicrornasanddna[j].forensicscienceinternational：genetics，2014，12:24-29.)研究了可同时获取dna分型结果和体液鉴定结果的dna和mirna共提取分析方法，且在全部检测样本中，均得到完整的dna分型结果和mirna标记的特征峰。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定人体液的组织来源。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了引物组合，可包括引物组合甲和引物组合乙：
所述引物组合甲可包括引物21、引物22、引物23、引物24、引物25、引物26、引物27、引物28、引物31、引物32、引物33、引物34、引物35、引物36、引物37和引物38；
所述引物21可为如下a1)或a2)：
a1)序列表中的序列21所示的单链dna分子；
a2)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的dna分子；
所述引物22可为如下a3)或a4)：
a3)序列表中的序列22所示的单链dna分子；
a4)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的dna分子；
所述引物23可为如下a5)或a6)：
a5)序列表中的序列23所示的单链dna分子；
a6)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的dna分子；
所述引物24可为如下a7)或a8)：
a7)序列表中的序列24所示的单链dna分子；
a8)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的dna分子；
所述引物25可为如下a9)或a10)：
a9)序列表中的序列25所示的单链dna分子；
a10)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的dna分子；
所述引物26可为如下a11)或a12)：
a11)序列表中的序列26所示的单链dna分子；
a12)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的dna分子；
所述引物27可为如下a13)或a14)：
a13)序列表中的序列27所示的单链dna分子；
a14)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的dna分子；
所述引物28可为如下a15)或a16)：
a15)序列表中的序列28所示的单链dna分子；
a16)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的dna分子；
所述引物31可为如下a17)或a18)：
a17)序列表中的序列31所示的单链dna分子；
a18)将序列31经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列31具有相同功能的dna分子；
所述引物32可为如下a19)或a20)：
a19)序列表中的序列32所示的单链dna分子；
a20)将序列32经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列32具有相同功能的dna分子；
所述引物33可为如下a21)或a22)：
a21)序列表中的序列33所示的单链dna分子；
a22)将序列33经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列33具有相同功能的dna分子；
所述引物34可为如下a23)或a24)：
a23)序列表中的序列34所示的单链dna分子；
a24)将序列34经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列34具有相同功能的dna分子；
所述引物35可为如下a25)或a26)：
a25)序列表中的序列35所示的单链dna分子；
a26)将序列35经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列35具有相同功能的dna分子；
所述引物36可为如下a27)或a28)：
a27)序列表中的序列36所示的单链dna分子；
a28)将序列36经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列36具有相同功能的dna分子；
所述引物37可为如下a29)或a30)：
a29)序列表中的序列37所示的单链dna分子；
a30)将序列37经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列37具有相同功能的dna分子；
所述引物38可为如下a31)或a32)：
a31)序列表中的序列38所示的单链dna分子；
a32)将序列38经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列38具有相同功能的dna分子；
所述引物组合乙可包括引物11、引物12、引物13、引物14、引物16、引物17、引物18和引物19；
所述引物11可为如下b1)或b2)：
b1)序列表中的序列11所示的单链dna分子；
b2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的dna分子；
所述引物12可为如下b3)或b4)：
b3)序列表中的序列12所示的单链dna分子；
b4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的dna分子；
所述引物13可为如下b5)或b6)：
b5)序列表中的序列13所示的单链dna分子；
b6)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的dna分子；
所述引物14可为如下b7)或b8)：
b7)序列表中的序列14所示的单链dna分子；
b8)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的dna分子；
所述引物16可为如下b11)或b12)：
b11)序列表中的序列16所示的单链dna分子；
b12)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的dna分子；
所述引物17可为如下b13)或b14)：
b13)序列表中的序列17所示的单链dna分子；
b14)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的dna分子；
所述引物18可为如下b15)或b16)：
b15)序列表中的序列18所示的单链dna分子；
b16)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的dna分子；
所述引物19可为如下b17)或b18)：
b17)序列表中的序列19所示的单链dna分子；
b18)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的dna分子。
上述任一所述引物组合甲还可包括引物29、引物30、引物39和引物40；
所述引物29可为如下a33)或a34)：
a33)序列表中的序列29所示的单链dna分子；
a34)将序列29经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列29具有相同功能的dna分子；
所述引物30可为如下a35)或a36)：
a35)序列表中的序列30所示的单链dna分子；
a36)将序列30经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列30具有相同功能的dna分子；
所述引物39可为如下a37)或a38)：
a37)序列表中的序列39所示的单链dna分子；
a38)将序列39经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列39具有相同功能的dna分子；
所述引物40可为如下a39)或a40)：
a39)序列表中的序列40所示的单链dna分子；
a40)将序列40经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列40具有相同功能的dna分子。
上述任一所述引物组合乙还可包括引物15和引物20；
所述引物15可为如下b9)或b10)：
b9)序列表中的序列15所示的单链dna分子；
b10)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的dna分子；
所述引物20可为如下b19)或b20)：
b19)序列表中的序列20所示的单链dna分子；
b20)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的dna分子。
所述引物组合甲具体可由所述引物21、所述引物22、所述引物23、所述引物24、所述引物25、所述引物26、所述引物27、所述引物28、所述引物31、所述引物32、所述引物33、所述引物34、所述引物35、所述引物36、所述引物37和所述引物38组成。
所述引物组合乙具体可由所述引物11、所述引物12、所述引物13、所述引物14、所述引物16、所述引物17、所述引物18和所述引物19组成。
所述引物组合甲具体可由所述引物21、所述引物22、所述引物23、所述引物24、所述引物25、所述引物26、所述引物27、所述引物28、所述引物29、所述引物30、所述引物31、所述引物32、所述引物33、所述引物34、所述引物35、所述引物36、所述引物37、所述引物38、所述引物39和所述引物40组成。
所述引物组合乙具体可由所述引物11、所述引物12、所述引物13、所述引物14、所述引物15、所述引物16、所述引物17、所述引物18、所述引物19和所述引物20组成。
所述引物组合具体由所述引物组合甲和所述引物组合乙组成。
上述任一所述引物组合甲中，所述引物21、所述引物23、所述引物25、所述引物27、所述引物29、所述引物31、所述引物33、所述引物35、所述引物37和所述引物39均可用荧光标记。
上述任一所述引物组合甲中，所述引物21、所述引物23、所述引物25、所述引物27、所述引物29、所述引物31、所述引物33、所述引物35、所述引物37和所述引物39的5’末端具体可用fam标记。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种mirnas复合扩增体系。
本发明所提供的mirnas复合扩增体系，可包括mirnas复合扩增体系甲和mirnas复合扩增体系乙；
所述mirnas复合扩增体系甲可包括上述任一所述所述引物组合甲；
所述mirnas复合扩增体系乙可包括上述任一所述引物组合乙中的引物11、引物12、引物13、引物14、引物15、引物16、引物17、引物18、引物19或引物20。
所述mirnas复合扩增体系甲中，所述引物21和所述引物22在mirnas复合扩增体系甲中的浓度可为0.138μm。所述引物23和所述引物24在mirnas复合扩增体系甲中的浓度可为0.036μm。所述引物25和所述引物26在mirnas复合扩增体系甲中的浓度可为0.042μm。所述引物27和所述引物28在mirnas复合扩增体系甲中的浓度可为0.084μm。所述引物29和所述引物30在mirnas复合扩增体系甲中的浓度可为0.240μm。所述引物31和所述引物32在mirnas复合扩增体系甲中的浓度可为0.288μm。所述引物33和所述引物34在mirnas复合扩增体系甲中的浓度可为0.036μm。所述引物35和所述引物36在mirnas复合扩增体系甲中的浓度可为0.120μm。所述引物37和所述引物38在mirnas复合扩增体系甲中的浓度可为0.300μm。所述引物39和所述引物40在mirnas复合扩增体系甲中的浓度可为0.066μm。
所述mirnas复合扩增体系乙中，所述引物11、所述引物12、所述引物13、所述引物14、所述引物15、所述引物16、所述引物17、所述引物18、所述引物19或所述引物20的浓度具体可为0.85μm。
所述mirnas复合扩增体系甲还可包括进行pcr扩增反应所需的试剂；所述“进行pcr扩增反应所需的试剂”不包括pcr扩增反应所需的引物。
所述mirnas复合扩增体系甲具体可由上述任一所述所述引物组合甲组成。
所述mirnas复合扩增体系甲具体可由上述任一所述所述引物组合甲和进行pcr扩增反应所需的试剂组成。
所述mirnas复合扩增体系乙具体可由所述引物11、所述引物12、所述引物13、所述引物14、所述引物15、所述引物16、所述引物17、所述引物18、所述引物19或所述引物20组成。
本发明还保护含有上述任一所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒可用于鉴定人体液的组织来源。
本发明还保护上述任一所述mirnas复合扩增体系或上述任一所述试剂盒的制备方法。所述制备方法可包括将上述任一所述引物组合中的各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护x1)或x2)：
x1)上述任一所述引物组合、或、上述任一所述mirnas复合扩增体系，在制备用于鉴定人体液的组织来源的试剂盒中的应用；
x2)上述任一所述引物组合、或、上述任一所述mirnas复合扩增体系，在鉴定人体液的组织来源中的应用。
本发明还保护一种鉴定待测体液的组织来源的方法，依次可包括如下步骤：
(1)以待测体液的总rna为模板，分别采用上述任一所述引物组合乙的各个引物进行逆转录，得到待测体液的cdna；
(2)完成步骤(1)后，分别以所述待测体液的cdna为模板，采用上述任一所述引物组合甲进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
(3)完成步骤(2)后，将pcr扩增产物进行毛细管电泳检测，分析检测结果并进行如下判断：
如果采用引物12、引物16和引物17进行逆转录的后续产物的峰值均在3000-7000rfu之间，则待测体液为静脉血；
如果采用引物13、引物17和引物18进行逆转录的后续产物的峰值均在1000-7000rfu之间，则待测体液为精液；
如果采用引物17和引物19进行逆转录的后续产物的峰值均在600-3000rfu之间，且采用引物11、引物12或引物14进行逆转录的后续产物的峰值均不在600-3000rfu之间，则待测体液为阴道分泌物；
如果采用引物12、引物14、引物17和引物19进行逆转录的后续产物的峰值均在600-7000rfu之间，且采用引物11进行逆转录的后续产物的峰值均不在600-7000rfu之间，则待测体液为唾液；
如果采用引物11、引物12、引物14、引物17和引物19进行逆转录的后续产物的峰值均在800-7000rfu之间，则待测体液为月经血。
上述任一所述组织来源可为静脉血、精液、阴道分泌物、唾液或月经血。
上文中，所述引物11、所述引物21和所述引物22根据mir214设计，mir214的核苷酸序列如序列表中序列1所示。所述引物12、所述引物23和所述引物24根据mir451a设计，mir451a的核苷酸序列如序列表中序列2所示。所述引物13、所述引物25和所述引物26根据mir888-5p设计，mir888-5p的核苷酸序列如序列表中序列3所示。所述引物14、所述引物27和所述引物28根据mir205-5p设计，mir205-5p的核苷酸序列如序列表中序列4所示。所述引物15、所述引物29和所述引物30根据mir124-3p设计，mir124-3p的核苷酸序列如序列表中序列5所示。所述引物16、所述引物31和所述引物32根据mir144-5p设计，mir144-5p的核苷酸序列如序列表中序列6所示。所述引物17、所述引物33和所述引物34根据mir144-3p设计，mir144-3p的核苷酸序列如序列表中序列7所示。所述引物18、所述引物35和所述引物36根据mir891a-5p设计，mir891a-5p的核苷酸序列如序列表中序列8所示。所述引物19、所述引物37和所述引物38根据mir203-3p设计，mir203-3p的核苷酸序列如序列表中序列9所示。所述引物20、所述引物39和所述引物40根据mir654-5p设计，mir654-5p的核苷酸序列如序列表中序列10所示。
实验证明，采用本发明提供的mirnas复合扩增体系可以有效的鉴定人体液的组织来源，大大提高了鉴定刑侦现场体液或其斑迹的组织来源的科学性和准确性，能为明确案件性质、确定犯罪嫌疑人以及定罪量刑等提供准确的科学依据。本发明具有重大应用价值。
附图说明
图1为10种标准mirna的分型图谱。
图2为灵敏度测试图谱。
图3为部分静脉血样本的毛细管电泳检测结果。
图4为部分精液样本的毛细管电泳检测结果。
图5为部分月经血样本的毛细管电泳检测结果。
图6为部分唾液样本的毛细管电泳检测结果。
图7为部分阴道分泌物样本的毛细管电泳检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
mirneasyminikit为德国qiagen公司的产品。turbodna-freetmkit为美国ambion的产品。nd-2000分光光度计为英国thermofisher公司的产品。dntpmixture(10mm)和rnase-freewater均为takara公司的产品。5×first-strandbuffer、dtt(0.1m)和m-mlvreversetranscriptase(200units/μl)均为invitrogen公司的产品。recombinant
逆转录引物由生工生物工程(北京)股份有限公司合成，采用page方式纯化。
pcr引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，采用hplc方式纯化。
实施例1、标准mirna的分型图谱的获得
一、标准mirna的合成
10个标准mirna均由宝生物工程(大连)有限公司合成，采用hplc方式纯化。10个标准mirna的名称和核苷酸序列如表1所示。
表1
二、标准mirna的cdna的获得
分别以10个标准mirna为模板，采用表2中相应的逆转录引物(逆转录引物名称由其标准mirna的名称和“-rt”构成)进行逆转录，得到相应的cdna。逆转录反应在pcr仪上进行。
表2
逆转录反应体系为20μl，由2μldntpmixture(10mm)、2.5μl5×first-strandbuffer、1μldtt(0.1m)、2μlm-mlvreversetranscriptase(200units/μl)、0.2μlrecombinant
逆转录反应条件：37℃60min，70℃5min，4℃保存。
三、复合扩增
分别以10个标准mirna的cdna或rnase-freewater(阴性对照)为模板，采用复合引物(由表3第2列所示的各个pcr引物组成)进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。理论上各个pcr扩增产物的大小如表3中第3列所示。pcr扩增反应在pcr仪上进行。
pcr反应体系为10μl，由4μl2.5×mastermix(公安部物证鉴定中心公司的产品)、0.1μl标准mirna的cdna(含5ngdna)、1μl复合引物和4.9μlrnase-freewater组成。各个pcr引物在pcr反应体系中的浓度如表3中第4列所示。
pcr反应条件：95℃预变性7min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。
表3
注：fam为fam荧光标记。
四、毛细管电泳检测
1、将1μlpcr扩增产物、0.26μltyper500内标和8.74μlhi-di甲酰胺混合，得到反应体系。
2、完成步骤1后，取反应体系，95℃变性5min，迅速转移至-20℃放置5min，然后用abi-3130遗传分析仪进行毛细管电泳检测，采用genemapperidv3.2软件进行毛细管电泳数据收集和分析。电泳条件：进样时间10s，进样电压1kv，运行电压13.4kv，温度60℃，运行时间15min。
实验结果见图1。结果表明，10个标准mirna均成功检出，峰值在5000－8000rfu之间；10个标准mirna的出峰位置与表3中第3列理论计算的扩增产物大小完全一致，未出现非特异性峰。
实施例2、灵敏度测试
一、复合扩增
分别以实施例1步骤二制备的10个标准mirna的cdna为模板，采用复合引物(由表3第2列所示的各个pcr引物组成)进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
pcr反应体系为10μl，由4μl2.5×mastermix、0.1μl标准mirna的cdna(含100ngdna、10ngdna、1ngdna、0.1ngdna、0.01ngdna或0.001ngdna)、1μl复合引物和4.9μlrnase-freewater组成。各个pcr引物在pcr反应体系中的浓度如表3中第4列所示。
pcr反应条件：95℃预变性7min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。
四、毛细管电泳检测
1、将1μlpcr扩增产物、0.26μltyper500内标和8.74μlhi-di甲酰胺混合，得到反应体系。
2、完成步骤1后，取反应体系，95℃变性5min，迅速转移至-20℃放置5min，然后用abi-3130遗传分析仪进行毛细管电泳检测，采用genemapperidv3.2软件进行毛细管电泳数据收集和分析。电泳条件：进样时间10s，进样电压1kv，运行电压13.4kv，温度60℃，运行时间15min。
如果10个标准mirna的cdna均检出且峰值在5000－8000rfu之间，表明pcr反应体系中的相应标准mirna的cdna的含量可以被检测出来。如果10个标准mirna的cdna没有检出(如发生丢失)，表明pcr反应体系中的相应标准mirna的cdna的含量不能被检测出来。
实验结果见图2。结果表明，检测10个标准mirna的cdna的灵敏度均为1ng/反应体系。
实施例3、基于10种mirna的分型图谱鉴定人体液的组织来源
一、样本采集
遵照知情同意原则，从无关健康个体处收集50个样本，其中静脉血样本、精液样本、唾液样本、月经血样本和阴道分泌物样本各10个。静脉血样本为无关健康个体将通过肘静脉穿刺抽取的血液收集在离心管中获得(每个样本50μl)。精液样本为无关健康个体将新鲜精液收集在无菌塑料杯中获得。唾液样本为将无关健康个体自然流出的口腔液体收集在离心管中获得。月经血样本为无关健康个体用无菌棉签在月经周期的第2d或第3d采集。阴道分泌物样本为无关健康个体用医用无菌棉签在月经周期的第8d至第28d内的阴道内擦拭取得。
50个样本均保存于-80℃。
二、cdna的获得
1、采用mirneasyminikit分别提取50个样本的totalrna，然后采用turbodna-freetmkit进行纯化(目的为去除基因组dna)，得到50个样本的totalrna。
2、完成步骤1后，分别取(少量)50个样本的totalrna进行琼脂糖凝胶电泳(目的为检测50个样本的totalrna的完整性)。
3、完成步骤2后，取50个样本的totalrna，使用nd-2000分光光度计进行定量。定量结果见表4。
表4
4、完成步骤3后，分别以50个样本的totalrna为模板，采用表2中相应的逆转录引物进行逆转录，得到相应的cdna。逆转录反应在pcr仪上进行。
反应体系为20μl，由2μldntpmixture(10mm)、2.5μl5×first-strandbuffer、1μldtt(0.1m)、2μlm-mlvreversetranscriptase(200units/μl)、0.2μlrecombinant
逆转录的反应条件：37℃60min，70℃5min，4℃保存。
三、复合扩增
分别以50个样本的cdna或rnase-freewater(阴性对照)为模板，采用复合引物(由表3第2列所示的各个pcr引物组成)进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。理论上各个pcr扩增产物的大小如表3中第3列所示。pcr扩增反应在pcr仪上进行。
pcr反应体系为10μl，由4μl2.5×mastermix、0.5μl样本的cdna(含50ngdna)、3μl复合引物和2.5μlrnase-freewater组成。各个pcr引物在pcr反应体系中的浓度如表3中第5列所示。
pcr反应条件：95℃预变性7min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。
四、毛细管电泳检测
1、将1μlpcr扩增产物、0.26μltyper500内标和8.74μlhi-di甲酰胺混合，得到反应体系。
2、完成步骤1后，取反应体系，95℃变性5min，迅速转移至-20℃放置5min，然后用abi-3130遗传分析仪进行毛细管电泳检测，采用genemapperidv3.2软件进行毛细管电泳数据收集和分析。电泳条件：进样时间10s，进样电压1kv，运行电压13.4kv，温度60℃，运行时间15min。
部分静脉血样本的毛细管电泳检测结果见图3。部分精液样本的毛细管电泳检测结果见图4。部分月经血样本的毛细管电泳检测结果见图5。部分唾液样本的毛细管电泳检测结果见图6。部分阴道分泌物样本的毛细管电泳检测结果见图7。
参考实施例1中10个标准mirna的峰形位置分析体液样本的检测结果。各类体液的10个不同个体的检出结果峰形相同，因此可运用分型结果来判断待测体液样本的类型：
如果待测体液样本中mir451a、mir144-3p和mir144-5p的峰值均在3000－7000rfu之间，则待测体液样本为静脉血样本；
如果待测体液样本中mir888-5p、mir144-3p和mir891a-5p的峰值均在1000－7000rfu之间，则待测体液样本为精液样本；
如果待测体液样本中mir214、mir451a、mir144-3p、mir205-5p和mir203-3p的峰值均在800－7000rfu之间，则待测体液样本为月经血样本；
如果待测体液样本中mir451a、mir144-3p、mir205-5p和mir203-3p的峰值均在600－7000rfu之间，则待测体液样本为唾液样本；
如果待测体液样本中mir144-3p和mir203-3p的峰值均在600-3000rfu之间，则待测体液样本为阴道分泌物样本。
<110>公安部物证鉴定中心
<120>一种用于鉴定人体液的组织来源的mirnas复合扩增体系及其专用引物组合
<160>40
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>22
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
acagcaggcacagacaggcagu22
<210>2
<211>22
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
aaaccguuaccauuacugaguu22
<210>3
<211>21
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
uacucaaaaagcugucaguca21
<210>4
<211>22
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
uccuucauuccaccggagucug22
<210>5
<211>20
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
uaaggcacgcggugaaugcc20
<210>6
<211>22
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
ggauaucaucauauacuguaag22
<210>7
<211>20
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
uacaguauagaugauguacu20
<210>8
<211>22
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
ugcaacgaaccugagccacuga22
<210>9
<211>22
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
gugaaauguuuaggaccacuag22
<210>10
<211>22
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
uggugggccgcagaacaugugc22
<210>11
<211>50
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
gtcgtataaagtgcagcctccgaggtattcgcactggatacgacactgcc50
<210>12
<211>50
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>12
gtcgtataaagtgcagcctccgaggtattcgcactggatacgacaactca50
<210>13
<211>50
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>13
gtcgtataaagtgcagcctccgaggtattcgcactggatacgactgactg50
<210>14
<211>50
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>14
gtcgtataaagtgcagcctccgaggtattcgcactggatacgaccagact50
<210>15
<211>50
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>15
gtcgtataaagtgcagcctccgaggtattcgcactggatacgacggcatt50
<210>16
<211>50
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>16
gtcgtataaagtgcagcctccgaggtattcgcactggatacgaccttaca50
<210>17
<211>50
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>17
gtcgtataaagtgcagcctccgaggtattcgcactggatacgacagtaca50
<210>18
<211>50
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>18
gtcgtataaagtgcagcctccgaggtattcgcactggatacgactcagtg50
<210>19
<211>50
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>19
gtcgtataaagtgcagcctccgaggtattcgcactggatacgacctagtg50
<210>20
<211>50
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>20
gtcgtataaagtgcagcctccgaggtattcgcactggatacgacgcacat50
<210>21
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>21
gatcttcttaaacttaaacttaaatatccagtgcagggtc40
<210>22
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>22
gttcttctacagcaggcacagacaccgtca30
<210>23
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>23
gatcttcttaaacttaaacttaaatatccagtgcagggtc40
<210>24
<211>35
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>24
gttcttctttttcaaaccgttaccattacactcaa35
<210>25
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>25
gatcttcttaaacttaaacttaaatatccagtgcagggtc40
<210>26
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>26
gttcttctttttcttttttactcaaaaagctgtgtcagt39
<210>27
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>27
gatcttcttaaacttaaacttaaatatccagtgcagggtc40
<210>28
<211>53
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>28
gttcttctttttctttttctttttctttttctccttcattccaccggtcagac53
<210>29
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>29
gatcttcttaaacttaaacttaaatatccagtgcagggtc40
<210>30
<211>57
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>30
gttcttctttttctttttctttttctttttctttttctaaggcacgcggtgttacgg57
<210>31
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>31
gatcttcttaaacttaaacttaaatatccagtgcagggtc40
<210>32
<211>65
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>32
gttcttctttttctttttctttttctttttctttttctttttcggatatcatcatataca60
cattc65
<210>33
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>33
gatcttcttaaacttaaacttaaatatccagtgcagggtc40
<210>34
<211>49
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>34
gttcttctttttctttttctttttacagtatagatgatgtactacatga49
<210>35
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>35
gatcttcttaaacttaaacttaaatatccagtgcagggtc40
<210>36
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>36
gttcttctttttctttttctttttgcaacgaacctgagcgtgact45
<210>37
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>37
gatcttcttaaacttaaacttaaatatccagtgcagggtc40
<210>38
<211>69
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>38
gttcttctttttctttttctttttctttttctttttctttttcttttgtgaaatgtttag60
gacgtgatc69
<210>39
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>39
gatcttcttaaacttaaacttaaatatccagtgcagggtc40
<210>40
<211>61
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>40
gttcttctttttctttttctttttctttttctttttctttggtgggccgcagaactacac60
g61