水稻叶绿体发育调控基因OsFLN1及其用途的制作方法

文档序号：15403470发布日期：2018-09-11 18:11阅读：520来源：国知局

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用生物信息学电子克隆水稻osfln1基因，以及利用基因组编辑实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因研究对水稻叶绿体发育的影响，可用以解决杂交稻育种过程中杂种的剔除，提高种子的纯度，也可以通过调整叶绿体发育进而影响水稻净光合速率及产量。

背景技术：

光合作用为水稻的生长提供了物质来源和能量来源，叶绿体是进行光合作用的重要场所，同时也是光合色素的载体，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。高等植物叶绿体的发育需经过一系列复杂的变化过程，需要细胞核基因编码的蛋白和叶绿体编码的蛋白协调参与完成。在黑暗条件中，叶片中非光合作用的前质体发育成黄化质，黄化质体中含有晶格状的原片层，经光照黄化质体不断分化发育形成叶绿体。目前发现的水稻白化突变体通常与叶绿体的发育缺陷相关，进而影响水稻光合作用，造成水稻减产甚至死亡。水稻叶色白化的根本原因是细胞核或细胞质中遗传基因突变，目前已分离出多个与水稻白化相关的基因，目前发现最多的是三角状五肽重复蛋白ppr家族基因，该类基因编码的蛋白质大多数被运输到质体和线粒体中参与调控叶绿体和线粒体中rna剪接、rna编辑、翻译以及rna稳定性的保持，还包括参与叶绿体rna代谢调控过程的nus1蛋白以及定位在胞质中鸟甘酸激酶gk。而含有atp锥体结构域和rnr1结构域的核糖核酸还原酶和类mi-2蛋白染色质重构因子也已经确定与水稻质体发育有关。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种与水稻叶色变异相关的蛋白质及其基因，以及由此获得的转基因植物细胞，和利用所述基因对水稻叶片颜色进行改造的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻dna复制相关基因osfln1编码的蛋白质，该蛋白质具有seqidno：3所述的氨基酸序列。

作为本发明的水稻dna复制相关基因osfln1编码的蛋白质的改进：所述氨基酸序列还包括在seqidno：3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

本发明还同时提供了编码上述蛋白质的基因，该基因具有seqidno：1、seqidno：2所示的核苷酸序列。

作为本发明基因的改进：所述核苷酸序列还包括在seqidno：1、seqidno：2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

本发明还同时提供了一种含上述基因的质粒。

本发明还同时提供了一种含上述基因的植物表达载体。

本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述基因序列。

作为本发明的宿主细胞的改进：该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

本发明还同时提供了上述基因的用途：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻的杂种剔除、叶片颜色改良(即，叶绿素含量增加)、净光合速率增加、产量增加。

本发明还同时提供了一种改良水稻叶片颜色，提高制种效率的方法：包括用具有上述核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。

进一步具体说明：在本发明之前发明人通过图位克隆的方法首次获得了一个水稻白化突变相关基因fln2，通过在生物数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中比对保守结构域，发现该基因在水稻中还存在一个同源基因fln1，为了验证fln1的生物学功能，发明人利用基因组编辑技术对水稻品种日本晴中fln1基因进行定点突变，结果表明fln1与fln2具有类似的功能。fln1突变后，突变表型更为明显，表现为严重白化。

本发明的目的是提供一种通过生物信息学和基因组编辑技术相结合克隆的新基因fln1，具有如seqidno：1所示的cdna序列和seqidno：2所示的gdna，也包括与seqidno：1和seqidno：2所示的dna序列至少有70％同源性的基因序列。本发明中的seqidno：3所示的蛋白质属于磷酸果糖激酶类似蛋白，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在seqidno：1和seqidno：2中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。

本发明的另一个目的是提供一种用fln1基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有seqidno：1和seqidno：2所示的序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图1所示的pc1300-cas9-fln1,该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。

本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻叶色的方法。具体地是利用植物表达载体转化植物细胞以影响水稻叶色的方法。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、水稻叶色白化突变相关基因fln2同源基因fln1的分离和克隆：

在前期的工作中发明人首次利用水稻白化突变体克隆了相关基因fln2。本发明通过在生物数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi和http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中比对fln2保守结构域，发现fln2在水稻中还存在一个同源基因fln1(loc_os01g63220)，为了明确fln1是否与fln2具有类似的功能，我们利用pcr技术，分别以日本晴基因组dna和mrna体外反转录产物cdna为模板对fln1基因进行的基因和转录水平的扩增，分别获得了如seqidno：2所示的1981bp的gdna序列和seqidno：1所示的1596bp的cdna序列。水稻中fln1基因共包括3个外显子和2个内含子。

为了验证fln1的生物学功能，发明人利用基因组编辑技术对水稻品种日本晴中fln1基因进行定点突变，分析fln1突变后水稻叶绿体的发育状况。

二、基因组编辑技术验证fln1功能：

1)、基因组编辑靶位点的设计：

为了获得fln1定点突变转基因株，本发明首先利用基因组定点编辑软件分析和设计了突变靶位点(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/和http://crispr.dbcls.jp/)。分析结果表明位于第二外显子上的序列gaggtcaagggatgaaacaa可作为靶位点用于基因组编辑。

2)、基因组编辑载体的构建：

根据定点突变中间载体(psk-grna)的结构(图1a)，我们设计了构建fln1定点突变载体靶位点的引物。合成后的引物退火与aari酶切的psk-grna连接。获得连入fln1靶序列的psk-grna-fln1中间载体(图1c)。用bglii和kpni双酶切psk-grna-fln1回收565bp的目的片段，与bamhi和kpni双酶切的表达载体pc1300-cas9连接(图1b)，获得fln1定点突变的最终表达载体pc1300-cas9-fln1(图1d)。

3)、fln1定点突变载体的遗传转化及转基因株鉴定：

将fln1定点突变的最终表达载体c1300-cas9-fln1通过农杆菌侵染法，转化水稻对照品种日本晴(npb)，经过侵染、筛选、分化、生根等培养过程，最终获得19株t0代转基因阳性株，其中3株纯合突变，16株杂合突变。对突变转基因株中fln1基因序列进行测序分析，我们发现19株转基因阳性株中fln1共有10种不同的突变方式(图2a)。表型观察结果显示3株纯合突变均表现为完全白化(图2b)。t1代杂合突变转基因株遗传分析结果表明，正常绿色苗与白化苗分离比率均符合3:1的分离比。为了明确fln1定点突变转基因株中fln1基因的表达情况，我们用realtimepcr技术检测了npb和不同转基因株系中fln1的表达情况，结果表明在转基因阳性株中fln1的表达极低几乎检测不到(图2c)。前期的研究表明fln2参与调控质体编码的rna聚合酶(pep)活性，fln2突变后会造成pep活性降低，进而引起pep转录的质体基因(psaa,psba和rbcl)表达降低，同时促进核编码的rna聚合酶(nep)转录基因(rpoa,rpob,rpoc1,和rpoc2)的表达，atpb和atpe属于pep和nep共同转录的基因，其表达也会随着pep活性的降低而减少。为了明确fln1突变后，转基因阳性株是否也影响pep的转录活性，我们在t1代fln1定点突变转基因阳性株中检测了上述基因的表达。realtimepcr检测结果显示，pep、nep及pep/nep转录的基因表达趋势与fln2突变体一致，而且pep转录的基因在fln1定点突变株中的表达较fln2突变体更低(图2d)。这些结果说明fln1突变后确实会影响水稻叶绿体的发育，而且fln1对叶绿体发育的调控作用比fln2更为重要。

三、rna干涉(rnai)技术验证fln1功能：

1)、rna干涉载体的构建：

为了进一步证实fln1对水稻叶绿体发育的调控作用，本发明以fln1基因编码序列构建了fln1i载体，具体构建方式如下：

首先我们在fln1第一外显子中设计了749bp序列为干涉目标片段。通过pcr技术，扩增得到fln1编码序列。回收的pcr产物连入中间载体pentr/d-topo，获得连入fln1靶序列的pentr/d-topo-fln1中间载体(图3a)。通过同源重组的方法将pentr/d-topo-fln1中fln1序列重组进入目的载体panda35hk，获得fln1干涉最终表达载体panda35hk-fln1(图3b)。

2)、fln1i载体的遗传转化及转基因株鉴定：

将fln1i载体panda35hk-fln1通过农杆菌侵染法，转化水稻对照品种日本晴(npb)，经过侵染、筛选、分化、生根等培养过程，最终获得12株转基因阳性株(图4a)，realtimepcr检测npb和不同转基因株系中fln1的表达情况，结果表明在转基因阳性株中fln1的表达显著低于野生型(图4b)。pep、nep及pep/nep转录的基因表达趋势也与fln2突变体及fln1定点突变转基因株一致(图4c)。这些结果进一步确证了fln1对叶绿体发育的调控作用。

此外，由于该基因编码蛋白对叶绿体的发育有影响，我们还构建了如图5所示亚细胞定位载体，通过水稻原生质体转化技术证明fln1蛋白在细胞中定位于叶绿体。

本发明利用同源蛋白分析技术在明确fln2功能的基础上，通过定点突变及rna干涉技术首次在水稻中克隆到了fln1基因，明确了该基因编码蛋白对水稻叶绿体发育的影响，该基因编码pfkb家族中的果糖激酶类似蛋白，但作为糖酵解重要限速酶——果糖激酶的类似蛋白，其在植物叶绿体发育过程中究竟如何发挥作用，fln1突变后对环境的响应机理如何，还需更多的研究工作去阐明，通过对fln1基因的功能解读，丰富了叶绿体发育的分子调控机制，同时为研究水稻前质体、叶绿体的发育及二者的转化机理打下基础。

叶绿体是植物进行光合作用的重要场所，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。白化突变典型特征是叶绿体发育异常，大部分白化突变体缺乏叶绿素，不能正常进行光合作用，幼苗依靠种子中的胚乳营养生长，当营养耗尽植株就会死亡。植物叶色白化突变产生机制非常复杂，越来越多的研究表明造成植物叶绿体发育异常的基因种类非常多，涉及激素调控、核-质基因组互作、质体基因及基因与环境的互作等过程。本发明通过定点突变和干涉技术首次在水稻中克隆并证实，编码果糖激酶类似蛋白的fln1基因对水稻叶绿体的发育至关重要，该基因突变后会造成严重的白化致死。对fln1基因的功能解读，将为深入研究叶绿体发育机制，阐明植物光合系统作用的分子机理，进而为水稻高光合育种奠定基础。

综上所述，本发明通过定点突变和干涉技术首次在水稻中克隆并证实，编码果糖激酶类似蛋白的fln1基因对水稻叶绿体的发育至关重要。通过对fln1基因的功能解读，进一步明确了fln1对质体发育的影响，同时为研究前质体向叶绿体转化的分子机制研究打下基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为水稻定点突变所用原始中间载体、最终表达载体及构建完成后载体的骨架示意图；

a：水稻定点突变所用原始中间载体结构说明；

b：水稻定点突变所用原始最终表达载体结构说明；

c：水稻fln1定点突变中间载体骨架示意图；

d：水稻fln1定点突变最终表达载体骨架示意图。

图2为fln1基因定点突变转基因株鉴定及分析；

a：19株转基因株突变方式及突变频率分析；

b：fln1纯合突变表型；wt为转空载体的转基因株，fln1-3为3株t0代纯合突变表型，bar＝10cm；

c：npb及fln1-3转基因株中fln1基因表达分析；

d：npb及fln1-1中pep，nep及pep/nep转录基因表达分析。

图3为fln1i载体示意图；

a：中间载体pentr/d-topo-fln1示意图；

b：fln1i载体panda35hk-fln1示意图；

图4为fln1i转基因株表型分析及表达检测。

a：fln1i转基因阳性株表型，wt为转空载体的转基因株，bar＝10cm；

b：npb和fln1i转基因阳性株中fln1的表达情况；

c：npb及fln1i转基因阳性株pep，nep及pep/nep转录基因表达分析；

图5为fln1亚细胞定位载体的构建及原生质体转化结果；

图a：以pcambia1301-s65t为骨架构建的p35s-fln1-gfp亚细胞定位载体；

图b：fln1在细胞中定位于叶绿体中。图b中，从左至右依次为：亮视野；暗视野gfp荧光；暗视野叶绿体自发荧光；暗视野gfp与叶绿体荧光合并后图像；亮视野gfp与叶绿体荧光合并后图像。

图6为对照转基因株光合色素含量测定及透射电镜观察；

图a：npb及fln1中光合色素含量测定；

图b：npb和fln1i转基因阳性株中光合色素含量测定；

图c,f：npb叶片中叶绿体的发育情况；

图d,g：fln1i与fln1转基因阳性株叶片中叶绿体的发育情况；

图e,h：fln1定点突变转基因株中叶绿体的发育情况；fln1突变后造成水稻叶绿体减少，结构发育异常；上方图片中黑色方框区域放大为下方图片。

具体实施方式

实施例1：水稻fln1定点突变载体的构建：

水稻原始野生材料为粳稻品种“日本晴(npb,wt)”。

1)、基因组编辑靶位点的设计：

crispr/cas9系统是近年发展起来的、由导向rna介导的基因组定向编辑技术，该技术体系自首先在人类与动物细胞系中建立后，一系列经过改造的crispr/cas9系统被迅速地应用于各种动植物如小鼠、斑马鱼、拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦等不同植物基因组的定向编辑研究中(shanetal.2013；andersetal.2014；huetal.2016)。由于crispr/cas9技术具有突变诱导率高、成本低及可以多重基因编辑等特点，已成为具有广阔应用前景的作物遗传改良与育种研究的分子操作系统。为了获得fln1定点突变转基因株，本发明根据生物信息学数据库中已知的npb全基因组信息(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，首先利用基因组定点编辑软件分析和设计了突变靶位点(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/和http://crispr.dbcls.jp/)。分析结果表明位于第二外显子上的序列gaggtcaagggatgaaacaa可作为靶位点用于基因组编辑。该序列包括在fln1的cdna序列seqidno：1中。

2)、基因组编辑载体的构建：

根据定点突变中间载体psk-grna(wangetal.2015)的结构(图1a)，我们设计了构建fln1定点突变载体靶位点的引物fln1-f:ggcagaggtcaagggatgaaacaa,和fln1-r:aaacttgtttcatcccttgacctc。具体步骤如下：

步骤一：oligo二聚体(oligoduplex)的形成

将合成的oligo分别稀释成100μm，按如下比例混合：

fln1-f5μl；fln1-r5μl

最终体系10μl；

混匀后，在pcr仪中99℃保温5min，然后自然冷却至室温。

步骤二：oligo二聚体插入到中间载体(psk-grna)中

1.psk-grna酶切：

psk-grna载体5μl；10×aaribuffer5μl；50×oligonucleotide(0.025mm)1μl；aari酶1μl；无菌水：38μl；最终体系50μl；37℃酶切两小时。除psk-grna载体外，其余组分均购自thermoscientific公司。酶切后回收psk-grna载体，具体方法详见axygendna凝胶回收试剂盒操作说明。

psk-grna载体在wangc,shenl,fuy,yanc,wangk.asimplecrispr/cas9systemformultiplexgenomeeditinginrice.jgenetgenomics.2015,42(12):703-706中有明确告知。

2.oligo二聚体插入到psk-grna载体中：

回收的psk-grna载体2μl；10×t4dna连接酶buffer1μl；步骤一的oligo二聚体6.5μl；t4dna连接酶0.5μl；最终体系10μl；16℃连接4小时后，65℃10min灭活。t4dna连接酶购自promega公司。

取上述连接产物10μl加入到刚解冻的50μldh5a感受态细胞中，轻微混匀，冰浴30分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟，然后加入500μl无抗lb，置于37℃恒温摇床中，170转/min，复苏一小时后涂氨苄抗性(amp)的平板。挑5个白色菌落，用通用引物t7测序(taatacgactcactataggg)，鉴定阳性克隆psk-grna-fln1(图1c)；即，测序结果中靶序列已正确连入psk-grna载体的为阳性克隆psk-grna-fln1。

步骤三：psk-grna-fln1中目的片段插入到最终表达载体pc1300-cas9

1.psk-grna-fln1和pc1300-cas9载体(图1b)酶切

psk-grna-fln1载体5μl；10×tbuffer5μl；bglii酶2μl；kpni酶2μl；无菌水：36μl；最终体系50μl；37℃酶切两小时，回收565bp的目的片段。pc1300-cas9载体5μl；10×kbuffer2.5μl；bamhi酶2μl；kpni酶2μl；无菌水：38.5μl；最终体系50μl；30℃酶切三小时，回收14.6kb的目的载体。所有内切酶及对应buffer均购自takara公司，dna回收同前。

2.pc1300-cas9-fln1连接

上述酶切回收的565bp片段1.9μl；14.6kb的目的载体6.6μl；10×t4dna连接酶buffer1μl；t4dna连接酶0.5μl；最终体系10μl；16℃连接4小时后，65℃10min灭活。t4dna连接酶购自promega公司。

连接产物10μl加入到刚解冻的50μldh5a感受态细胞中，轻微混匀，冰浴30分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟，然后加入500μl无抗lb，置于37℃恒温摇床中，170转/min，复苏一小时后涂卡那抗性(kan)的平板。挑5个白色菌落，用pc1300-cas9载体1300f引物测序(caatacgcaaaccgcctctcc)，鉴定阳性克隆pc1300-cas9-fln1(图1d)。该阳性克隆的测序结果中靶序列已正确连入pc1300-cas9载体的为阳性克隆psk-grna-fln1。

实施例2：水稻fln1干涉载体的构建：

水稻原始野生材料为粳稻品种“日本晴(npb,wt)”。

rnai是通过双链rna(double-strandedrna，dsrna)介导的特异性降解相应序列的mrna，从而导致转录后水平的基因沉默。这一过程在秀丽线虫中首次发现后，近年来已经取得了许多突破性进展，成为研究多种生物基因功能的有效手段(fireetal.1998；campbellandchoy2005)。

为了进一步证实fln1对水稻叶绿体发育的调控作用，本发明以fln1基因部分编码序列(包括在seqidno：1中)构建了fln1i载体，具体构建步骤如下：

步骤一、水稻总rna的提取及反转录

水稻材料的总rna提取使用美国axygen公司的axyprep总rna小量制备试剂盒，方法如下：

1.事先用酒精灯外焰烘烤研钵内部和研磨棒十几秒，而后加入足够的液氮预冷研钵和研磨棒；

2.预先开启离心机，内部喷洒酒精处理一下，并且调至4℃预冷；

3.选取gsd1、野生型、定点突变转基因株t1代萌发后15天叶片及野生型萌发15天和始穗期的不同组织适量(150mg左右)迅速用液氮细细研磨至细粉末状，装入rnase-free的2ml规格的eppendorf管；

4.管中加入400μl的细胞裂解液，用蓝色枪头伸入管中搅匀组织残体；

5.管中加入150μl的中和液，涡旋振荡15-30秒，离心机12000g离心5分钟(4℃离心)；

6.吸取上清(注意不要吸到组织残渣)移至1.5mleppendorf管，加250μl异丙醇，混合均匀；

7.将制备管置于试剂盒中提供的2ml离心管中，转移之前的混合液到制备管中，6000g4摄氏度离心1分钟；

8.将离心管中的滤液倒掉，再将制备管放回到离心管中，制备管中加入500μl的洗涤液(确认之前已经在洗涤液中按试剂瓶上指定的体积加入了无水乙醇)，12000g4摄氏度离心1分钟；

9.将离心管中的滤液倒掉，再将制备管放回到离心管中，制备管中加入700μl的去盐液(确认之前已经在去盐液中按试剂瓶上指定的体积加入了无水乙醇)，12000g4摄氏度离心1分钟；

10.弃掉滤液，将制备管放回到2ml离心管中，再用12000g4摄氏度离心1分钟；

11.将制备管放入一个干净的1.5ml离心管(试剂盒内已经提供)中，在制备管膜中央加入80μlrnase-free的水；

12.室温静置1分钟，12000g4摄氏度离心1分钟，洗脱得到rna，-80摄氏度冰箱保存备用。

提取的rna利用toyobo公司的revertraacequantitativepcrrtmastermix试剂盒进行反转录，之后利用反转录的产物cdna可以进行real-timepcr等实验，反转录过程如下：

1).吸取提取的rna8μl，加入dnaasei1μl、dnaaseibuffer1μl，37摄氏度水浴30分钟；

2).加入1μledta，65摄氏度放置10分钟；

3).加入oligo(dt)201μl、5xrtbuffer4μl、10mmdntp2μl，rnaseinhibition1μl和reversetraace1μl，42摄氏度放置20分钟，后改为99摄氏度放置5分钟(利用pcr仪处理)。

4).向反转录完的20μl产物中加入140μl的双蒸水稀释后可以进行后续的pcr或real-timepcr实验。

步骤二、目的片段扩增

日本晴总rna反转录的cdna为扩增模板1μl，10×kodplusdna聚合酶buffer5μl；2mmdntp5μl；kodplusdna聚合酶(toyobo)1μl；25mmmgso42μl；10mmfln1if(caccaagaagaatacgcaggagtc)3μl；10mmfln1ir(ctgaagagtgtgctttccattgag)3μl；无菌水30μl；最终体系50μl；混匀后，在pcr仪运行如下程序：

98℃10min；

98℃30s；60℃30s；72℃1min；35个循环；

72℃10min；4℃保存。1％琼脂糖胶分离后回收749bp的目的片段。

步骤三、fln1i载体连接

将步骤二中回收的片段连入中间载体pentr/d-topo，连接体系如下：pentr/d-topo载体1μl；saltsolution1μl；步骤二中回收的dna片段1μl；sterilewater3μl；最终体系5μl；22℃连接1小时。除目的片段外，其他试剂均购自invitrogene公司(pentr^tm/d-cloningkitwithonetop10chemicallycompetente.coli)。

连接产物2μl加入到刚解冻的50μltop10感受态细胞中，轻微混匀，冰浴30分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟，然后加入500μl无抗soc，置于37℃恒温摇床中，170转/min，复苏一小时后涂卡那抗性(kan)的平板。挑5个白色菌落，用通用引物m13f/r测序验证序列正确性(m13f:gtaaaacgacggccag，m13r:caggaaacagctatgac)，获得阳性克隆pentr/d-topo-fln1中间载体(图3a)；该阳性克隆的测序结果中fln1目标序列已正确连入pentr/d-topo载体的为阳性克隆psk-grna-fln1。

pentr/d-topo-fln1和最终表达载体panda35hk分别提质粒，然后按照下列比例配比重组体系：pentr/d-topo-fln1载体7μl；panda35hk载体5μl；5×lrclonaseenzymebuffer4μl；lrclonaseenzyme4μl；最终体系20μl；涡旋混匀，25℃重组2小时后，加2μl蛋白酶k，37℃10min温浴。通过同源重组的方法将pentr/d-topo-fln1中fln1序列重组进入目的载体panda35hk。除中间载体和目的载体外，其他试剂均购自invitrogene公司(lrclonaseenzymemix)。

连接产物5μl加入到刚解冻的50μltop10感受态细胞中，轻微混匀，冰浴30分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟，然后加入500μl无抗soc，置于37℃恒温摇床中，170转/min，复苏一小时后涂卡那抗性(kan)的平板。挑5个菌落，用fln1if/r为引物，菌落pcr鉴定阳性克隆，pcr产物大小749bp，选2个阳性克隆摇菌送测序，测序引物为guslinker19-1：cgacgcgaagcgggtagat和guslinker900-925：ggtaacaagaaagggatcttcactc，获得阳性克隆panda35hk-fln1(图3b)。

749bp对应的序列为：

实施例3：植物转化：

测序正确的菌株包括定点突变载体pc1300-cas9-fln1和干涉载体panda35hk-fln1及其各自对应的空载体pc1300-cas9和panda35hk，分别提取质粒通过电击的方法转入农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)株系eha105中转化水稻。利用野生型日本晴成熟种子诱导愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的eha105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有300mg/l潮霉素的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有250mg/l潮霉素预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行pcr鉴定和连t载体(takarapmd19)测序鉴定找到转基因阳性植株。pc1300-cas9-fln1转化后最终获得19株t0代转基因阳性株，对突变转基因株中fln1基因序列进行测序分析，我们发现19株转基因阳性株中fln1共有10种不同的突变方式(图2a)，表型观察结果显示19株阳性株中3株纯合突变，16株杂合突变。3株纯合突变均表现为完全白化，转空载体pc1300-cas9的转基因苗表型与野生型一致(图2b)。t1代杂合突变转基因株遗传分析结果表明，正常绿色苗与白化苗分离比率均符合3:1的分离比。panda35hk-fln1转化后最终获得17株转基因阳性株，表型观察结果显示fln1i转基因株表现出严重的黄白化，随后死亡。转空载体panda35hk的转基因苗表型与野生型一致(图4a)

通过上述转基因技术，结果表明：本发明获得了使野生型水稻定点突变为突变体表型的转基因水稻突变体(图2b和4a)。

即，该案例是通过转基因将正常的绿色转为白色，从而证明目的基因有调控叶片颜色的功能。

说明：上文中所涉及的各种培养基的配方可参考tokis.,haran.,onok.,onoderah.,tagiria.,okas.,tanakah.(2006)earlyinfectionofscutellumtissuewithagrobacteriumallowshigh‐speedtransformationofrice.theplantjournal47:969-976。

实施例4：水稻原生质体的转化及osfln1绿色荧光融合蛋白的定位观察：

将osfln1基因cdna序列(如seqidno：1所示)克隆至pcambia1301-s65t中构建gfp融合载体(图5a)，该pcambia1301-s65t载体原始出处为：

rend,liy,zhaof,sangx,shij,wangn,guos,lingy,zhangc,yangz,heg.multi-floretspikelet1,whichencodesanap2/erfprotein,determinesspikeletmeristemfateandsterilelemmaidentityinrice.plantphysiol.2013；162(2):872-884。

步骤一、osfln1绿色荧光融合载体的构建

1、目的片段的扩增

npb总rna反转录的cdna为扩增模板1μl，2×kodfxdna聚合酶buffer25μl；2mmdntp8μl；kodfxdna聚合酶(toyobo)1μl；10mmfln1-gfpf(tatttacaattacagtcgacatggccatggcggcctcccc)3μl；10mmfln1-gfpr(atggatcctctagagtcgacccacatagaaggcacatatacttgctccttca)3μl；无菌水9μl；最终体系50μl；混匀后，在pcr仪运行如下程序：

98℃10min；

98℃30s；60℃30s；72℃2min；35个循环；

72℃10min；4℃保存。1％琼脂糖胶分离后回收1633bp的目的片段。

2、目的载体酶切

目的载体pcambia1301-s65t用sali(takara)单酶切，酶切体系如下：10×hbuffer5μl；pcambia1301-s65t载体10μl；sali2μl；无菌水33μl；最终体系50μl；37℃酶切2小时。1％琼脂糖胶分离，回收酶切产物。

3、osfln1绿色荧光融合载体构建

将上述1回收的片段通过同源重组的方式，连入上述2回收的目的载体，重组体系如下：pcr产物8μl；酶切回收的pcambia1301-s65t载体2μl；5×ceiibuffer4μl；ii2μl；无菌水4μl；最终体系20μl；37℃连接1小时后。除目的片段及表达载体pcambia1301-s65t外，其他试剂均购自南京诺唯赞公司(clonexpress-iionestepcloningkit)。

连接产物10μl加入到刚解冻的50μldh5α感受态细胞中，轻微混匀，冰浴30分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟，然后加入500μl无抗lb，置于37℃恒温摇床中，170转/min，复苏一小时后涂卡那抗性(kan)的平板。挑5个白色菌落，用fln1-gfpf/r为引物，菌落pcr鉴定阳性克隆，pcr产物大小1633bp，选2个阳性克隆摇菌送测序，测序引物为s65t-1f：gaggacaggcttcttgag和s65tr：ggtggtgcagatgaactt，获得osfln1绿色荧光融合表达载体p35s-fln1-gfp。

步骤二、水稻原生质体提取：

(1)生长15天左右的水稻npb幼苗用锋利的刀片在塑料培养皿板上切碎幼苗茎叶，移到200ml洗净的锥形瓶中(一般20ml酶解液每次60株左右；预先将酶解液倒入瓶中，根据瓶底大小合理分配酶解液)，每瓶不宜装太多。放入28度摇床，60-80rpm，4-6小时。

(2)在酶解时间完成之前，配置peg400040％溶液，置于65℃水浴锅中或室温溶解，65℃溶解，中间取出来振荡一次。

(3)酶解完成后，先向酶解完成的瓶中加入约15ml左右的w5。用300目(或400目)的钢制滤网将碎叶片过滤掉，用干净的塑料培养皿收集酶解后的原生质体。然后将原生质体缓慢倒入(或用去枪尖的枪头吸取)50ml离心管中，天平称重平衡后，放入水平离心机，150g，5min，充分收集原生质体，离心完成后，缓慢吸走上清。

(4)向原生质体沉淀中加入1mlw5溶液，缓慢轻轻倾斜混匀重悬，然后用去枪尖的枪头吸移到2ml离心管中。此时50ml离心管中可能还有少量未重悬的原生质体，可再加入1mlw5溶解，吸移到之前的2ml离心管中，150g，3min，移除上清液。

(5)用mmg重悬，具体加多少根据原生质体的量和要转的质粒个数来定，一般最后每个质粒中加入100ul稀释的原生质体。或者用显微镜稍微观察下产量和酶解后完整个体的数目比例，然后根据原生质体的状态来确定mmg用量。

(6)准备转化用质粒(pcambia1301-s65t、pcambia1301-s65tgsd1)10-15ug左右或10ul，于2ml离心管中。

(7)加入100ul的重悬好的原生质体，然后加入peg40％110ul，混匀。

(8)28度避光静置15min。

(9)加入足量的w5稀释，混匀，然后离心150g，3min，缓慢移除上清，再用w5洗一次(中间会有损失，但不影响结果)。最后得到的沉淀，用w5重悬(用2ml的管子装满)，轻轻混匀，移到细胞培养板中。用锡箔纸包裹，避光28度静置培养，14小时。

(10)培养时间完成后，将培养板各孔中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸移到2ml管中，然后离心150g，3min，去除上清，保留100ul左右上清液，重悬原生质体。

(11)共聚焦显微镜观察拍照。

结果显示阳性对照在细胞各个部位均有表达，说明实验的表达系统工作正常，osfln1gfp融合蛋白主要定位于叶绿体中(图5b)，其他部位未见表达，说明osfln1主要在叶绿体中执行生物学功能。

说明：上文中所涉及的各种溶液的配方可参考zhangetal.ahighlyefficientricegreentissueprotoplastsystemfortransientgeneexpressionandstudyinglightchloroplast-relatedprocesses.plantmethods2011,7:30.

实施例5：光合色素含量测定：

在光照培养箱(panasonic,mlr-352h-pc)中按照如下条件培养日本晴，fln1i，fln1定点突变纯合突变株至二叶期：24℃：32℃，暗10h：光14h，光照强度均为200μmol/m².s，分别取突变体和npb第二叶去掉主脉，剪成1cm左右的片段，称取0.2g浸泡于10ml80％丙酮，26℃条件下暗培养48小时。取溶液在紫外分光光度计(du800,beckmancoulter)663nm、645nm和470nm三种波长下测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的光密度值。3次重复，然后根据amon(1949)的方法计算出各检测叶片中的叶绿素a(chla)、叶绿素b(chlb)的含量,按照wellburn(1994)计算类胡萝卜素(car)的含量，计算公式如下：

chla＝(12.7×od663－2.69×od645)×v/w

chlb＝(22.9×od645－4.68×od663)×v/w

car＝(1000×od470×v/w－3.27×chla－104×chlb)/198

其中：v为提取液体积(10ml)，w为叶片质量0.2g，od663、od645及od470为在分光光度仪上读取的光密度值，单位：mg/g。

结果显示，fln1i和fln1定点突变纯合突变株中几乎检测不到叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b、类胡萝卜素的存在，说明fln1对于水稻叶绿素的合成至关重要，该基因突变后叶绿素及类胡萝卜素的合成完全被抑制(图6a,b)。

实施例6：叶绿体透射电镜的制备和观察：

(1)叶绿体取样：30℃12小时，24℃12小时，光照条件下培养fln1i，fln1定点突变纯合突变株和npb至二叶期，取fln1i，fln1定点突变纯合突变株和对照npb叶片，切成0.5～1mm³左右的小块；

(2)固定：将切好的样品块放入2ml离心管中，加入2.5％的戊二醛溶液(ph＝7.2)，在抽真空仪器中抽真空直到叶片完全下沉。0.1m磷酸漂洗三次，每15min一次，然后加入1％锇酸固定2～3小时，直至样品变黑；

(3)脱水：先用50％、70％、和90％的乙醇溶液依次脱水，每个浓度处理20分钟，再用乙醇和丙酮(1：1)溶液处理20分钟，以上均在4度冰箱内进行，最后将样品用纯丙酮室温处理20分钟；

(4)渗透：将样品在无水丙酮和包埋剂(3：1)混合液中作用4小时，再在无水丙酮和包埋剂(1：1)混合液处理3小时，最后在纯的包埋剂中作用12小时；

(5)包埋：将上述步骤中的样品挑的包埋盒内，37℃过夜，45℃处理12小时最后60℃处理24小时，获得包埋样品；

(6)切片、拍照：将包埋样品用超薄切片机切成60-70nm左右的超薄片，然后将切片用柠檬酸铅溶液染色10分钟，再有醋酸铀溶液染色30分钟，双蒸水清洗三次后晾干，用hitachih-7650型透射电镜观察并且选择清晰地倍数拍照。

对叶绿体的观察结果显示，npb叶片的叶肉细胞中叶绿体数目较多，叶绿体结构完整，叶绿体中基粒片层排列整齐，紧密(图6c,f)，而fln1i和fln1定点突变纯合突变株叶片中几乎看不到完整的叶绿体结构，极个别的叶绿体其内部结构紊乱，根本无法辨别基粒片层的排列(图6d,g,e,h)。这些结果表明fln1基因的突变造成突变体中叶绿体数目的减少和发育的停滞。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>中国水稻研究所

<120>水稻叶绿体发育调控基因osfln1及其用途

<150>2017103519733

<151>2017-05-18

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1596

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>1

atggccatggcggcctccccattcctcatcttgccatccttattccccaagcccaccatc60

ctcgccgcgcgcatccaccccagcatcttccgaggccgccatattcgctgctccccgaac120

ggcgccgccgtaccggaatcccctgaacccgccccacgccgcgggcgcaggaagtcccca180

tccccgtcgccgccgaaggcgaagaccacgaggcgcaggaccaagaagaatacgcaggag240

tctgattcagagggcgaggaggagccgccgaagcggcggggccgtcggacaaggaaatcc300

aagcaagaggccgagcaggaggcggcggagaaggaggatgaggtccgggcggcgagcccc360

ggaacggaggattcgaagagagcggtccaagatgaggatggggaggcggaggcgacgggg420

agcgactccgaagacggggaggattcgccgtacgactggccgccgctggtgtgctgcttc480

ggggcgccgcggtgggagttcgtcccgacggtgcgggtgtcggaccggcagatgcacccg540

gacatatactccacgtggctgcatctgcagtgggagcctccggagttcgcgcgcgcgccg600

gggagcgcggcgagcaacgtggccatcgcgctcaccaggctcggcggccgcgccgcggtg660

ctcggcaaggtcggtgacgacgacttcggccgcgagcttgtgtaccgcatgaactgcgag720

cgagtgcagacgcgcgccatcaggttcgacgacggcgcggccacggccactgcgcgcatg780

aaggtcgggttccgggaccgtgaggacggcagcggcggaacgaggcttgtggctgagacg840

gtgaagagcgctgccgaggactccctcagcaaggctgagatcaatgtggatgttttgaaa900

gaggctagagtgttccatttcaattcagaggtcctattgactccctcaatggaaagcaca960

ctcttcagagcaattgaactgtccaagaaatttggaagtaaaatattctttgatcttaac1020

ttgccattgcctttgtggaggtcaagggatgaaacaaaggagttgataaacaaggcatgg1080

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aggaactggccacagtactaccattacacccccgaagaaattgctcccatttggcatgat1260

gggataaaactcttgcttgtgacatacggaacacttaggatccactactacacacccaag1320

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atttcgcaatggactattggtgctgtgcgaggattccctactgagagtgctgcccagaac1560

ttgaaggagcaagtatatgtgccttctatgtggtga1596

<210>2

<211>1984

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>2