本发明涉及一种紫甘薯花青素高效合成提取方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
大量研究表明，膳食调节和营养补充可以改善人体健康和预防疾病。合理的营养疗法可以提高传统药物的治疗效果，减少药物使用量，从而减少药物治疗的副作用。近年来研究发现，紫甘薯中富含大量天然的花青素，具有抗氧化能力，能够改善人体功能及预防某些眼科疾病。因此，如何高效的提取利用紫甘薯中的花青素已成为21世纪新兴前沿的研究课题。
目前采用的分离提取技术得到的花青素：含量低、杂质多、医疗保健价值低。由于花青素对ph值、温度和光比较敏感，因此现有的超声技术、溶剂浸提法等分离纯化技术提取的花青素含量少、活性低，造成对人体保健，防病治病的效果降低。
紫甘薯被世界卫生组织（worldhealthorganization，who）誉为抗氧化活性最强的果蔬之一。这是因为紫甘薯中富含类黄酮、酚酸等多酚类物质。紫甘薯中的花青素被认为是紫甘薯的主要生物活性。因此，提取高生物活性和含量的紫甘薯花青素，保护人们富人身体健康、预防疾病具有重大意义。
技术实现要素：
本发明目的是：针对紫甘薯花青素主要集中在紫甘薯细胞内，大量花青素前体未被充分合成利用，导致目标成分溶出难、活性成分损失大、耗能高、成本高的缺陷，提出一种培养紫甘薯细胞合成花青素，建立提取率高、操作性强、成本低、条件温和的紫甘薯花青素合成提取方法。
具体按以下步骤操作进行：
(1)原料预处理：取新鲜、无腐烂的紫甘薯为原料，经清洗、机械捣碎至浆状后备用；(2)紫甘薯细胞培养：将步骤(1)中得到的紫甘薯浆经0.7mmol•l-1tritonx-100处理10~20min，50~60mpa的高流体静压处理5min后，接种：黑曲霉5-7%、红曲霉5-7%、乳酸菌0.5-0.8%、地衣芽孢杆菌1-3%、粘红酵母5-7%、黄孢原毛平革菌2-5%、蜡状芽孢杆菌2-5%、啤酒酵母0.8-1.2%，添加l-苯丙氨酸20~40mg/l，l-酪氨酸3~8mg/l，培养基配方：蔗糖0.3-0.6%，蛋白胨1.0-2.0%，葡萄糖0.3-0.6%，玉米浆1.0-3.0%，豆饼粉1.0-3.0%，nacl0.3-0.8%，kh2po40.2-0.6%，ph值2.1-4.5，25~30°c培养6~8天，收集培养液，上述百分比浓度为质量百分比浓度，l-苯丙氨酸与l-酪氨酸的添加质量比为1:1；(3)提取混合物的分离与浓缩：将步骤(2)的培养液至10000-12000r/min室温条件下离心10-20min，弃沉淀，收集上清液；在压力为0.1-0.6mpa，温度25-40°c下，将上清液进行超滤，收集滤液，得到花青素粗提液；(4)分离、纯化：将步骤(3)得到的花青素粗提液置于ab-8吸附树脂层析柱中进行动态吸附，用4-6倍柱体积的去离子水洗涤柱子，除去水溶性杂质，再用30-50%乙醇洗脱液等浓度洗脱柱子，流速为2-4ml/min，得到纯度较高的花青素洗脱液；(5)干燥：旋转蒸发回收乙醇，真空冷冻干燥得高纯度的花青素粉末成品。
步骤(2)中，菌种选择黑曲霉6%、红曲霉6%、乳酸菌0.6-0.7%、地衣芽孢杆菌1.5-2.5%、粘红酵母6%、黄孢原毛平革菌3-4%、蜡状芽孢杆菌3-4%、啤酒酵母1.0%等微生物中的一种或几种的组合进行生物降解和合成。
步骤(2)中，培养基配方：蔗糖0.4-0.5%，蛋白胨1.2-1.8%，葡萄糖与玉米浆的添加的质量比为1:2。
步骤(4)中，超滤采用截留分子量500da的超滤装置。
本发明的优点在于：
1、与现有技术相比，本发明以紫甘薯为原料，采用高流体静压-微生物发酵-超滤、柱层析等高新技术，提取紫甘薯已含有的花青素。
2、利用黑曲霉、红曲霉、黄孢原毛平革菌、蜡状芽孢杆菌和高流体静压破坏植物细胞壁，使花青素释放完全。
3、利用粘红酵母、乳酸菌产生苯丙氨酸酶，添加花青素前体物质l-苯丙氨酸与l-酪氨酸，利用紫甘薯中原有的成分继续促进加速更多的天然花青素合成。
4、本发明技术低温、低ph值、避光，确保花青素化学性质稳定性，有机溶剂利用少易回收，生产周期仅为5-8天。
5、得到的花青素成品纯度大幅提高，可以达到99.33%。
6、本发明克服了传统生产中温度较高，溶出率较低，有机试剂用量多，成本高，效率低等缺点。因此本发明可实现规模化、产业化生产，增加紫甘薯的经济价值，延长紫甘薯产业链。
具体实施方式
实施例1
(1)原料预处理：取新鲜、无腐烂的紫甘薯为原料，经清洗、机械捣碎至浆状后备用；(2)紫甘薯细胞培养：将步骤(1)中得到的紫甘薯浆经0.7mmol•l-1tritonx-100处理10~20min，50~60mpa的高流体静压处理5min后，接种：黑曲霉5%、红曲霉5%、乳酸菌0.5%、地衣芽孢杆菌1%、粘红酵母5%、黄孢原毛平革菌2%、蜡状芽孢杆菌2%、啤酒酵母0.8%，添加l-苯丙氨酸20mg/l，l-酪氨酸3mg/l，培养基配方：蔗糖0.3%，蛋白胨1.0%，葡萄糖0.3%，玉米浆1.0%，豆饼粉1.0%，nacl0.3%，kh2po40.2%，ph值2.1，25°c培养6天，收集培养液，上述百分比浓度为质量百分比浓度，l-苯丙氨酸与l-酪氨酸的添加质量比为1:1；(3)提取混合物的分离与浓缩：将步骤(2)的培养液至10000r/min室温条件下离心10min，弃沉淀，收集上清液；在压力为0.1mpa，温度25°c下，将上清液进行超滤，收集滤液，得到花青素粗提液；(4)分离、纯化：将步骤(3)得到的花青素粗提液置于ab-8吸附树脂层析柱中进行动态吸附，用4-6倍柱体积的去离子水洗涤柱子，除去水溶性杂质，再用30-50%乙醇洗脱液等浓度洗脱柱子，流速为2-4ml/min，得到纯度较高的花青素洗脱液；(5)干燥：旋转蒸发回收乙醇，真空冷冻干燥得纯度为98.63%的花青素粉末成品。
实施例2
(1)原料预处理：取新鲜、无腐烂的紫甘薯为原料，经清洗、机械捣碎至浆状后备用；(2)紫甘薯细胞培养：将步骤(1)中得到的紫甘薯浆经0.7mmol•l-1tritonx-100处理10~20min，50~60mpa的高流体静压处理5min后，接种：黑曲霉6%、红曲霉6%、乳酸菌0.6%、地衣芽孢杆菌2%、粘红酵母6%、黄孢原毛平革菌3%、蜡状芽孢杆菌4%、啤酒酵母1.0%，添加l-苯丙氨酸30mg/l，l-酪氨酸5mg/l，培养基配方：蔗糖0.4%，蛋白胨1.2%，葡萄糖0.4%，玉米浆2.0%，豆饼粉2.0%，nacl0.6%，kh2po40.4%，ph值3.5，28°c培养7天，收集培养液，上述百分比浓度为质量百分比浓度，l-苯丙氨酸与l-酪氨酸的添加质量比为1:1；(3)提取混合物的分离与浓缩：将步骤(2)的培养液至11000r/min室温条件下离心15min，弃沉淀，收集上清液；在压力为0.3mpa，温度30°c下，将上清液进行超滤，收集滤液，得到花青素粗提液；(4)分离、纯化：将步骤(3)得到的花青素粗提液置于ab-8吸附树脂层析柱中进行动态吸附，用4-6倍柱体积的去离子水洗涤柱子，除去水溶性杂质，再用30-50%乙醇洗脱液等浓度洗脱柱子，流速为2-4ml/min，得到纯度较高的花青素洗脱液；(5)干燥：旋转蒸发回收乙醇，真空冷冻干燥得纯度为99.01%的花青素粉末成品。
实施例3
(1)原料预处理：取新鲜、无腐烂的紫甘薯为原料，经清洗、机械捣碎至浆状后备用；(2)紫甘薯细胞培养：将步骤(1)中得到的紫甘薯浆经0.7mmol•l-1tritonx-100处理10~20min，50~60mpa的高流体静压处理5min后，接种：黑曲霉5-7%、红曲霉7%、乳酸菌0.8%、地衣芽孢杆菌3%、粘红酵母7%、黄孢原毛平革菌5%、蜡状芽孢杆菌5%、啤酒酵母1.2%，添加l-苯丙氨酸40mg/l，l-酪氨酸8mg/l，培养基配方：蔗糖0.6%，蛋白胨2.0%，葡萄糖0.6%，玉米浆3.0%，豆饼粉3.0%，nacl0.8%，kh2po40.6%，ph值4.5，30°c培养8天，收集培养液，上述百分比浓度为质量百分比浓度，l-苯丙氨酸与l-酪氨酸的添加质量比为1:1；(3)提取混合物的分离与浓缩：将步骤(2)的培养液至12000r/min室温条件下离心20min，弃沉淀，收集上清液；在压力为0.6mpa，温度40°c下，将上清液进行超滤，收集滤液，得到花青素粗提液；(4)分离、纯化：将步骤(3)得到的花青素粗提液置于ab-8吸附树脂层析柱中进行动态吸附，用4-6倍柱体积的去离子水洗涤柱子，除去水溶性杂质，再用30-50%乙醇洗脱液等浓度洗脱柱子，流速为2-4ml/min，得到纯度较高的花青素洗脱液；(5)干燥：旋转蒸发回收乙醇，真空冷冻干燥得纯度为99.33%的花青素粉末成品。