本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种区分水牛和奶牛奶的mirna标记物及其应用。
背景技术：
：mirna又称microrna，是一类由大约22个核苷酸组成的单链非编码rna，主要利用信使rna的直接剪切或间接抑制翻译在转录后水平调控靶基因的表达。mirna在个体发育的不同时期如细胞分化、增殖、凋亡等及不同组织中有不同的表达模式，表明其在发育和分化中起着重要的调控作用。通过对组织mirna表达谱的研究已经发现，mirna具有很强的细胞、组织或疾病特异性，这些特异表达的minra既是其功能研究的基础，又是不同细胞、组织、器官或疾病模型的标记物。乳汁是所有哺乳动物新生儿的重要营养来源，包含了许多生物学上的活性物质，如：细胞因子类，生长因子类及激素类物质，这些都可调节新生儿的发育。水牛乳汁的脂肪、蛋白质、乳糖的含量是普通奶牛奶的数倍，矿物质和维生素含量也是奶牛和人乳的数十倍。其香醇浓厚，胆固醇低，维生素、微量元素丰富，尤其是酪蛋白含量高，能进行高质量乳制品的深加工。作为一类高级营养食品，水牛奶制品日渐成人们消费的“新宠”。外泌体为多种细胞、组织或有机体在正常或病理状态下分泌的一类直径为30～100nm之间的膜上小囊泡，表现为球形结构，含有亲水性的水溶性和有限的脂质双分子层成分。研究表明除上皮细胞、b细胞、t细胞等多种细胞可分泌外胞体外，血浆、尿液、唾液、乳汁等各种生理液体中也存在外泌体，且这些外泌体呈现多效性的生物功能，包括免疫调节活性，细胞与细胞交流的调节和传递信号的功能。mirna作为一类非编码的小分子rna，可包裹于乳汁的外泌体中。有研究表明，在不同物种乳汁外泌体中都发现存在mirna，而且mirna的组成和丰度存在显著差异。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种区分水牛和奶牛奶的mirna标记物。本发明的另一目的在于提供上述mirna标记物的应用。本发明的再一目的在于提供一种用于区分水牛和奶牛奶的检测试剂盒。本发明利用水牛和奶牛乳汁外泌体mir-2285t，提出区分水牛和奶牛奶检测方法及应用，为农业生产中在分子水平上区分水牛和奶牛奶提供了新的鉴定方法。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明提供一种区分水牛和奶牛奶的mirna标记物，所述的mirna标记物为mir-2285t，其序列为：5′-agaaucuggaugaacuuuuugg-3′，如seqidno：1所示。本发明还提供一种上述mirna标志物的引物，该序列为：(5′-3′)mir-2285t的上游引物序列为：ggccagaatctggatga，seqidno：3；mir-2285t的下游引物序列为：gtgcagggtccgaggt，seqidno：4。本发明还提供一种上述mirna标记物在区分水牛和奶牛奶中的应用，具体的，在制备区分水牛和奶牛奶检测试剂盒中的应用。优选的，上述mirna标志物的引物在区分水牛和奶牛奶中的应用，具体的，在制备区分水牛和奶牛奶检测试剂盒中的应用。本发明还提供一种用于区分水牛和奶牛奶的检测试剂盒，包括针对所述mir-2285t的引物和/或探针。进一步，使用茎环法检测mir-2285t标志物时，所用的反转录引物序列为seqidno：2、上游引物序列为seqidno：3和下游引物序列为seqidno：4。进一步，使用茎环法检测mir-2285t标志物时，可以采用荧光染料法。具体的，所述的试剂盒包括针对所述mir-2285t的反转录试剂、反转录引物、特异性引物、内参引物、荧光定量pcr反应液；优选的，还包括mir-2285t特异性探针。其中，所述的针对所述mir-2285t的反转录引物序列为seqidno：2；所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为seqidno：3，下游引物序列为seqidno：4；所述的内参引物包括gapdh内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为seqidno：5，下游引物序列为seqidno：6。上述试剂盒应用于牛奶中mir-2285t的定量检测，可以用于区分水牛和奶牛奶。本发明还提供一种用于区分水牛和奶牛奶的检测方法，包括如下步骤：检测mir-2285t表达水平的步骤包括：1)提取水牛和奶牛奶样品外泌体中总rna；2)通过反转录引物在反转录酶的作用下进行mir-2285t反转录成cdna；3)在荧光实时定量pcr仪上将步骤(2)获得的cdna和内参基因进行扩增检测；4)通过溶解曲线分析，2-δδct法进行相对定量。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明提供一种区分水牛和奶牛奶的mirna标记物，名称为mir-2285t，其序列为：5′-agaaucuggaugaacuuuuugg-3′，如seqidno：1所示。本发明的结果显示mir-2285t基因在奶牛奶外泌体中极显著高表达。所述mir-2285t可在制备区分水牛和奶牛奶检测试剂中应用，为农业生产中在分子水平上区分水牛和奶牛奶提供了新的鉴定方法。附图说明图1是荧光定量pcr检测奶中mir-2285t的相对表达量。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。实施例1水牛与奶牛奶外泌体分离1)将存于-80℃冰箱的乳样进行解冻，接着2000g，4℃，30min离心收集上清，去除乳脂蛋白和乳腺细胞碎片；2)将收集到的上清再次12000g，4℃，30min离心收集上清，去除乳脂蛋白、酪蛋白及其他细胞碎片；3)随后将最终收集到的上清50000rpm，4℃，2h进行超高速离心获得乳外泌体。实施例2外泌体rna抽提采用trizol一步法抽提奶外泌体样品中总rna，具体步骤如下：1)将超高速离心所得奶外泌体样品，放入到已加有1mltrizol试剂的2ml离心管中快速匀浆20s，可根据匀浆程度适当增加匀浆时间；2)匀浆液转移到1.5ml离心管中，4℃、12000rpm离心15min，以去除未匀浆完全的组织块。3)将上清转到另一新的1.5ml离心管中，加入1/5体积约0.2ml的氯仿，剧烈摇晃30s使样品充分混匀，室温静置5min，4℃、12000rpm离心15min。4)小心转移上层水相至另一新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，充分混匀后于-80℃沉淀过夜。5)12000rpm、4℃离心15min，去上清，加入1ml75％乙醇。吹打洗涤两次。12000rpm、4℃离心。在超净台内干燥rna沉淀5～10min，确保酒精完全挥发，加入适量depc处理水于干燥的rna样品中，可用灭菌轻轻吹打直至rna完全溶解。实施例3mir-2285t筛选包括以下步骤：1)选取摩拉水牛和荷斯坦奶牛泌乳中期奶作为研究对象；2)分别分离水牛和奶牛奶中外泌体(exosome)；3)通过高通量测序技术鉴定水牛和奶牛奶外泌体总mirna基因；4)生物信息学对水牛和奶牛奶外泌体总mirna基因进行差异表达分析；5)mir-2285t基因在水牛奶中极显著低表达，奶牛奶中极显著高表达。因此，mir-2285t可以作为mirna标记物用于区分水牛和奶牛奶。其中，摩拉水牛和荷斯坦奶牛均在文献“槟榔江水牛、摩拉水牛和荷斯坦奶牛血清中酶活性的测定[j].黑龙江畜牧兽医,2016(5):212-214”中公开。实施例4荧光定量pcr检测水牛与奶牛奶中mir-2285t的表达试剂：反转录试剂盒：primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)，#rr047q，takara；定量pcr试剂：fastqpcrmix，#rr430a，takara。相关实验物品去rnase处理：1)将所有玻璃器皿应用前均用depc冲洗侵泡，120℃高压20min，180℃高温烤干2小时以上。2)将塑料器皿(如：ep管/枪头)使用前需用0.1％depc水侵泡过夜，后控干液体，120℃高压20min，烤箱烤干备用。奶中mir-2285t基因合成1)奶总rna检测合格后立即进行mir-2285t基因的合成。反转录使用的是大连宝生物公司的反转录试剂盒(primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser)，首先按下表在0.2mlpcr管中配制去基因组反应体系，总反应体系为10μl，然后42℃放置2分钟。5×gdnaeraserbuffer2μlgdnaerase1μl总rna1000ngrnase-freedh2o加至10μl反应体系10μl2)在上述反应液中依次加入5×primescriptbuffer4μl，primescriptrtenzymemixi1μl，mir-2285t反转录引物0.5μl，内参基因下游引物0.5μl及rnase-freedh2o4μl，共计20μl。37℃反应30分钟，85℃反应15秒终止。然后加入180μlrnasefreedh2o稀释至200μl储存在-20℃，用于后续试验。定量分析1)本试验用大连宝生物公司fastqpcrmix试剂进行实时定量pcr分析。每个样品设置3个重复，每对引物设置3个阴性对照。以gapdh作为内参基因，反应体系及条件如下表：2×sybrpremixextaqii12.5μl上游引物(10μm)1μl下游引物(10μm)1μlcdna1.5μlrnase-freedh2oupto25μl反应体系25μl针对mir-2285t的反转录引物序列为seqidno：2；针对mir-2285t的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为seqidno：3，下游引物序列为seqidno：4；gapdh内参基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为seqidno：5，下游引物序列为seqidno：6。2)实时定量pcr反应条件：首先95℃预变性30秒；40个循环，每个循环95℃变性5秒，60℃退火30秒；循环结束后记录65～95℃范围内的溶解曲线。3)基因表达丰度用2-δδct法表示，在水牛和奶牛乳中mir-2285t相对表达结果见图1。根据图1可知，mir-2285t在水牛奶中表达量极显著低于奶牛奶，可作为区分水牛和奶牛奶的标志物。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>一种区分水牛和奶牛奶的mirna标记物及其应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>mir-2285t<400>1agaaucuggaugaacuuuuugg22<210>2<211>52<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>针对mir-2285t的反转录引物<400>2gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacccaaaaag52<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>针对mir-2285t的上游引物<400>3ggccagaatctggatga17<210>4<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>针对mir-2285t的下游引物<400>4gtgcagggtccgaggt16<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>gapdh内参基因的上游引物<400>5ctgccgcctggagaaacct19<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>gapdh内参基因的下游引物<400>6gctgtagccaaattcattgtcg22当前第1页12