本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用arms技术结合荧光探针的方法检测pah基因突变的试剂盒，以及上述检测pah基因突变的试剂盒的检测方法。
背景技术：
苯丙酮尿症(phenylketonuria，简称pku)是先天代谢性疾病的一种，为常染色体隐性遗传，由于基因突变导致肝脏中苯丙氨酸羟化酶(pah)缺陷从而引起苯丙氨酸(phe)代谢障碍所致，对中枢神经系统有一定的损伤。苯丙酮尿症患者血液中积累高浓度的phe，会对脑和神经系统产生一定的损伤。根据近几年的研究表明，血中高phe浓度虽未影响神经元树突的形态和其生存能力，却影响了突触的形成，从而造成神经系统的损害。此外，大多研究支持竞争抑制的观点，即浓度过高的phe会竞争性抑制其他大分子量中性氨基酸(largeneutralaminoacid,lnaa)流经脑部的血脑屏障进入大脑的过程,从而妨碍脑部的正常发育(1.horsterf,schwabma.phenylalaninereducessynapticdensityinmixedcorticalculturesfrommice.pediatrres,2006,59(4):544-548.)。因此在出生前对胎儿进行诊断，预防患儿出生，能够减少社会和家庭的诸多负担、提高人口素质，具有极高的临床应用价值。其中针对pah基因突变位点的基因诊断为目前该领域的一大热门。
pah基因于1983年由woo成功分离并克隆，1986年完成该基因的全长序列分析，该基因定位于12q22q24.2，全长约1.5mb。编码区包括13个外显子和12个内含子，转录时剪接内含子形成仅包含外显子的1353bp单链，翻译成含有451个氨基酸的酶单体，经聚合后成为有功能的pah酶(scrivercr,hurtubisem,koneckid,etal.pahdb2003:whatalocusspecificknowledgebaseando[j].hummutat,2003,21:333-344.)。迄今为止，在全世界范围内已发现500余种突变，其中60.14％为错义突变，13.4％为小缺失，10.93％为剪接位点突变，5.94％为沉默突变等等(数据来自：pahdb)。
突变阻滞扩增系统(amplificationrefractorymutationsystem,arms-pcr)，又名等位基因特异pcr(allelespecificpcr，aspcr)。taqdna聚合酶缺少3’-5’外切酶活性。在一定条件下pcr引物3’末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过pcr方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。一般设置两对引物：“normal”野生型引物，扩增时会被突变的模板阻滞；“mutant”突变型引物，扩增时会被野生型模板阻滞。一般情况下，通过引物3’端单个碱基的突变来区分等位基因效果并不理想。所以arms技术在大多数情况下还会人为的增加引物3’端附近的碱基的突变以达到区分等位基因的效果。由于arms所用的引物是从一段序列在3’末端及其附近人为的加入错配的突变位点的一套引物组合中，通过筛选出来的能够区分单个位点等位基因的引物，就保证了其高度的特异性。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提出一种检测采用arms技术结合荧光探针的方法检测pah基因突变的试剂盒，本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对外周血或血斑样本中pah基因突变检测，检测苯丙酮尿症的发病型，以有利于评价患儿及家属遗传关系及患病胎儿的诊断并为后续治疗方案选定提供依据。
本发明的第二个目的在于提出上述检测pah基因突变的试剂盒的检测方法。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
一种采用arms技术结合荧光探针检测pah基因突变的试剂盒，包括：(a)突变反应体系：包括0.3μl的pcr酶、7μl的突变反应液、4μl的dntp、和34.7μl的双蒸水；(b)abl反应体系：包括0.3μl的pcr酶、7μl的abl反应液、4μl的dntp和34.7μl的双蒸水；(c)分隔并集中包装上述试剂的试剂管的包装盒；
其中，所述的突变反应液包括一个或多个突变位点的特异性正向引物、反向引物、寡核苷酸探针及pcr反应缓冲液；
所述的突变反应液和abl反应液中的pcr缓冲液包含10mmol/l的tris-hcl缓冲液、50mmol/l的kcl溶液和3.0mmol/l的mgcl2溶液。
其中，所述突变反应液中正向引物的核苷酸序列设计在突变位点或突变位点上游40个碱基序列内。
所述的突变反应液中正向引物的3’端第一个碱基即为突变碱基，且在靠近突变点1-3个碱基位置引入错配碱基。
所述的突变反应液中反向引物及探针设计在突变位点下游300个碱基内。
所述的突变反应液中正向引物、反向引物和探针所用的浓度均为2～10pmol/μl。
所述的abl反应液中正向引物、反向引物和探针所用的浓度均为2～10pmol/μl。
所述的abl反应液中正向引物、反向引物的浓度为5pmol/μl，探针浓度为3pmol/μl。
所述的pcr酶包括热启动taq酶以及酶稀释液，其中热启动taq酶的用量为3～7u/人份；所述的dntp为四种脱氧核糖核苷酸混合物，浓度均为2.5mmol/l。
所述试剂盒的待检样本是外周血、血斑样本；所述试剂盒的一个试剂管检测一个或多个突变位点的突变型。
另外，本发明还要求保护所述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)标本采集
标本采集：抽取受检者静脉血3～5ml注入到含乙二胺四乙酸二钠或枸橼酸钠抗凝剂的采血管，立即轻缓颠倒采血管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭待用；或注射器采血1ml，取下针头将血滴在干血片上，将干血片置于干燥架上，室温避光干燥直至干透后，单独密闭包装待用；
(2)核酸提取
选用商品化核酸提取试剂盒，并由专业技术人员严格按照说明书进行操作提取核酸；
(3)pcr检测
(a)配置体系
突变反应体系：0.3μlpcr酶、7μl反应液、4μldntp、和34.7μl双蒸水充分混合，然后分装46μl至若干pcr反应管；
abl反应体系：将0.3μlpcr酶、7μl反应液、4μldntp、和34.7μl双蒸水充分混合，然后分装46μl至若干pcr反应管；
(b)加样、扩增
往上述装有突变反应体系的不同反应管中分别加入提取后的待测核酸4μl、阴性对照品-双蒸水4μl，往上述装有abl反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸4μl、阴性对照品-双蒸水4μl，各自盖紧反应管盖，8000rpm离心数秒后转移至pcr扩增仪进行扩增，扩增完成后收集荧光信号，并保存检测数据文件；
扩增时abi7300/7500荧光pcr扩增仪参数设置如下：
reporterdyel：对应发光基团
quencherdye：none
passivereference：none
lightcycler480荧光pcr扩增仪的参数设置如下：
“customizes”模块中选择相应发光基团滤片；
扩增的温度参数统一设置如下：95℃预变性3min，1个循环；95℃15sec，55℃40sec，40个循环。
(4)结果判定
如果增长曲线不呈s型曲线或ct值为空白，则判所检测的基因表达量小于检测限度；
如果增长曲线呈s型曲线且abl的ct值＜35，则样品的中对应pah基因为突变型。
优选的，所述全血标本在2～8℃条件下保存不应超过48小时；或者保存在-20±5℃待测，保存期为1个月，避免反复冻融；或者血斑标本于-20±5℃保存6个月。
与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统pcr试剂盒不同，real-timeqpcr试剂盒可以在扩增反应的进程中随时监测扩增产物的产生，从而大大提高了定量检测的准确性和精密度。众所周知，real-timeqpcr是在pcr扩增体系中，同时加入引物和5’、3’末端分别标记有荧光报告基团(例如6-famamidite羧基荧光素6)和荧光淬灭基团(例如6-羧基四甲基若丹明)的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，其序列保持完整，报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产生；而当pcr扩增反应进行时，dna聚合酶的5’-3’外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，因而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条dna链即有一个荧光分子产生，从而实现荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步，实时地监测整个pcr反应进程。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明使用适当的核酸分析软件分别对已知的突变的核苷酸序列进行同源性比较，在找到同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物和探针，由于所设计的引物和探针均具有互补于突变的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了突变检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度，同时设置了内参abl基因作为相对定量标准，用于整个反应体系的质量控制，在本试剂盒中可作为内参对起始细胞量进行校正；
2)适宜于real-timeqpcr扩增的热启动taq酶、2’-脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸结合的正向引物、反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、能够与内标核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和淬灭基团的检测内标的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液；
3)通过检测苯丙酮尿症的外周血或血斑样本中pah基因突变检测，检测发病型，以有利于评价患儿及家属遗传关系及患病胎儿的诊断。
4)由于内参基因abl在细胞中的表达相对恒定，因此，本试剂盒中选择abl作为内参对起始细胞量进行校正，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。
附图说明
图1为试剂盒检测突变型样本的结果，三条呈‘s’型的扩增曲线，且ct值＜35为突变型样本检测结果为阳性的指示；
图2为试剂盒检测野生型样本的结果，三条呈不规则形状的扩增曲线，ct值空白为野生型样本进行检测结果为阴性的指示。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种采用arms技术结合荧光探针的方法检测pah基因突变的试剂盒，包括：(a)突变反应液、abl反应液、pcr酶、和depc水；(b)分隔并集中包装上述试剂的试剂管的包装盒；
所述的突变反应液包括正向引物、反向引物、突变寡核苷酸探针、pcr反应缓冲液。
所述的abl反应液包括正向引物、反向引物、abl的寡核苷酸探针、pcr反应缓冲液。
所述的突变反应液和abl反应液中的pcr缓冲液包含10mmol/l的tris-hcl缓冲液、50mmol/l的kcl溶液和3.0mmol/l的mgcl2溶液。
所述pcr酶包括热启动taq酶以及酶稀释液。其中热启动taq酶的用量为3～7u/人份、酶稀释液为一般市售的酶稀释液。
所述的dntp为四种脱氧核糖核苷酸混合物，浓度均为2.5mm。
所述的突变反应液中引物和探针所用的浓度均为2～10pmol/μl，优选引物浓度为5pmol/μl、探针浓度为3pmol/μl。
所述的abl反应液中引物和探针所用的浓度均为2～10pmol/μl，优选引物浓度为5pmol/μl、探针浓度为3pmol/μl；所述试剂盒的待检样本是外周血或血斑样本。
实施例2
一种采用arms技术结合荧光探针的方法检测pah基因突变的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)标本采集：
抽取受检者静脉血3～5ml，注入含乙二胺四乙酸二钠或枸橼酸钠抗凝剂的采血管，立即轻缓颠倒采血管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭待用；或注射器采血1ml，取下针头将血滴在干血片上，将干血片置于干燥架上，室温避光干燥直至干透后，单独密闭包装待用。
(2)核酸提取
建议选用商品化核酸提取试剂盒，并由专业技术人员严格按照说明书进行操作。
(3)pcr检测
(a)配置体系
突变反应体系：将0.3μlpcr酶、7μl反应液、4μldntp、和34.7μl双蒸水充分混合，然后分装46μl至若干pcr反应管；
abl反应体系：将0.3μlpcr酶、7μl反应液、4μldntp、和34.7μl双蒸水充分混合，然后分装46μl至若干pcr反应管；
(b)加样、扩增
往上述装有突变反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸4μl、阴性对照品-双蒸水5μl，往上述装有abl反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸4μl、阴性对照品-双蒸水5μl，各自盖紧反应管盖，8000rpm离心数秒后转移至pcr扩增仪进行扩增，扩增完成后收集荧光信号，并保存检测数据文件；
扩增时abi7300/7500荧光pcr扩增仪参数设置如下：
reporterdyel：对应发光基团
quencherdye：none
passivereference：none
lightcycler480荧光pcr扩增仪的参数设置如下：
“customizes”模块中选择相应发光基团滤片；
扩增的温度参数统一设置如下：95℃预变性3min，1个循环；95℃15sec，55℃40sec，40个循环。荧光检测选择在55℃40sec这一环节。
以下要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行：
阴性质控品：突变检测孔及abl检测孔无荧光信号增长，无明显s型扩增曲线。
阳性参考品：突变检测孔及abl检测孔有荧光信号增长，曲线呈s型曲线，ct值＜35。
未知标本的abl的ct值必须＜35。
以上对本发明创造实施所提供的一种进行了详细的介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明创造实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明创造的限制。