本发明涉及医药技术领域，是一种天然产物isostrictiniin及其制备方法和应用。
背景技术：
肝纤维化是继发于慢性肝炎病毒感染、慢性酒精中毒、代谢性疾病以及持续胆汁淤积等引起的肝脏损伤后组织修复过程中的代偿反应。该病如得不到有效控制，可引起肝癌等多种并发症，严重危害着人类的健康。据流行病学调查显示，我国约有1.2亿病毒携带者，3000万慢性乙型肝炎患者，约25％慢性乙肝患者最终发展为肝硬化，甚至肝癌。“急性-慢性-肝纤维化-肝硬化-肝癌”是肝脏疾病的发生发展模式，其中肝硬化是不可逆的，而肝纤维化是可逆的。阻止肝纤维化的发生发展，能防止肝硬化及其并发症的发生。肝脏对各种慢性刺激进行损伤修复反应时，以胶原为主的细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)在肝内大量沉积，导致了肝纤维化的发生发展。肝星状细胞(hepaticstellatecell，hsc)是肝脏ecm的主要来源，hsc的表型激活和过度增殖是肝纤维化形成过程的关键所在。当肝脏受到病毒、化学物质、生物等多种因素损伤后，hsc在生长因子、细胞因子和炎症介质等的作用下激活增殖，开始表达α-sma，最终转变成肌成纤维细胞。肌成纤维细胞过度增殖，同时大量合成胶原，最终导致肝纤维化。因此，去除病因、减轻炎症和氧化应激、保护细胞不受损伤，抑制hsc活化、增殖、收缩，诱导hsc凋亡是肝纤维化治疗的有效途径之一。
isostrictiniin的化学名称为1-o-没食子酰-2,3-o-六羟基联苯二甲酰-β-d-葡萄糖，分子式为c27h22o18，分子量为634，结构式如图1所示；公开号为cn106038713a、名称为“睡莲花总黄酮提取物及其制备方法和应用”的专利文献公开了以睡莲花为原料，在睡莲花中提取的睡莲花总黄酮提取物所含黄酮含量的重量百分比在50％至80％、isostrictiniin含量的重量百分比在1.2％至3.0％、烟花苷含量的重量百分比在9.0％至16.0％、紫云英苷含量的重量百分比在4.5％至8.0％，isostrictiniin的得率为小于0.1％。但从睡莲花为原料提取的睡莲花总黄酮提取物中isostrictiniin的纯度低、得率低、成本高、不易于isostrictiniin的工业化生产；同时，到目前为止也没有相关文献对isostrictiniin在食品及日化用品领域、乙肝病毒感染及肝纤维化的治疗方面的相关报道。
技术实现要素：
本发明提供了一种天然产物isostrictiniin及其制备方法和应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决以睡莲花为原料提取的睡莲花总黄酮提取物中isostrictiniin的纯度低、得率低、成本高、不易于isostrictiniin的工业化生产；同时，到目前为止也没有相关文献对isostrictiniin在食品及日化用品领域、乙肝病毒感染及肝纤维化的治疗方面相关报道的问题。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种天然产物isostrictiniin，按下述方法得到：第一步，在睡莲花中加入乙醇溶液煮沸后回流提取2次至3次，每次回流提取1h至2h，提取后合并提取液并减压浓缩，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用去离子水溶解后，上大孔吸附树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以30％或50％的乙醇溶液洗脱，收集30％或50％的乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏b；第三步，浸膏b与等重量的聚酰胺拌样后，填充入树脂柱中得到聚酰胺树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以50％乙醇溶液洗脱，收集50％乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏c；第四步，浸膏c用去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再用30％甲醇溶液进行洗脱，收集甲醇洗脱物，甲醇洗脱物经减压浓缩并干燥至白色粉末，即为天然产物isostrictiniin。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述第一步中，乙醇溶液的加入量为睡莲花重量的8倍至20倍，乙醇溶液为30％至70％的乙醇溶液；或/和，第一步中，睡莲花为雪白睡莲的干燥花蕾或/和白睡莲的干燥花蕾。
上述第一步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.05至1.2，减压浓缩后得到浸膏a。
上述第二步中，浸膏a用3倍至10倍浸膏a重量的去离子水溶解；或/和，第二步中，大孔吸附树脂的型号为d101型或ab-8型。
上述第二步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.05至1.2，减压浓缩后得到浸膏b。
上述第三步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.05至1.2，减压浓缩后得到浸膏c。
上述第四步中，浸膏c用3倍至10倍浸膏b重量的去离子水溶解；或/和，第四步中，甲醇洗脱物减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，甲醇洗脱物减压浓缩的温度为45℃至60℃，甲醇洗脱物减压浓缩至质量百分含水率小于0.5％的白色粉末，即为天然产物isostrictiniin。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种天然产物isostrictiniin的制备方法，按下述步骤进行：第一步，在睡莲花中加入乙醇溶液煮沸后回流提取2次至3次，每次回流提取1h至2h，提取后合并提取液并减压浓缩，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用去离子水溶解后，上大孔吸附树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以30％或50％的乙醇溶液洗脱，收集30％或50％的乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏b；第三步，浸膏b与等重量的聚酰胺拌样后，填充入树脂柱中得到聚酰胺树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以50％乙醇溶液洗脱，收集50％乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏c；第四步，浸膏c用去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再用30％甲醇溶液进行洗脱，收集甲醇洗脱物，甲醇洗脱物经减压浓缩并干燥至白色粉末，即为天然产物isostrictiniin。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述第一步中，乙醇溶液的加入量为睡莲花重量的8倍至20倍，乙醇溶液为30％至70％的乙醇溶液；或/和，第一步中，睡莲花为雪白睡莲的干燥花蕾或/和白睡莲的干燥花蕾。
上述第一步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.05至1.2，减压浓缩后得到浸膏a。
上述第二步中，浸膏a用3倍至10倍浸膏a重量的去离子水溶解；或/和，第二步中，大孔吸附树脂的型号为d101型或ab-8型。
上述第二步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.05至1.2，减压浓缩后得到浸膏b。
上述第三步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.05至1.2，减压浓缩后得到浸膏c。
上述第四步中，浸膏c用3倍至10倍浸膏b重量的去离子水溶解；或/和，第四步中，甲醇洗脱物减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，甲醇洗脱物减压浓缩的温度为45℃至60℃，甲醇洗脱物减压浓缩至质量百分含水率小于0.5％的白色粉末，即为天然产物isostrictiniin。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种天然产物isostrictiniin在制备食品抗氧化剂或/和药品抗氧化剂或/和日化用品抗氧化剂中的应用。
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种天然产物isostrictiniin在制备防治乙肝病毒感染或/和肝纤维化药物中的应用。
本发明从睡莲花中得到的天然产物isostrictiniin较现有从睡莲花总黄酮提取物中的isostrictiniin纯度高、得率高、成本低，易于天然产物isostrictiniin的工业化生产；同时本发明首次公开了天然产物isostrictiniin在食品及日化用品领域、乙肝病毒感染及肝纤维化的治疗方面的应用，试验表明，本发明天然产物isostrictiniin具有较好的抗氧化、抗乙肝病毒及抗肝纤维化作用，能够应用于乙肝病毒感染及肝纤维化的治疗，并且能够作为抗氧化剂应用于药品、食品及化妆品领域。
附图说明
附图1为isostrictiniin的结构式。
附图2为本发明天然产物isostrictiniin与vitc的还原能力对比图。
附图3为本发明天然产物isostrictiniin与vitc的dpph·清除能力对比图。
附图4为本发明天然产物isostrictiniin与vitc的总抗氧化能力对比图。
附图5为本发明天然产物isostrictiniin对hsc-t6细胞增殖的影响图。
附图6为本发明天然产物isostrictiniin对hsc-t6中i、iii胶原mrna表达的影响图。
附图7为本发明天然产物isostrictiniin对hsc-t6中nf-κbmrna和caspase-3mrna表达的影响图。
附图8为本发明天然产物isostrictiniin对hsc-t6中smad2、phospho-smad2、smad3、phospho-smad3和smad7蛋白表达的影响图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液。
实施例1，该天然产物isostrictiniin按下述制备方法得到：第一步，在睡莲花中加入乙醇溶液煮沸后回流提取2次至3次，每次回流提取1h至2h，提取后合并提取液并减压浓缩，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用去离子水溶解后，上大孔吸附树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以30％或50％的乙醇溶液洗脱，收集30％或50％的乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏b；第三步，浸膏b与等重量的聚酰胺拌样后，填充入树脂柱中得到聚酰胺树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以50％乙醇溶液洗脱，收集50％乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏c；第四步，浸膏c用去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再用30％甲醇溶液进行洗脱，收集甲醇洗脱物，甲醇洗脱物经减压浓缩并干燥至白色粉末，即为天然产物isostrictiniin。本实施例1得到的天然产物isostrictiniin经hplc检测，归一化法计算isostrictiniin的纯度为98.0％至99.2％，得率为0.60％至0.80％；采用现有方法得到的isostrictiniin的纯度为1.2％至3.0％，得率小于0.1％；且本发明的成本较现有方法的成本降低了20％至50％。
实施例2，该天然产物isostrictiniin按下述制备方法得到：第一步，在睡莲花中加入乙醇溶液煮沸后回流提取2次或3次，每次回流提取1h或2h，提取后合并提取液并减压浓缩，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用去离子水溶解后，上大孔吸附树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以30％或50％的乙醇溶液洗脱，收集30％或50％的乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏b；第三步，浸膏b与等重量的聚酰胺拌样后，填充入树脂柱中得到聚酰胺树脂柱，后以去离子水洗脱除杂，再以50％乙醇溶液洗脱，收集50％乙醇洗脱物，经减压浓缩后，得到浸膏c；第四步，浸膏c用去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再用30％甲醇溶液进行洗脱，收集甲醇洗脱物，甲醇洗脱物经减压浓缩并干燥至白色粉末，即为天然产物isostrictiniin。
实施例3，作为上述实施例的优化，第一步中，乙醇溶液的加入量为睡莲花重量的8倍至20倍，乙醇溶液为30％至70％的乙醇溶液；或/和，第一步中，睡莲花为睡莲科睡莲属植物雪白睡莲nympahaeacandida的干燥花蕾或/和白睡莲nympahaeaalba的干燥花蕾。
实施例4，作为上述实施例的优化，第一步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.05至1.2，减压浓缩后得到浸膏a。
实施例5，作为上述实施例的优化，第二步中，浸膏a用3倍至10倍浸膏a重量的去离子水溶解；或/和，第二步中，大孔吸附树脂的型号为d101型或ab-8型。
实施例6，作为上述实施例的优化，第二步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.05至1.2，减压浓缩后得到浸膏b。
实施例7，作为上述实施例的优化，第三步中，减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，减压浓缩的温度为45℃至60℃，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.05至1.2，减压浓缩后得到浸膏c。
实施例8，作为上述实施例的优化，第四步中，浸膏c用3倍至10倍浸膏b重量的去离子水溶解；或/和，第四步中，甲醇洗脱物减压浓缩的压力为-0.09mpa至-0.1mpa，甲醇洗脱物减压浓缩的温度为45℃至60℃，甲醇洗脱物减压浓缩至质量百分含水率小于0.5％的白色粉末，即为天然产物isostrictiniin。
实施例9，该天然产物isostrictiniin按下述制备方法得到：第一步，称取雪白睡莲花的干燥花蕾(药材)20.0kg，在雪白睡莲花的干燥花蕾中加入8倍雪白睡莲花重量50％的乙醇溶液煮沸后回流提取3次，每次回流提取1h，提取后合并提取液，在压力为-0.09mpa、温度为55℃下减压浓缩，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.12，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用3倍浸膏a重量的去离子水混悬溶解后，上d101型大孔吸附树脂柱，后以10倍柱体积的去离子水洗脱除杂，再以50％的乙醇溶液洗脱，收集50％的乙醇洗脱物，在压力为-0.09mpa、温度为52℃下减压浓缩，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.11，得到浸膏b；第三步，浸膏b与等重量的聚酰胺拌样后，填充入树脂柱中得到聚酰胺树脂柱，后以10倍柱体积的去离子水洗脱除杂，再以50％乙醇溶液洗脱，收集50％乙醇洗脱物，在压力为-0.09mpa、温度为52℃下减压浓缩，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.13，得到浸膏c；第四步，浸膏c用10倍浸膏c重量的去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再用30％甲醇溶液进行洗脱，收集甲醇洗脱物，在压力为-0.1mpa、温度为45℃下减压浓缩，然后在压力为-0.1mpa、温度为50℃下干燥至质量百分含水率为0.23％的白色粉末，即为天然产物isostrictiniin。本实施例9得到的天然产物isostrictiniin经hplc检测，归一化法计算isostrictiniin的纯度为98.7％，得率为0.62％。
实施例10，该天然产物isostrictiniin按下述制备方法得到：第一步，称取雪白睡莲花的干燥花蕾(药材)2.0kg，在雪白睡莲花的干燥花蕾中加入20倍雪白睡莲花重量30％的乙醇溶液煮沸后回流提取3次，每次回流提取1h，提取后合并提取液，在压力为-0.09mpa、温度为55℃下减压浓缩，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.19，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用5倍浸膏a重量的去离子水混悬溶解后，上h1020型大孔吸附树脂柱，后以10倍柱体积的去离子水洗脱除杂，再以50％的乙醇溶液洗脱，收集50％的乙醇洗脱物，在压力为-0.09mpa、温度为52℃下减压浓缩，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.15，得到浸膏b；第三步，浸膏b与等重量的聚酰胺拌样后，填充入树脂柱中得到聚酰胺树脂柱，后以10倍柱体积的去离子水洗脱除杂，再以50％乙醇溶液洗脱，收集50％乙醇洗脱物，在压力为-0.09mpa、温度为55℃下减压浓缩，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.05，得到浸膏c；第四步，浸膏c用10倍浸膏c重量的去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再用30％甲醇溶液进行洗脱，收集甲醇洗脱物，在压力为-0.1mpa、温度为45℃下减压浓缩，然后在压力为-0.1mpa、温度为50℃下干燥至质量百分含水率为0.28％的白色粉末，即为天然产物isostrictiniin。本实施例10得到的天然产物isostrictiniin经hplc检测，归一化法计算isostrictiniin的纯度为98.1％，得率为0.73％。
实施例11，该天然产物isostrictiniin按下述制备方法得到：第一步，称取白睡莲的干燥花蕾(药材)2.0kg，在白睡莲的干燥花蕾中加入12倍白睡莲花重量70％的乙醇溶液煮沸后回流提取3次，每次回流提取1h，提取后合并提取液，在压力为-0.09mpa、温度为52℃下减压浓缩，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.09，减压浓缩后得到浸膏a；第二步，浸膏a用5倍浸膏a重量的去离子水混悬溶解后，上h1020型大孔吸附树脂柱，后以10倍柱体积的去离子水洗脱除杂，再以30％的乙醇溶液洗脱，收集30％的乙醇洗脱物，在压力为-0.09mpa、温度为52℃下减压浓缩，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.12，得到浸膏b；第三步，浸膏b与等重量的聚酰胺拌样后，填充入树脂柱中得到聚酰胺树脂柱，后以10倍柱体积的去离子水洗脱除杂，再以50％乙醇溶液洗脱，收集50％乙醇洗脱物，在压力为-0.1mpa、温度为45℃下减压浓缩，减压浓缩至温度为25℃下的相对密度为1.15，得到浸膏c；第四步，浸膏c用10倍浸膏c重量的去离子水溶解后，上mcigelchp20p色谱柱，后以去离子水洗脱除杂，再用30％甲醇溶液进行洗脱，收集甲醇洗脱物，在压力为-0.1mpa、温度为45℃下减压浓缩，然后在压力为-0.1mpa、温度为50℃下干燥至质量百分含水率为0.32％的白色粉末，即为天然产物isostrictiniin。本实施例10得到的天然产物isostrictiniin经hplc检测，归一化法计算isostrictiniin的纯度为98.7％，得率为0.65％。
实施例12，该天然产物isostrictiniin在制备食品抗氧化剂或/和药品抗氧化剂或/和日化用品抗氧化剂中的应用。
实施例13，该天然产物isostrictiniin在制备防治乙肝病毒感染或/和肝纤维化药物中的应用。
实施例14，上述实施例得到的天然产物isostrictiniin在制备食品抗氧化剂或/和药品抗氧化剂或/和日化用品抗氧化剂中的应用如下：
本实施例测定了本发明天然产物isostrictiniin的抗氧化能力。
(一)实验方法
1.还原能力测定
在反应管中先后加入2.5ml、ph＝7.4的磷酸缓冲溶液、1.0ml上述实施例得到的天然产物isostrictiniin配制成不同浓度的isostrictiniin溶液和1.0ml、1％铁氰化钾溶液，均匀混合；恒温50℃条件下反应20min后，冷却，加入2.5ml、10％的三氯乙酸和4.0ml蒸馏水后，再加入1.0ml、0.1％的三氯化铁溶液混合均匀，静置10min后，于在波长700nm下测吸光度a。
2.dpph·的清除能力测定
将上述实施例得到的天然产物isostrictiniin配制成不同浓度的isostrictiniin溶液，取不同浓度的isostrictiniin溶液0.5ml加入到2.5ml、6.5×10-5mol/l的dpph溶液中，混匀，室温下放置15min后，在517nm处吸光度，计算清除率及ic50值。清除率(y)按下式计算：y＝[1-(aj-ak)/am]×100％式中am、aj和ak分别为dpph乙醇溶液与水混合液、dpph乙醇溶液与试样混合液以及乙醇与试样混合液在517nm处的吸光度值。
3.frap法
分别准确移取0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l和0.6mmol/l的feso4溶液0.2ml于反应管中，先后加入6.0mlfrap溶液和0.6ml蒸馏水，37℃下反应10min，于593nm处，测定吸光度a，并以供试品溶液c(mg/ml)为横坐标，吸光度值a为纵坐标，绘制标准曲线。分别准确移取0.5ml上述实施例得到的天然产物isostrictiniin配制成不同浓度的isostrictiniin溶液反应管中，加入6.0mlfrap工作液及0.6ml蒸馏水，混合均匀，于37℃的条件下反应10min后在593nm处测定吸光度a；根据a值，在标准曲线上求得相应feso4的浓度(μmol/l)，即frap值。
(二)实验结果
1.还原能力
图2为本发明天然产物isostrictiniin与vitc的还原能力对比图；由图2可以看出，随着本发明天然产物isostrictiniin和vitc的浓度增大，其吸光度值在不断增加，即对三价fe的还原能力在不断增强，呈现出良好的剂量效应依赖关系，其中本发明天然产物isostrictiniin的还原能力强于vitc。
2.对dpph·的清除能力
图3为本发明天然产物isostrictiniin与vitc的dpph·清除能力对比图；由图3可以看出，本发明天然产物isostrictiniin对dpph·具有较强的清除作用，几乎接近于vitc，并且呈现出良好的量效关系，它们的ic50分别为和8.95μg/ml和6.33μg/ml。
3.总抗氧化能力
frap测定结果显示，在593nm处，feso4的浓度与吸光度在0.1～0.6mmol/l范围内呈线性关系，线性回归方程为:y＝1.6078x+0.0575(r＝0.999)。将样品溶液的a值代入feso4标准曲线方程，经计算得frap(mmol/g)。frap值越大，样品的抗氧化能力越强。图4为本发明天然产物isostrictiniin与vitc的总抗氧化能力对比图；样品浓度越大，其frap值就越大，总抗氧化能力也就越强，由图4可知，本发明天然产物isostrictiniin的抗氧化能力略强于相同浓度下的vitc的总抗氧化能力。
实施例15，上述实施例得到的天然产物isostrictiniin在制备防治乙肝病毒感染药物中的应用如下：
本实施例测定了本发明天然产物isostrictiniin的抗乙肝病毒活性。
(一)实验方法
待测样品先用dmso溶解为母液，临用前用细胞培养液稀释为5个浓度。hepg2.2.15细胞在96孔细胞培养板培养48小时后，加入上述所配不同浓度含药培养液，继续培养9天，观察毒性(平行三孔)。
hepg2.2.15细胞在96孔细胞培养板培养48小时后，加入上述所配不同浓度含药培养液，继续培养9天(每三天换液一次)，收集上清液，按试剂盒说明书检测hbsag和hbeag(平行三空)；取上述上清液100μl，加100μl8％peg8000，震荡混匀，4℃静置4小时或过夜放置，15000rpm，4℃离心15min，弃去上清液；加100μl、12％的chelex-100，震荡混匀；100℃加热10min，取上清液2μl，进行荧光定量pcr。
(二)实验结果
本发明天然产物isostrictiniin抗乙肝病毒细胞毒性和活性结果(n＝3)见表1所示，从表1可以看出，本发明天然产物isostrictiniin对乙肝表面抗原hbsag和hbeag具有明显的抑制作用，其ic50分别为121.4μg/ml和115.7μg/ml，且其tc50大于200μg/ml；实验数据说明本发明天然产物isostrictiniin具有较好的抗乙肝病毒作用，且毒性小。
实施例16，上述实施例得到的天然产物isostrictiniin在制备防治肝纤维化药物中的应用如下：
本实施例利用肝星状细胞(hsc-t6)研究了本发明天然产物isostrictiniin的抗纤维化作用及其作用机制。
(一)实验方法
1.mtt法测定本发明天然产物isostrictiniin对hsc-t6细胞的抑制
常规制备细胞悬液，将hsc-t6细胞稀释成5×104/ml后接种于96孔板(100μl/孔)。细胞接种后，在37℃，5％co2培养箱预培养24h；24h后弃上清，除正常对照组外，本发明天然产物isostrictiniin药物组分别加入终浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的含药培养液，继续培养48h后，加入20μl/孔mtt溶液(5.0mg/ml)，继续培养4h后，吸去上清液，加入二甲基亚砜(dmso)150μl/孔，轻轻振荡10min，用酶标仪于490nm波长处测定a值，计算细胞生长抑制率：抑制率(％)＝(1-各浓度平均吸光度值÷空白组平均吸光度值)×100％。
2.本发明天然产物isostrictiniin对nf-κbmrna、caspase-3mrna以及i、iii胶原mrna表达的影响
hsc-t6细胞接种于培养孔板内预培养72h后，分为正常对照组、tgf-β1刺激的hsc-t6模型组、tgf-β1+不同终浓度的本发明天然产物isostrictiniin(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)给药组，tgf-β1的终浓度为5.0ng/ml。再培养48小时后收集细胞进行检测。采用trizol法提取细胞总rna，紫外分光光度计检测其纯度和浓度。采用合格的rna标本，按takara反转录说明书合成cdna。然后以sybrgreeni作为荧光标记物，荧光定量pcr法扩增各组细胞tgf-β1、collagenⅰmrna的表达；sybergreen荧光定量pcr扩增目的基因：sybr反应体系共20ul：2xmastermix10ul，20xsybrsolution1.25ul，正向引物1ul，反向引物1ul，dna模板1ul，不足用去离子水补齐。反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，扩增35个循环，72℃延伸5min。(所有指标退火温度均为55℃)。目的基因collageni、collageniii、caspase3、nf-kbp65、β-actin引物，由上海生物工程公司设计合成。cdna第一链合成反应液在37℃反转录60min，95℃5min灭活反转录酶并终止反应。采用realtimeq-pcr方法用基因特异的引物扩增稀释过的cdna，分别求算4个稀释度目的基因和管家基因的ct值，以每个稀释度的δct(ct目的基因-ct管家基因)值相对稀释倍数的对数值作图。realtimeq-pcr结果以内参gapdh为基准，2-△△ct法对mrna的表达进行相对定量分析。
3.本发明天然产物isostrictiniin对tgfβ1/smad信号传导通路的影响
实验分为正常对照组、tgf-β1刺激的hsc-t6模型组、tgf-β1+不同终浓度的本发明天然产物isostrictiniin(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)给药组；收集各处理组细胞，ripa裂解液提取细胞总蛋白，bca法测定蛋白质含量，实验反应条件同“2.本发明天然产物isostrictiniin对nf-κbmrna、caspase-3mrna以及i、iii胶原mrna表达的影响”；取等量的蛋白质样品30μg，sds-page凝胶电泳，100v恒压转膜70min至100min，5％bsa封闭，分别加入基础抗体(smad2兔多克隆抗体、p-smad2兔单克隆抗体、smad3抗体、p-smad3兔单克隆抗体均为1:1000稀释，smad7抗体1:200稀释，β-actin抗体1:5000稀释)，4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗，室温孵育2h，显色剂显影，geldocxr凝胶成像仪扫描，geldoc软件分析结果；以β-actin表达水平作为内参照。实验重复3次。
(三)实验结果
实验结果显示，本发明天然产物isostrictiniin能有效抑制hsc-t6细胞的增殖，下调tgf-β1促进的nf-κbmrna、caspase-3、mrna、i和iii胶原mrna表达的表达，下调tgf-β1促进的smad2/3蛋白的表达、提高smad7蛋白的表达；说明本发明天然产物isostrictiniin具有较好的抗肝纤维化作用。
1.本发明天然产物isostrictiniin对hsc-t6细胞增殖的影响
图5为本发明天然产物isostrictiniin对hsc-t6细胞增殖的影响图；从图5可以看出，不同浓度的本发明天然产物isostrictiniin(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml)对hsc-t6细胞的的抑制率分别为35.45％、49.62％、52.71％和61.60％，ic50值为71.66μg/ml；结果说明本发明天然产物isostrictiniin对肝星状细胞hsc-t6细胞的增殖具有明显的抑制作用。
2.本发明天然产物isostrictiniin对nf-κbmrna、caspase-3mrna以及i、iii胶原mrna表达的影响
图6为本发明天然产物isostrictiniin对hsc-t6中i、iii胶原mrna表达的影响图；图6中mean±sd,n＝3；与正常组相比，#p<0.05；与模型组相比，*p<0.05。i,control；ii,model(tgf-β1)；iii,tgf-β1+isostrictiniin(200μg/ml)；iv,tgf-β1+isostrictiniin(100μg/ml)；v,tgf-β1+isostrictiniin(50μg/ml)；vi,tgf-β1+isostrictiniin(25μg/ml)。图7为本发明天然产物isostrictiniin对hsc-t6中nf-κbmrna和caspase-3mrna表达的影响图；图7中mean±sd,n＝3；与正常组相比，#p<0.05；与模型组相比，*p<0.05。i,control；ii,model(tgf-β1)；iii,tgf-β1+isostrictiniin(200μg/ml)；iv,tgf-β1+isostrictiniin(100μg/ml)；v,tgf-β1+isostrictiniin(50μg/ml)；vi,tgf-β1+isostrictiniin(25μg/ml)。从图6和图7可以看出，与正常组比较，tgf-β1可明显促进i和iii型胶原mrna表达，并明显上调nf-κbmrna和caspase-3mrna的表达(p<0.05)。用睡莲花isostrictiniin干预后，nf-κbmrna、caspase-3mrna、i和型iii胶原mrna表达显著降低(p<0.05)。
3.本发明天然产物isostrictiniin对tgfβ1/smad信号传导通路的影响
本发明天然产物isostrictiniin对tgf-β1活化的hsc-t6中smad2、phospho-smad2、smad3,phospho-smad3和smad7蛋白表达的影响见表2所示；图8为本发明天然产物isostrictiniin对hsc-t6中smad2、phospho-smad2、smad3、phospho-smad3和smad7蛋白表达的影响图；图8中mean±sd,n＝3；i,control；ii,model(tgf-β1)；iii,tgfβ1+isostrictiniin(200μg/ml)；iv,tgfβ1+isostrictiniin(100μg/ml)；v,tgfβ1+isostrictiniin(50μg/ml)；vi,tgfβ1+isostrictiniin(25μg/ml)。从表2和图8可以看出，与模型组相比，不同剂量组的本发明天然产物isostrictiniin均能显著下调smad2、p-smad2、smad3和p-smad3的表达，且可明显上调smad7的表达；结果说明本发明天然产物isostrictiniin可通过影响tgfβ1/smad信号传导通路而发挥抗肝纤维化的作用。
综上所述，本发明从睡莲花中得到的天然产物isostrictiniin较现有从睡莲花总黄酮提取物中的isostrictiniin纯度高、得率高、成本低，易于天然产物isostrictiniin的工业化生产；同时本发明首次公开了天然产物isostrictiniin在食品及日化用品领域、乙肝病毒感染及肝纤维化的治疗方面的应用，试验表明，本发明天然产物isostrictiniin具有较好的抗氧化、抗乙肝病毒及抗肝纤维化作用，能够应用于乙肝病毒感染及肝纤维化的治疗，并且能够作为抗氧化剂应用于药品、食品及化妆品领域。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
表1
表2
和正常对照组比较，#p<0.01；和模型组比较，*p<0.01。