本发明涉及一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
l-赖氨酸是人类和动物所必需的、自身不能合成的八大必需氨基酸之一。由于l-赖氨酸具有多种生理功能，如平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等，因此广泛应用于饲料工业、医药工业及食品工业中。l-赖氨酸生产方法主要有三种：蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业生产l-赖氨酸的主要方法。因此，选育具有自主知识产权的、高生产效率的、低副产物积累的l-赖氨酸生产菌株，对拓宽产品应用范围和提高利润空间，实现企业可持续发展具有重要意义。
研究报道，多种微生物可以用于生产l-赖氨酸，其中国内外用于工业化生产l-赖氨酸的菌株多为谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)及其亚种和大肠杆菌(escherichiacoli)的工程菌株。以葡萄糖为原料时，c.glutamicum中有5个途径参与l-赖氨酸合成：糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸(tca)循环、补给途径(co2固定反应)和l-赖氨酸终端合成途径(图1所示)。需要指出的是，c.glutamicum中每合成1moll-赖氨酸需要消耗4molnadph。因此，为了提高c.glutamicum生物合成途径中l-赖氨酸的积累，提高c.glutamicum代谢途径中nadph量或降低l-赖氨酸合成途径中nadph需求量是非常重要的策略。然而，我们前期研究发现，胞内过量的nadph会阻碍细胞对糖的利用，降低菌体生长量和l-赖氨酸积累量，其原因是胞内过量的nadph打破了胞内氧化还原平衡，从而限制了菌体生长和合成途径中关键酶活力。因此，维持胞内氧化还原平衡，对提高l-赖氨酸积累具有重要意义。
异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase,idh)在生物体内有两种形式，即以nad+为电子受体的nad+-依赖型idh(nad-idh)和以nadp+为电子受体的nadp+-依赖型idh(nadp-idh)。nad-idh主要存在于真核生物线粒体中，也存在少数的细菌和古细菌等原核生物中，如嗜酸氧化硫硫杆菌(acidithiobacillusthiooxidans)、运动发酵单胞菌(zymomonasmobilis)、变异链球菌(streptococcusmutans)等。nad-idh在tca循环中主要催化异柠檬酸氧化脱羧，生成co2和α-酮戊二酸，同时还生成还原态辅酶nadh，所生成的nadh再通过氧化呼吸链产生大量的atp，直接用于机体的供能。nadp-idh广泛存在于真核生物各个细胞器(如叶绿体、线粒体、过氧化物酶体以及胞质)和原核细胞中。nadp-idh在tca循环中虽然也是催化异柠檬酸氧化脱羧生成co2和α-酮戊二酸，但同时生成的是还原态辅酶nadph，用于维持细胞内的还原状态以增强细胞抗氧化应激的能量，并且提供还原力以进行维生素、氨基酸等物质的生物合成。不同细菌的idh对nad+和nadp+的亲和力也不同，如e.coli中idh对nadp+的亲和性是对nad+亲和性的7000倍，而s.mutans中idh在以nadp+为辅因子时不表现出酶活力。和其他已发现的生物体中的idh一样，c.glutamicum中idh由基因icd编码，催化异柠檬酸氧化脱羧生成co2和α-酮戊二酸，同时生成还原态辅酶nadph。
现有的谷氨酸棒杆菌l-赖氨酸产量不高主要是由于nadph含量不足，从而限制了l-赖氨酸的进一步增加，本实验室尝试将菌株中nad+-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,nad-gadph)替换成来源于丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)中的nadp-gadph，所获得的重组菌株虽然在一定程度上增加l-赖氨酸产量，但是由于胞内nadh不足以及积累了过多的nadph，从而限制菌体生长、糖的利用率以及l-赖氨酸生产效率。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种合成l-赖氨酸能力提高的谷氨酸棒杆菌。为了解决上述技术问题，本发明将重组菌株c.glutamicumrg中nadp-idh替换成来源于s.mutans中nad-idh，获得重组菌株。该重组菌株提高了idh对nad+的亲和力而降低了对nadp+的亲和力，在一定程度上增加了胞内nadh的合成，同时解除了c.glutamicumrg发酵生产l-赖氨酸过程中nadph供应过剩的缺点，提高了菌株合成l-赖氨酸的能力。
本发明的第一个目的是提供一种提高谷氨酸棒杆菌l-赖氨酸产量的方法，所述方法是将谷氨酸棒杆菌中nadp+-依赖型异柠檬酸脱氢酶替换为变异链球菌来源的nad+-依赖型异柠檬酸脱氢酶。
本发明的第二个目的是提供一种l-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌将谷氨酸棒杆菌rg(c.glutamicumrg)中nadp+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(nadp-idh)替换为变异链球菌(s.mutans)来源的nad+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(nad-idh)。
在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌rg的构建方法是将谷氨酸棒杆菌中nad+-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(nad-gadph)替换成来源于丙酮丁醇梭菌中的nadp-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(nadp-gadph)。
在本发明的一种实施方式中，所述nad+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的核苷酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以pk18-mbpmt作为载体。
本发明的第三个目的是提供所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，所述方法具体是：
(1)s.mutans中nad-idh编码基因icdsm的获得
根据s.mutansua159icd的核苷酸序列，在其基因上下游加入限制性内切酶xmaiii酶切位点序列，通过基因合成获得含有目的基因的重组质粒puc57/icdsm；
(2)整合型载体pk18-mbpmt/δicdcg的构建
根据c.glutamicumatcc13032icd基因序列设计icdcg基因上下游以及中间引物，以c.glutamicumrg基因组为模板，进行pcr，获得在3’端和5’端有相同限制性内切酶xmaiii的pcr产物，将以上述pcr产物与整合型载体pk18-mbpmt相连构建重组质粒pk18-mbpmt/δicdcg；
(3)重组菌c.glutamicumrgi的构建
通过xmaiii酶酶切回收icdsm片段，将icdsm片段与同样经过xmaiii酶酶切后的pk18-mbpmt/δicdcg整合型载体相连构建重组质粒pk18-mbpmt/δicdcg::icdsm，电击转化c.glutamicumrg，筛选获得重组菌c.glutamicumrgi。
本发明的第四个目的是提供所述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产l-赖氨酸的方法，所述方法是将重组菌c.glutamicumrgi接种到种子培养基中，28-32℃，800-1200r·min-1培养8～15h；以5～15％接种量，接种于发酵培养基中，28-32℃，800-1200r·min-1培养30～50h。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基是：葡萄糖3-8g·l-1，蛋白胨8-12g·l-1，酵母膏3-8g·l-1，nacl8-12g·l-1。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基是：葡萄糖30-50g·l-1，(nh4)2so410-30g·l-1，尿素3-8g·l-1，kh2po40.5-1.5g·l-1，k2hpo4·3h2o0.5-1.5g·l-1，mgso4·7h2o0.2-0.3g·l-1，3-(n-吗啡啉)-丙磺酸40-45g·l-1，l-蛋氨酸0.2-0.3g·l-1，cacl20.005-0.015g·l-1，feso4·7h2o0.005-0.015g·l-1，mnso4·h2o0.005-0.015g·l-1，znso4·7h2o0.005-0.015g·l-1，cuso4·5h2o0.0001-0.0003g·l-1，nicl2·6h2o0.00001-0.00003g·l-1，生物素0.0001-0.0003g·l-1，原儿茶酸0.00002-0.00004g·l-1，发酵过程中通过添加8-12g·l-1caco3调节ph。
本发明的第五个目的是提供所述重组谷氨酸棒杆菌在饲料工业、医药工业或食品工业中的应用。
本发明的有益效果是：本发明通过将c.glutamicumrg中tca循环关键酶nadp-idh编码基因icdcg替换成s.mutans中nad-idh编码基因icdsm，改变idh蛋白结构中辅因子结合域的结构，获得了更青睐利用nad+作为辅因子的重组菌株c.glutamicumrgi，从而实现胞内辅因子平衡，获得高产l-赖氨酸的重组菌株。
附图说明
图1是以葡萄糖为原料时，c.glutamicum中参与l-赖氨酸合成的代谢途径；
图2是出发菌株c.glutamicumrg葡萄糖代谢、菌体生长、产物积累以及胞内辅因子变化情况；其中，a-葡萄糖、菌体生长和l-赖氨酸变化曲线；b-副产物(有机酸和氨基酸)变化曲线；c-胞内辅因子(nadh和nadph)变化情况；缩写说明：glc葡萄糖；lysl-赖氨酸；dcw菌体干重；vall-缬氨酸；leul-亮氨酸；ilel-异亮氨酸；thrl-苏氨酸；glul-谷氨酸；lac乳酸；eth乙醇；
图3是重组菌株c.glutamicumrgi葡萄糖代谢、菌体生长、产物积累以及胞内辅因子变化情况；编号说明：a-葡萄糖、菌体生长和l-赖氨酸变化曲线；b-副产物(有机酸和氨基酸)变化曲线；c-胞内辅因子(nadh和nadph)变化情况。缩写说明：glc葡萄糖；lysl-赖氨酸；dcw菌体干重；vall-缬氨酸；leul-亮氨酸；ilel-异亮氨酸；thrl-苏氨酸；glul-谷氨酸；lac乳酸；eth乙醇。
具体实施方式
本实验室通过传统诱变方法，筛选得到的一株产l-赖氨酸突变菌株谷氨酸棒杆菌jl-6(c.glutamicumjl-6)，该菌经摇瓶发酵产l-赖氨酸14.5g/l。将该菌株中nad+-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,nad-gadph)替换成来源于丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)中的nadp-gadph，获得重组菌株c.glutamicumrg。以其作为出发菌株为例，实施本发明的技术方案，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：重组菌株c.glutamicumrgi的构建
根据文献报道，少数的细菌和古细菌等原核生物中存在nad-idh，如嗜热氢细菌(hydrogenobacterthermophilus)、嗜酸氧化硫硫杆菌(a.thiooxidans)、猪链球菌(streptococcussuis)、运动发酵单胞菌(z.mobilis)和变异链球菌(s.mutans)。为此我们前期通过比较上述5株菌中nad-idh对辅因子nad+和nadp+亲和力，发现来源于s.mutans中的nad-idh对辅因子nad+亲和力要明显小于其他四株菌中的nad-idh。因此，我们选择来源于s.mutans中的nad-idh作为后期实验考查因素。
利用基因合成的方法获得来源于s.mutans中nad-idh编码基因icdsm，随后利用携带抗生素抗性与条件致死型标记sacb双标记的新型整合型载体pk18-mbpmt，通过两次同源重组替换c.glutamicumrg中自身基因icdcg，获得重组菌株c.glutamicumrgi：
(1)s.mutans中nad-idh编码基因icdsm的获得
根据genbank中streptococcusmutansua159icd基因序列，在其基因上下游加入限制性内切酶xmaiii酶切位点序列，并将组合好的序列提交给通用生物系统(安徽)有限公司进行合成，获得含有目的基因的重组质粒puc57/icdsm。
(2)整合型载体pk18-mbpmt/δicdcg的构建
根据genbank中c.glutamicumatcc13032icd基因序列的上游序列(seqidno.2)和下游序列(seqidno.3)设计icdcg基因上下游以及中间引物，引物序列如表1。以c.glutamicumrg基因组为模板，分别以icdcg-l-f/icdcg-l-r和icdcg-r-f/icdcg-r-r为引物pcr，获得在3’端和5’端有相同限制性内切酶xmaiii的pcr产物。将以上述pcr产物整合型载体pk18-mbpmt相连构建重组质粒pk18-mbpmt/δicdcg。
表1.pcr扩增所需引物序列(下划线为酶切位点)
(3)重组菌c.glutamicumrgi的构建
采用限制性内切酶xmaiii酶切重组质粒puc57/icdsm。随后采用胶回收试剂盒回收icdsm片段。将icdsm片段与经相同限制性内切酶酶切后的线性化pk18-mbpmt/δicdcg整合型载体相连构建重组质粒pk18-mbpmt/δicdcg::icdsm。将验证正确的质粒pk18-mbpmt/δicdcg::icdsm电击转化c.glutamicumrg，经lbhis+km固体培养基筛选，获得第一次同源重组转化子。再分别将目标转化子在含蔗糖的培养基中进行胁迫二次重组筛选，最终在lbg平板上进行划线分离并挑取多个转化子。对发生第二次同源重组的菌株进行回复野生型/基因突变型的鉴定。提取转化子染色体，以目标基因icdsm的上下游引物进行pcr并对pcr产物进行测序鉴定。鉴定正确的转化子命名为c.glutamicumrgi。
实施例2：出发菌c.glutamicumrg和重组菌株c.glutamicumrgi的idh酶活力测定
取冻管保藏的菌种接种含有0.25g·l-1的l-蛋氨酸和40g·l-1葡萄糖的cgxii培养基(即cgxiimg培养基)中，30℃振荡培养过夜，并于10000r·min-1离心收集菌体。随后，将菌体悬浮于tris-hcl缓冲液(ph8.0)中并于超声波破碎法制备粗酶液。粗酶液采用比色法进行酶活测定(a340nm)。酶反应体系：20mmol·l-1tris-hcl缓冲液(ph8.0)、1mmol·l-1dl-异柠檬酸三钠、2mmol·l-1mgcl2、0.5mmol·l-1nadp+或0.5mmol·l-1nad+；反应温度：30℃；反应时间：≥300s。一个酶活力单位(u)定义为在测定条件下每分钟生成1μmolnadph或nadh所需的酶量。经测定，重组菌c.glutamicumrgi只有在以nad+为辅因子时表现出idh酶活力，而出发菌在以nadp+为辅因子时表现出很强的idh酶活力，结果如表2所示。
表2.不同菌株的idh酶活力测定
实施例3：出发菌c.glutamicumrg和重组菌株c.glutamicumrgi胞内辅因子的测定
取单菌落接种于cgxiimg液体培养基中，30℃、100r·min-1摇床培养约10h，4℃，6000r·min-1离心收集菌体，并洗涤菌体三次，去除残留的细胞外代谢物。随后，以酸性抽提液(0.5mol·l-1hcl)提取氧化型吡啶核苷酸(nad+和nadp+)，以碱性抽提液(0.5mol·l-1naoh)提取还原型吡啶核苷酸(nadh和nadph)。随后，借助从biovision公司购置的定量分析试剂盒，利用酶循环法测定nad(p)+和nad(p)h的浓度并计算nadh/nad+和nadph/nadp+，其中以nad/nadhquantificationcolorimeterickit特异性检测nad+和nadh，以nadp/nadphquantificationcolorimeterickit特异性检测nadp+和nadph，具体步骤参照试剂盒说明书的方法进行，结果如图2c、图3c所示。
实施例4：出发菌c.glutamicumrg和重组菌株c.glutamicumrgi发酵产l-赖氨酸
培养基：①种子培养基(g·l-1)：葡萄糖5，蛋白胨10，酵母膏5，nacl10，ph7.0，121℃灭菌20min；②发酵培养基(即cgxiimg；g·l-1)：葡萄糖40，(nh4)2so420，尿素5，kh2po41，k2hpo4·3h2o1，mgso4·7h2o0.25，3-(n-吗啡啉)-丙磺酸42，l-蛋氨酸0.25，cacl20.010，feso4·7h2o0.01，mnso4·h2o0.01，znso4·7h2o0.01，cuso4·5h2o0.0002，nicl2·6h2o0.00002，生物素0.0002，原儿茶酸0.00003，115℃灭菌10min。发酵过程中通过添加10g·l-1caco3调节ph。
将上述经验证的重组菌株c.glutamicumrgi和出发菌c.glutamicumrg分别进行摇瓶发酵实验，从新鲜活化的斜面培养基中挑取一满环菌体(对照菌及重组菌)于种子培养基中(25ml/250ml)，30℃，1000rmin-1往复式摇床培养12h；以10％接种量，接种于发酵培养基中，30℃，1000rmin-1往复式摇床培养40h，分时间区段测定l-赖氨酸、葡萄糖及生物量，结果与出发菌c.glutamicumrg相比，结果如图2a、图3a所示。
此外，分别采用高效液相色谱仪和氨基酸分析仪测定出发菌c.glutamicumrg和重组菌株c.glutamicumrgi中副产物积累情况(包括有机酸和氨基酸)，结果如图2b、图3b所示。
重组菌c.glutamicumrgi经上罐实验(5l发酵罐)，l-赖氨酸积累量达121.4g/l。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法
<160>9
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1182
<212>dna
<213>streptococcusmutans
<400>1
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<211>720
<212>dna
<213>corynebacteriumglutamicum
<400>2
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<213>（人工序列）
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<212>dna
<213>（人工序列）
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<211>18
<212>dna
<213>（人工序列）
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