本发明涉及细胞生物学和分子生物学领域，具体地说，涉及一种提高牛体外胚胎制备效率的方法。
背景技术：
牛体外受精技术包括卵母细胞体外收集与成熟、精子体外获能与精卵体外受精，及受精卵体外培养等过程。1977年，iritane和niwa获得了世界首例体外受精牛。我国的体外受精研究开始于80年代后期，在前人研究的基础上，我国的进展很快。1989年，旭日干院士等成功培育出我国第一例体外受精牛。此后，范必勤、卢克焕、石德顺等研究团队也先后获得了体外受精牛。目前为止，由于胚胎体外生产技术的广泛利用，大多数家养动物的后代已经成功获得。牛虽是家畜体外受精中较早研究的动物，但其生产效率却不尽人意。
混合系白血病(mll1)是一种h3k4甲基转移酶，抑制mll1酶的活性对于mll1融合蛋白引起的急性白血病是一种新的治疗策略。当wdr/mll蛋白相互作用时，mll1酶才具有活性。mm102(c35h49f2n7o4·cf3co2h)是wdr/mll蛋白相互作用的抑制剂。在白血病细胞表达mll1-af9融合基因时，抑制mll1甲基转移酶的活性和mll1诱导的hoxa9和meis-1基因的表达。目前，mm102在提高胚胎发育率方面还没有研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种提高牛体外胚胎制备效率的方法。通过在体外受精后的胚胎发育过程中添加mm102，探究mm102对牛胚胎发育的影响，为家畜体外受精及提高囊胚率提供参考。
为了实现本发明目的，本发明提供的一种提高牛体外胚胎制备效率的方法，包括牛卵母细胞的体外采集、卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟培养、牛卵母细胞的体外受精以及体外发育培养等步骤。
其中，体外发育培养所使用的培养液(ivc-2液)中含有0.01-70μm的c35h49f2n7o4·cf3co2h。优选地，所述ivc-2液中含有30μm、50μm或70μm的c35h49f2n7o4·cf3co2h，更优选50μm。
前述的方法，当ivc-2液中含0μm的mm102时，囊胚率为24.33％。
前述的方法，当ivc-2液中含30μm的mm102时，囊胚率为25.47％。
前述的方法，当ivc-2液中含50μm的mm102时，囊胚率为32.61％，高于其他体系。
前述的方法，当ivc-2液中含70μm的mm102时，囊胚率为29.65％。
前述的方法，当mm102浓度在0-50μm之间时，随着mm102浓度的增加，囊胚率逐渐上升，且囊胚形态正常。
前述的方法，当mm102浓度达到70μm时，囊胚率出现下降，但囊胚形态仍正常。
对上述发育条件下培养出的囊胚进行多能基因的免疫荧光染色发现无差别。
优选地，所述ivc-2液的配方为：
其中，所述sof液的配方为：
所述储液a的配方为：
所述储液b的配方为：
水10ml
nahco30.21g
所述储液c的配方为：
水10ml
丙酮酸钠0.08g
所述储液d的配方为：
水10ml
cacl2·2h2o0.262g
前述的方法，卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟培养所使用的培养液配方为：
前述的方法，体外受精依次在a液和b液中进行，其中，a液配方为：体外受精储液+10mm咖啡因，b液配方为：体外受精储液+20mg/ml牛血清白蛋白+1iu/ml肝素；
其中，所述体外受精储液的配方为：
前述的方法，优选采用注射器抽取法,收集胞质均匀且有多层完整颗粒细胞的卵丘-卵母细胞复合体，体外成熟培养22-24h。
前述的方法，在牛卵母细胞的体外受精中，采用种公牛冻精，将洗涤好的精液与体外成熟后的卵丘-卵母细胞复合体放入受精液中，受精后去除颗粒细胞，置于ivc-1液中培养48h，然后转移至ivc-2液中，体外发育7-9d，统计囊胚率。
其中，所述ivc-1液的配方为：
本发明中，体外培养条件为：38.5℃、5％c02、饱和湿度培养箱。
本发明还提供一种用于提高牛体外胚胎制备效率的体外发育培养液ivc-2，其中ivc-2液中含有0.01-70μm的c35h49f2n7o4·cf3co2h。优选地，所述ivc-2液中含有30μm、50μm或70μm的c35h49f2n7o4·cf3co2h，更优选50μm。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过在体外条件下，选取最优的牛体外受精体系，在牛体外受精发育48小时后，将卵裂球置于添加有不同浓度mm102的发育液中，结果显示，mm102对牛的受精卵体外发育有促进作用，可得到较高的囊胚率。该法可用于提高牛体外胚胎制备的效率。本发明可为家畜体外受精技术研究提供一定的理论依据，并可进一步应用于家畜繁殖和家畜遗传保种等领域中。
附图说明
图1为本发明实施例3中不同浓度mm102培养体系下第7天体外受精囊胚形态。
图2为本发明实施例3中ivc-2液中含有0μm的mm102时培养出的囊胚，进行多能基因的免疫荧光染色结果。
图3为本发明实施例3中ivc-2液中含有30μm的mm102时培养出的囊胚，进行多能基因的免疫荧光染色结果。
图4为本发明实施例3中ivc-2液中含有50μm的mm102时培养出的囊胚，进行多能基因的免疫荧光染色结果。
图5为本发明实施例3中ivc-2液中含有70μm的mm102时培养出的囊胚，进行多能基因的免疫荧光染色结果。
图1-图5中，图中标尺为100μm。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1牛卵母细胞的体外采集和体外成熟培养
从屠宰场收集现屠宰牛的卵巢，保存在盛有0.9％灭菌生理盐水的洁净保温桶内，于2-4h内运回实验室。卵巢送达实验室后，置于20-25℃的0.9％灭菌生理盐水中清洗至少3次，牛卵巢卵母细胞的采集采用注射器抽取法,用注射器对卵巢表面直径为2-7mm的卵泡进行抽取。将抽取的卵泡液在体视显微镜下收集胞质均匀且有多层完整颗粒细胞的卵丘-卵母细胞复合体(cocs)，用体外成熟培养液洗3次后，迅速将cocs收集于成熟液中进行体外成熟培养。所有cocs均在四孔板中进行体外成熟培养。培养体系为体外成熟培养液700μl/孔，液层表面铺加石蜡油300μl/孔；培养条件为50枚/孔，38.5℃、5％co2、饱和湿度培养箱。
其中，体外成熟培养液的配方为：
实施例2牛卵母细胞的体外受精
卵母细胞体外成熟培养22-24h后，进行卵母细胞体外受精。购买的种公牛精液，按卵数与精液管数100：1的比列解冻精子于含有8ml体外受精a液的15ml无菌离心管。37℃，4000转/分，离心5分钟。洗涤两次，吸去上清后，在精子沉淀的表层缓慢轻加1-2ml体外受精培养液，在37℃水浴锅中上浮3-5min，吸取上层浑浊部分于1.5ml的离心管内，加入等体积的体外受精b液，混合均匀后，加入受精滴，每滴受精滴精子浓度为1×106-5×106个/ml。将经过体外成熟培养后的cocs用体外受精a+b液(a、b液等体积比混合)洗涤3次后，将15-20枚移入受精滴中。将培养皿放入培养箱中进行体外受精培养。培养体系为体外受精培养液，每滴100μl，液层表面铺加石蜡油；培养条件38.5℃、5％co2、饱和湿度培养箱。
其中，体外受精a液配方为：体外受精储液+10mm咖啡因，体外受精b液配方为：体外受精储液+20mg/ml牛血清白蛋白+1iu/ml肝素。
所述体外受精储液的配方为：
实施例3牛受精卵的体外发育培养
精子与卵母细胞体外受精培养6h后，受精卵移入体外发育培养液中，用100μl移液器反复轻轻吹打，以脱掉颗粒细胞和除掉黏附在受精卵上的精子，用ivc-1液洗涤3遍。将受精卵分别移入体外发育ivc-1液滴，20枚/滴，将培养皿放入培养箱中进行发育培养48h。培养体系为体外发育培养液每滴50μl，液层表面铺加石蜡油，体外发育前放入co2培养箱中平衡5h以上；在体外培养至48h，统计卵裂数，将卵裂的胚胎用含有不同浓度mm102的ivc-2液洗3遍，放入相应的发育ivc-2液滴内继续培养。第7-9d天统计囊胚率(表1)。培养条件为38.5℃、5％co2、饱和湿度培养箱。
其中，所述ivc-1液的配方为：
所述ivc-2液的配方为：
其中，所述sof液的配方为：
所述储液a的配方为：
所述储液b的配方为：
水10ml
nahco30.21g
所述储液c的配方为：
水10ml
丙酮酸钠0.08g
所述储液d的配方为：
水10ml
cacl2·2h2o0.262g
前述的方法，卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟培养所使用的培养液配方为：
表1不同浓度mm102培养体系下囊胚发育率
不同浓度mm102培养体系下第7天体外受精囊胚形态见图1。当mm102浓度在0-50μm之间时，随着mm102浓度的增加，囊胚率逐渐上升，且囊胚形态正常。当mm102浓度达到70μm时，囊胚率出现下降，但囊胚形态仍正常。
ivc-2液中含有0μm、30μm、50μm、70μmmm102时培养出的囊胚，进行多能基因的免疫荧光染色，结果分别见图2-图5。从图2-图5可以看出，添加不同浓度的mm102对牛囊胚多能基因的表达没有显著的影响。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。