本发明属于免疫学技术领域，具体涉及破伤风亚毒素用来免疫马匹,产生马源破伤风抗体。
背景技术：
破伤风是一种严重的感染性疾病，病死率高达20％-40％。任何创伤都有发生破伤风的可能。破伤风抗体是短期预防和治疗破伤风的快速有效药物，目前市场上的破伤风治疗药物有破伤风马抗毒素(tat)和破伤风人免疫球蛋白(tig)。tig是由乙型肝炎疫苗免疫后再经破伤风类毒素免疫的献血员中采集破伤风抗体效价高的血浆，经提取的特异性免疫球蛋白制剂。tig使用时无需皮试，可直接注射，但由于其属于血液制品，存在感染丙肝、艾滋等传染病的潜在风险，而且受来源限制，产量较低，成本较高，市场上往往出现“一针难求”的现象。发展中国家和不发达国家很难自己制备和购买tig用于破伤风的预防和治疗。所以tat治疗破伤风感染在这两类国家中比较容易实现，且在将来的很长一段时间内仍会继续在临床应用。
tat是由破伤风类毒素免疫马所得的血浆，经胃酶消化后纯化制成的液体抗毒素免疫球蛋白制剂，含特异性抗体片段，具有中和破伤风毒素的作用。目前tat的制备中还存在一些问题：(1)在马匹破伤风加强免疫疫时,由于破伤风类毒素成分复杂，不易产生高特异性抗体；(2)类毒素还是存在一定的毒性，经常高剂量的注射破伤风类毒素抗原后采血，使马匹肝细胞逐渐发生变性坏死,一般情况下免疫采血马匹在第十程以后开始，肝脏肿大变性,变成“豆腐渣”样,最后肝脏边缘破裂，导致马匹死亡。因此，提高免疫抗原的质量，降低毒性，对于生产成本的降低以及tat的质量提高均具有重要意义。
破伤风类毒素(tt)是在有利于产毒的液体培养基中培养产毒的破伤风杆菌，用过滤的方法收获毒素，用甲醛脱毒制成的。虽然其免疫效果较好，但仍存在一些问题：(1)破伤风梭菌可形成芽孢形式，毒性高，生产时有一定危险性；(2)甲醛处理类毒素易造成污染残留，免疫马匹时易引起副反应；(3)化学处理后的类毒素还可能发生毒性逆转，对马匹产生毒性。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的长期大量使用破伤风类毒素为免疫原，在免疫马身上产生毒性副作用问题，本发明提供了一种马源破伤风抗体，其具有免疫性高、价格低、容易生产、无毒性等特点。
本发明的目的是提供一种马源破伤风抗体。
根据本发明具体实施方式的一种马源破伤风抗体，其采用以下步骤制备而成：
(1)使用破伤风亚毒素、破伤风类毒素或破伤风亚毒素与破伤风类毒素的混合物对马匹进行基础免疫；
(2)使用破伤风亚毒素、破伤风类毒素或破伤风亚毒素与破伤风类毒素的混合物对基础免疫后的马匹进行加强免疫；
(3)加强免疫结束后，使用破伤风亚毒素、破伤风类毒素或破伤风亚毒素与破伤风类毒素的混合物对马匹进行第二程免疫；
(4)第二程免疫后，使用破伤风亚毒素、破伤风类毒素或破伤风亚毒素与破伤风类毒素的混合物对马匹进行第三程免疫；
(5)第三程免疫结束后，提取马匹的血浆和血清。
破伤风毒素全长1315个氨基酸，分子量为150kda，共由a、b、c三部分组成，每部分分子量均为50kda。c片段是重链的c端，具有结合神经细胞的作用。b片段是重链的n端，具有导入作用。a片段是轻链，有蛋白酶活性，可抑制神经传递物质的释放，具有麻痹作用。破伤风毒素的a、b、c片段总称“破伤风亚毒素”。
本发明通过采用破伤风亚毒素作为免疫原，通过破伤风亚毒素单独使用或者与tt联合使用，证实了其有效之免疫原性，及替代tt做抗原之可行性。
本发明以实际例子说明以分子生物学方法,可将高毒性抗原分解成亚毒素片段,可减少对免疫动物身上产生毒性副作用问题。如可保持其免疫原性,可用於疫苗及抗毒素生产使用。亚毒素片段如可以大肠杆菌系统大量表达,生产过程简化,不需要复杂昂贵的防护设备,且其生产出抗保纯度高,毒性小,整体生产价格大幅降低。
根据本发明具体实施方式的一种马源破伤风抗体，步骤(1)中，进行基础免疫2次，两次免疫间间隔7天。
根据本发明具体实施方式的一种马源破伤风抗体，以氟氏不完全佐剂与破伤风亚毒素、破伤风类毒素或破伤风亚毒素与破伤风类毒素的混合物混匀制成0.6～0.7mg/ml乳液后，对马匹的颈部和背部进行肌肉注射。
根据本发明具体实施方式的一种马源破伤风抗体，步骤(1)中，使用破伤风类毒素对马匹进行基础免疫。
根据本发明具体实施方式的一种马源破伤风抗体，步骤(2)中，进行7次加强免疫，每次间隔7天。
根据本发明具体实施方式的一种马源破伤风抗体，步骤(2)中，对马匹进行肌肉注射的剂量分别为第一次2～3ml，第二次4～6ml，第三次6～9ml，第四次8～12ml，第五次8～12ml，第六次12～18ml，第七次16～24ml。
根据本发明具体实施方式的一种马源破伤风抗体，加强免疫结束后16天进行第二程免疫，第二程免疫共三次，每次间隔7天。
根据本发明具体实施方式的一种马源破伤风抗体，步骤(3)中，对马匹进行肌肉注射的剂量分别为第一次6ml，第二次12ml，第三次24ml。
根据本发明具体实施方式的一种马源破伤风抗体，第二程免疫结束后18天进行第三程免疫，第三程免疫包括3次，每次间隔7天。
根据本发明具体实施方式的一种马源破伤风抗体，步骤(4)中，对马匹进行肌肉注射的剂量分别为第一次6ml，第二次12ml，第三次24ml。
因破伤风类毒素及亚毒素免疫效果及剤量使用不同,本发明的免疫方式是以破伤风亚毒素及其混合物当做抗原而专门设计调配的。
本发明的有益效果为：
本发明采用破伤风亚毒素单独作为抗原或者与破伤风类毒素联合使用，对马匹进行免疫后，检测了其在马匹体内免疫原性，通过抗体滴度和血浆效价的比较，显示出其具有较好的免疫原性。
本发明通过破伤风亚毒素对马匹进行免疫，几乎无毒，不会造成马匹干燥病变死亡。现在实验马匹存活已超过平均破抗免疫马使用時间,马群仍健康,可以继续进行长期免疫实验。
破伤风毒素c片段生产简单,纯度高，几乎无毒,不需要复杂、昂贵的防护,整体生产价格是类毒素的50％以下。
为生产马源破伤风抗体,破伤风亚毒素与破伤风类毒素可以混合交替使用,用其生产之抗体与用破伤风类毒素免疫之马源破伤风抗体功效相当。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是非还原(a)和还原(b)马血浆的sds-page分析。泳道m：分子量标记；泳道1至6：来自1至6组的马的血浆；泳道7：来自常规tt免疫的马的血浆；
图2是不同免疫程序后的血清抗体滴度。a.血清中的抗ttigg滴度；b.血清中的抗tent-hcigg滴度；c.血清中的抗ttigm滴度；d.血清中抗tent-hcigm效价；
图3是不同免疫过程后的血浆抗体效价。a.来自1-6组的血浆中的抗ttigg滴度；b.血浆中的抗tent-hcigg滴度；c.三次免疫程序和tt常规免疫血浆后血浆中的抗ttigg滴度；d.在三次免疫过程和tt常规免疫血浆后血浆中的抗tent-hcigg滴度；
图4是通过琼脂扩散法测试血浆抗体滴度；
图5是通过絮状反应法测量血浆中的抗毒素滴度；
图6是来自实施例1-6组的血浆中相应抗体的中和破伤风毒素效力；a.在第一次免疫过程之后收集血浆；b.第二程后收集血浆；c.第三程后收集血浆。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实验材料
马匹：购自青海大通地区牧户，选用无破伤风自然抗体的健康公马，4～10岁，平均年龄6.5岁，体重250～400kg，平均体重328.3kg。
不完全弗氏佐剂：液体石蜡(购自上海中秦化学试剂有限公司)与羊毛脂(药用级，购自中国华亭羊毛脂厂)按照体积2:1的比例混合制备而成。
抗原与佐剂：
tent-hc抗原，分子量45kd，由北京生物工程研究所制备，与不完全弗氏佐剂1:1混合成蛋白含量0.625mg/ml的油包水乳状液；
破伤风类毒素(tt)抗原，购自成都欧林生物科技股份有限公司，与不完全弗氏佐剂混合成蛋白含量0.625mg/ml的油包水乳状液；
混合抗原，将tent-hc和破伤风类毒素按蛋白含量1:1混合后，与不完全弗氏佐剂1:1混合成蛋白含量0.625mg/ml的油包水乳状液。
二抗：hrp标记抗马igg、igm二抗购自abcam公司。
破伤风标准毒素、抗破伤风血清国家标准品均购自中国食品药品检定研究院。
icr小鼠：17-19g，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
硼酸盐缓冲液：nacl8.5g/l，h3bo34.5g/l，na2b4o7·10h2o0.5g/l,ph7.0-7.2。
实验方法
1.马匹分组、免疫程序、血清血浆分离
选用无自然抗体且年龄、体重、健康状况良好的马匹18匹，分为6组，每组3匹。
在免疫的不同阶段，采用不同剂量的tent-hc、tt或者两者混合抗原(mixag,mixedantigens)进行马匹的免疫，免疫方式为颈部和背部多点肌肉注射，共进行三程免疫，第一程包含基础免疫2次，间隔7天，基础免疫后56天进行7次加强免疫，每次间隔7天；最后一次加强免疫后16天进行第二程免疫，共3次，每次间隔7天；第二程最后一针免疫后18天进行第三程免疫，共3次，每次间隔7天。具体抗原种类及免疫剂量见表1。
在免疫的不同阶段分别进行血清和血浆的分离采集，马血清经颈静脉采血自然分离，马血浆采用单采浆机颈静脉采集。
表1马匹分组及抗原免疫方案
2.sds-page检测血浆抗体成分
将各组第三程免疫后采集的血浆混合，与常规tt免疫后采集的血浆，用生理盐水10倍稀释后取10μl加入2×loadingbuffer，上样后行12％sds-page蛋白电泳，比较不同免疫组的血浆组份差别。
如图1所示，从sds-page电泳分析结果看，非还原(a)及还原状(b)况下，不同免疫方式制备的马血浆(实施例1-6)中抗体的主要组份大小和比例与tt免疫马血浆(对比例7)无显著性差异。
3.抗体水平检测
在基础免疫、加强免疫、第二程最后一次免疫以及第三程最后一次免疫后一周，分别采集马血清和血浆，采用elisa法检测其抗tt和抗tent-hc抗体滴度，具体方法为：分别用2μg/ml的tt和tent-hc包被96孔酶联板(costar)，4℃包被过夜，采用pbst(pbs+0.1％tween-20)洗涤4次，每次5min，加入1:20000(foriggdetection)或1:500(forigmdetection)开始倍比稀释的马血清或血浆，37℃孵育1h，pbst洗涤4次，每次5min，加入1:100000稀释的hrp-antihorseigg或者1:20000稀释的hrp-antihorseigm，37℃孵育40min，pbst洗涤4次，加入tmb底物显色液(sigma)显色后采用2mh2so4终止显色，450nm波长检测读值。
如图2所示，基础免疫后一周，实施例五、六组血清中抗ttigg抗体滴度要明显高于其他组，具有显著性差异，但随着免疫次数的增加，在第一、二、三程免疫结束后一周的血清抗ttigg抗体滴度，除实施例四外，各组之间无显著性差异(p≥0.05)，抗体滴度最低的第四组与抗体滴度最高的第五组具有显著性差异(p﹤0.05)。同样，随着免疫进程，各实施例之间的抗tent-hcigg抗体滴度、抗tt和tent-hcigm抗体滴度均无显著性差异(p≥0.05)，均能够诱导以igg型抗体为主的较强体液免疫。
如图3所示，六组实施例中每程免疫后一周，马血浆中抗tt和抗tent-hcigg抗体的滴度。其中，抗ttigg抗体滴度总体来说实施例五较高，在第一程免疫结束后显著高于第一和第四组(p﹤0.05)，但在后两程免疫后，各组之间没有显著性差异(p≥0.05)。抗tent-hcigg抗体滴度总体来说实施例四稍低，在第一程和第三程免疫后均显著低于第五组(p﹤0.05)，其他各组之间未见显著性差异(p≥0.05)。将tent-hc参与免疫的六组马匹三程免疫后的血浆抗tt、抗tent-hc滴度与tt常规免疫后收集的血浆混合物进行了比较，结果显示，各组之间抗ttigg抗体水平无显著性差异(p≥0.05)，但是tt常规免疫组血浆中抗tent-hc抗体滴度显著低于tent-hc参与免疫的六组马匹血浆(p﹤0.01)。
4.琼脂扩散法检测血浆效价
称取2.25g琼脂糖，加入150ml纯化水，煮沸后倒入平皿，静待其冷却后打梅花孔。加样入孔，中间孔加入0.17mg/ml的tent-hc抗原100μl，周围以顺时针按稀释倍数依次加入5×、10×、20×、40×、80×、160×、320×、640×稀释后免疫马血清100μl。放入湿盒，37℃培养48小时，观察沉淀线。
从图4的实验记过来看，除第二程免疫后，实施例三、四之间存在显著性差异外(p﹤0.05)，第一程和第三程免疫后各组之间的抗体滴度无显著性差异(p≥0.05)。
5.絮状反应法检测血浆效价
参照中国药典2015年版三部3506的方法：精密量取不同体积的100lf/ml的抗毒素絮状反应标准品溶液，分别加入絮状反应管，取合适稀释倍数的待测马血浆1ml，快速准确加入上述各絮状反应管内，摇匀，置45-50℃水浴中，连续观察，记录最先出现絮状沉淀的反应管，精确重复2-3次，记录观察结果，马血浆效价絮状单位(lf/ml)＝v×n×100(v为最早出现絮状沉淀时使用的抗毒素絮状反应标准品溶液的体积，ml；n为待测马血浆的稀释倍数)。
在前期的预实验中确定了tent-hc类毒素在蛋白含量为0.17mg/ml的效价为100lf/ml，以它为抗原检测比较了三程免疫后不同组别抗毒素的效价，结果如图5所示，实施例三和实施例五的抗毒素絮状单位略高于其他组，实施例四最低，和实施例三相比具有显著性差异(p﹤0.05)，其他各组之间无显著性差异。
6.小鼠体内中和试验法检测血浆效价
参照中国药典2015年版三部3508的方法：将破伤风抗毒素标准品与硼酸盐缓冲液稀释的不同浓度待测马血浆0.2ml，与0.2ml破伤风毒素标准品混合，37℃反应1h后，注射于小鼠腹腔，每组3只小鼠，观察小鼠发病及死亡情况。待测马血清的效价为与对照小鼠同时死亡或出现破伤风神经毒症状最重者的最高稀释度。
结果如图6所示。在第一程免疫结束后一周，除实施例一、实施例四的血浆抗毒素平均效价低于1000iu/ml外，其余各组平均效价均高于1000iu/ml；在第二、三程免疫结束后一周，除实施例四外，其余各组抗毒素平均效价均高于1000iu。根据统计学分析结果，各组抗毒素效价之间无显著性差异(p≥0.05)。
破伤风类毒素tt作为免疫原在tat的制备中具有重要的作用，由于tt本身的特性：生产时使用产毒株放大规模受限，采用甲醛灭活易造成环境污染，大量多次免疫马匹易对马匹产生肝脏毒性，造成产品质量下降和生产成本的增加。
本发明采用破伤风类毒素单独作为抗原或者与tt联合使用，对马匹进行免疫后，检测了其在马匹体内免疫原性，通过抗体滴度和血浆效价的比较，显示其与常规tt免疫后的血浆具有可比性，除第4组外，其余各组的平均效价均达到了1000iu/ml以上。再加长免疫次数及调整用量，可以满足破伤风抗毒素生产效价需求。
从实验结果看，实施例1～6各组之间无显著性差异，实施例5先采用tt进行两针基础免疫，后续采用tent-hc免疫，抗体滴度和效价均稍高。此外，针对免疫程序和免疫剂量进一步优化后，tent-hc显示其更好的免疫原性。随着免疫的进程，tt由于其生产工艺和自身特性所带来的弱毒性，会造成马匹肝脏病变死亡，而tent-hc是完全无毒的重组产品，其优势随着长期免疫观察会越来越多的显示出来。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。