本发明属生命科学和生物
技术领域：
，特别涉及检测terc基因全外显子序列突变的引物、方法和试剂盒。
背景技术：
：先天性角化不良症(dskeratosiseongenita，dc)是一种具有遗传异质性的骨髓衰竭综合征，发病率约为1/100万。典型的dc患者约80％～90％具有皮肤黏膜异常三联征，表现为皮肤网状色素沉着、指(趾)甲萎缩、口腔黏膜白斑。目前文献报道可引起dc的突变基因主要有ctc1，dkc1，terc，tert，tinf2，nhp2，nop10及wrap53。文献报道，这些基因有3种遗传方式，分别为x-连锁隐性遗传、常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传。但目前仍约50％患者遗传特征不明确。x-连锁隐性遗传包括dkc1，常染色体显性遗传包括terc及tinf2，常染色体隐性遗传包括ctc1，wrap53，nhp2，nop10，既可以作为常染色体显性遗传又可以作为隐性遗传的有tert。端粒酶是一种特殊的核蛋白反转录酶复合体，负责端粒dna重复序列的再合成，确保端粒的正常修复和端粒长度的维持，由端粒酶rna元件(terc)、端粒酶反转录酶(tert)及端粒酶相关蛋白等组成。通过基因组测序，发现terc基因突变在先天性角化不良症患者中非常常见，vulliamy等发现先天性角化不良症患者的端粒长度均短于正常人，且患者的年龄越小越明显,并发现terc基因存在两个突变位点:一个单碱基突变位点c408g(在第408位碱基上由c变为g)与双碱基突变位点gc107-108ag(在第107、108位碱基上由gc突变为ag)。目前国内文献报道的dc病例绝大多数为30岁左右皮肤受累的临床病例，病例数较少，且较少进行基因检测。因此有必要进行相关基因的突变检测，有必要先对患者进行terc全外显子突变进行筛选，有助于对先天性角化不良症的早期诊断，减少误诊、漏诊，并进行治疗。本发明采用touch-downpcr扩增和sanger测序法检测terc基因全外显子序列突变，并且设计的引物可以扩展整个外显子，包括待检测的所有突变位点。touch-downpcr扩增可确保正、反向扩增引物与样本dna模板的结合发生在最互补的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而sanger测序法是检测基因突变的金标准，检测结果准确性高，并且很大程度上地节省了检测成本。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供检测terc基因全外显子序列突变的引物，其特征在于，包括：扩增terc基因全外显子序列的正、反向引物；其碱基序列为：terc-f：tgtaaaacgacggccagtcctcatggccggaaatggaactterc-r：aacagctatgaccatgaggggtgacggatgcgcacgat。进一步地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为：m13-f：tgtaaaacgacggccagtm13-r：aacagctatgaccatg。本发明的第二个目的在于提供检测terc基因全外显子序列突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(1)样本dna抽提试剂；(2)检测体系pcr反应试剂，包括扩增terc基因全外显子序列突变的正、反向引物；其碱基序列为：terc-f：tgtaaaacgacggccagtcctcatggccggaaatggaact；terc-r：aacagctatgaccatgaggggtgacggatgcgcacgat；(3)测序体系反应试剂，包括测序引物，其碱基序列为：m13-f：tgtaaaacgacggccagt；m13-r：aacagctatgaccatg；(4)阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。进一步地，扩增terc基因全外显子序列突变的正、反向引物的浓度比为：terc-f:terc-r＝1:1。进一步地，所述测序引物的浓度比为：m13-f:m13-r＝1:1。所述试剂盒还包括terc基因野生型参考序列terc-ref。测序体系反应试剂包括由虾碱性磷酸酶和核酸外切酶i组成的测序纯化液。本发明的最后一个目的是提供检测terc基因全外显子序列突变的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取样本dna；(2)利用扩增引物terc-f和terc-r对(1)中的dna进行扩增，获得扩增产物；(3)利用测序引物m13-f和m13-r对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的基因序列；(4)将(3)中的基因序列与terc基因野生型参考序列terc-ref进行比较，确定突变位点是否存在；其中,扩增terc基因全外显子序列突变的正、反向引物d的碱基序列为：terc-f：tgtaaaacgacggccagtcctcatggccggaaatggaact；terc-r：aacagctatgaccatgaggggtgacggatgcgcacgat；测序引物的碱基序列为：m13-f：tgtaaaacgacggccagt；m13-r：aacagctatgaccatg。进一步地，步骤(2)中的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。本发明的有益效果：本发明设计了扩增terc基因全外显子序列突变的正，反向引物，构建了稳定的touch-downpcr扩增体系，对整个全外显子进行扩增，包含待检测的所有突变位点，同时在扩增时，富集正、反向引物与模板正确配对的特异性扩增产物，提高扩增特异性。此外，通过调整正、反向扩增引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，并采用sanger测序法，对pcr扩增产物进行测序反应扩增、纯化后变性、直接测序检测terc基因全外显子序列的突变情况，具有灵敏度高、操作简单和成本低等优点。附图说明图1terc基因pcr扩增电泳结果图，其中m为takaradl2000。图2样本1terc基因c408g检测结果图。图3样本2terc基因c408g检测结果图。图4样本3terc基因c408g检测结果图。图5样本1terc基因gc107-108ag检测结果图。图6样本2terc基因gc107-108ag检测结果图。图7样本3terc基因gc107-108ag检测结果图。具体实施方式下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例1检测terc基因全外显子序列突变的引物，包括：扩增terc基因全外显子序列突变的正、反向引物；其碱基序列为：terc-f：tgtaaaacgacggccagtcctcatggccggaaatggaactterc-r：aacagctatgaccatgaggggtgacggatgcgcacgat。优选地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为m13-f：tgtaaaacgacggccagtm13-r：aacagctatgaccatg。在检测中，先利用上述正、反向引物对terc基因全外显子序列突变进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述一对测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。检测terc基因全外显子序列突变的试剂盒，包括：样本dna抽提试剂(例如使用天根生物的试剂盒来抽提样本dna)；无水乙醇；检测体系pcr反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系pcr反应液包括：2×pcrbuffer；2mmdntps；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；扩增terc基因全外显子序列的正、反向引物terc-f(10μm)、terc-r(10μm)。测序体系反应液包括：测序纯化液、edta(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)、测序引物：terc-f(3.2μm)、terc-r(3.2μm)，以及bigdyeterminatorv3.1(购买自美国appliedbiosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(sap)0.6u和核酸外切酶i(exoni)1.2u。检测体系pcr反应液试剂配制如下：其中，terc-f和terc-r的碱基序列为：引物名称碱基序列terc-ftgtaaaacgacggccagtcctcatggccggaaatggaactterc-raacagctatgaccatgaggggtgacggatgcgcacgat阳性对照品：含有terc序列的溶液。阴性对照品：无terc序列的溶液。空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。优选地，该试剂盒还包括terc基因野生型参考序列terc-ref，其碱基序列如下所示：cctcatggccggaaatggaactttaatttcccgttccccccaaccagcccgcccgagagagtgactctcacgagagccgcgagagtcagcttggccaatccgtgcggtcggcggccgctccctttataagccgactcgcccggcagcgcaccgggttgcggagggtgggcctgggaggggtggtggccattttttgtctaaccctaactgagaagggcgtaggcgccgtgcttttgctccccgcgcgctgtttttctcgctgactttcagcgggcggaaaagcctcggcctgccgccttccaccgttcattctagagcaaacaaaaaatgtcagctgctggcccgttcgcccctcccggggacctgcggcgggtcgcctgcccagcccccgaaccccgcctggaggccgcggtcggcccggggcttctccggaggcacccactgccaccgcgaagagttgggctctgtcagccgcgggtctctcgggggcgagggcgaggttcaggcctttcaggccgcaggaagaggaacggagcgagtccccgcgcgcggcgcgattccctgagctgtgggacgtgcacccaggactcggctcacacatgcagttcgctttcctgttggtggggggaacgccgatcgtgcgcatccgtcacccct。实施例2检测流程：(1)利用血液dna抽提试剂盒(天根生物)提取血液样本中的基因组dna:1)抽取500ul血液加入1000ul红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200ul缓冲液ga，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中，获得血液基因组dna溶液。(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份18μl分装：x＝18μl反应液×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)n为检测样本数。(3)加样：将2ul步骤(1)中获得的血液基因组dna溶液加入到检测体系pcr反应液中；对阳性对照实验而言，直接加2ul阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加2ul阴性对照品；对空白对照实验而言，加2ul生理盐水或不加任何物质。(4)touch-downpcr扩增：检测在常规pcr仪上进行，获得pcr扩增产物，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下：(5)sanger测序：取9μlpcr扩增产物与2μl测序纯化液。按照以下程序进行纯化，从而获得纯化产物：将1μl纯化产物分别与测序引物terc-f(3.2μm)和terc-r(3.2μm)按照如下体系进行混合：测序反应程序：沉淀环节：向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlhidi后进行变性试验。变性程序：变性程序结束后，上测序仪(abi3730)测序，获得pcr扩增产物的基因序列。(6)结果判断：将(5)中获得的基因序列与terc基因野生型参考序列terc-ref进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。实施例3采用本发明核酸检测试剂盒检测临床样本。取送检先天性角化不良患者抗凝血样本20例，按实施例2所述检测流程提取样本中的基因组dna，配制试剂并检测。将2ul按照实施例2中所述检测流程提取出的每份样本基因组dna溶液加入检测体系pcr反应液中。同时做阳性、阴性和空白对照。用普通pcr仪检测，时间为160分钟。电泳结果如图1所示，表明本发明所述引物terc-f、terc-r对血液样本能有效扩增，且条带单一。样品1的terc基因c408g正向测序结果如图2所示，为野生型，未检测出c408g突变。样品2的terc基因c408g正向测序结果如图3所示，为野生型，未检测出c408g突变。样品3的terc基因c408g正向测序结果如图4所示，为野生型，未检测出c408g突变。样品1的terc基因gc107-108ag正向测序结果如图5所示，为野生型，未检测出gc107-108ag突变。样品2的terc基因gc107-108ag正向测序结果如图6所示，为野生型，未检测出gc107-108ag突变。样品3的terc基因gc107-108ag正向测序结果如图7所示，为野生型，未检测出gc107-108ag突变。检测结果如下表：从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把terc基因全外显子序列包括在内了，并且测序结果完全准确。对阳性标本的检测表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出terc基因突变。序列表<110>杭州艾迪康医学检验中心有限公司<120>检测terc基因全外显子序列突变的引物、试剂盒和方法<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>40<212>dna<213>人工序列()<400>1tgtaaaacgacggccagtcctcatggccggaaatggaact40<210>2<211>38<212>dna<213>人工序列()<400>2aacagctatgaccatgaggggtgacggatgcgcacgat38<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列()<400>3tgtaaaacgacggccagt18<210>4<211>16<212>dna<213>人工序列()<400>4aacagctatgaccatg16<210>5<211>657<212>dna<213>terc-ref<400>5cctcatggccggaaatggaactttaatttcccgttccccccaaccagcccgcccgagaga60gtgactctcacgagagccgcgagagtcagcttggccaatccgtgcggtcggcggccgctc120cctttataagccgactcgcccggcagcgcaccgggttgcggagggtgggcctgggagggg180tggtggccattttttgtctaaccctaactgagaagggcgtaggcgccgtgcttttgctcc240ccgcgcgctgtttttctcgctgactttcagcgggcggaaaagcctcggcctgccgccttc300caccgttcattctagagcaaacaaaaaatgtcagctgctggcccgttcgcccctcccggg360gacctgcggcgggtcgcctgcccagcccccgaaccccgcctggaggccgcggtcggcccg420gggcttctccggaggcacccactgccaccgcgaagagttgggctctgtcagccgcgggtc480tctcgggggcgagggcgaggttcaggcctttcaggccgcaggaagaggaacggagcgagt540ccccgcgcgcggcgcgattccctgagctgtgggacgtgcacccaggactcggctcacaca600tgcagttcgctttcctgttggtggggggaacgccgatcgtgcgcatccgtcacccct657当前第1页12