本发明属于家禽育种技术领域，具体地说，涉及一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法。
背景技术：
家禽卵泡膜细胞是卵泡的重要组成部分，围绕在颗粒层外周的一层扁平细胞，其在卵泡发育过程中起着至关重要的作用。目前卵泡相关研究中，人们更多的关注是颗粒细胞而忽略了卵泡膜细胞。卵泡膜细胞体外培养技术是研究卵泡膜在卵泡发育中作用机制的关键。
现研究报道中，鲜有关于水禽小卵泡的卵泡膜细胞体外培养报道，这样，无法全面了解蛋鸭小卵泡卵泡膜细胞在卵泡发育中的生理过程。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法，该方法细胞纯度高，活力好，分离密度高。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1、选取一只产蛋期蛋鸭，解剖剪取卵巢组织，分离出3-6mm小卵泡，将小卵泡置于盛有灭菌pbs的培养皿中；
步骤2、用眼科镊剥离小卵泡外的结缔组织层，固定住卵泡后用眼科剪将小卵泡剪破，将卵泡膜翻转，卵泡膜内层朝上，用眼科镊刮除卵黄和颗粒细胞层；
步骤3、在卵泡膜层中加入ⅱ型胶原蛋白酶消化液，置于干净的培养皿中，并放置在培养箱中进行消化处理；
步骤4、用镊子再次刮除步骤3中的组织内外两面细胞，吹打、冲洗组织层；
步骤5、将步骤4中冲洗干净的组织层置于新配置的ⅱ型胶原蛋白酶消化液中，进行消化处理；
步骤6、将步骤5制备得到的组织剪成碎片，加入新配置的ⅱ型胶原蛋白酶消化液进行消化处理；
步骤7、将混悬液用细胞网筛过滤，收集滤液，加入胎牛血清终止消化，离心收集细胞沉淀，制备得到蛋鸭小卵泡膜细胞。
可选地，所述步骤3中ⅱ型胶原蛋白酶消化液与卵泡膜层的体积质量比(ml/g)为0.2％；消化时间为25-35min，消化温度为37℃。
可选地，所述步骤5中新配置的ⅱ型胶原蛋白酶消化液与步骤4中冲洗干净的组织层的体积质量比(ml/g)为0.2％；消化时间为15-25min，消化温度为37℃，每隔5min吹打组织。
可选地，所述步骤6中新配置的ⅱ型胶原蛋白酶消化液与步骤5制备得到的组织的体积质量比(ml/g)为0.2％；消化时间为35-45min，消化温度为37℃，每隔15min吹打组织。
可选地，所述步骤7中胎牛血清的体积浓度为10％，细胞筛网的目数为250目，离心转速为400g，离心时间10min。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明首次分离提取蛋鸭小卵泡膜细胞。
2)本发明通过多次消化、吹洗步骤减少了卵黄和颗粒细胞的污染，得到纯度高的膜细胞。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例2中蛋鸭小卵泡分离提取的膜细胞铺板培养24h，40倍放大的结果；
图2是本发明实施例2中蛋鸭小卵泡分离提取的膜细胞铺板培养48h，40倍放大的结果；
图3是本发明实施例2中蛋鸭小卵泡分离提取的膜细胞铺板培养4天，40倍放大的结果；
图4是本发明实施例2中膜细胞pcr验证结果；其中，m代表3β-hsd基因目的条带，1代表dl2000dnamaker条带；
图5是本发明对比例1中蛋鸭小卵泡分离提取的膜细胞铺板培养24h，40倍放大的结果；
图6是本发明对比例1中蛋鸭小卵泡分离提取的膜细胞铺板培养48h，40倍放大的结果；
图7是本发明对比例1中蛋鸭小卵泡分离提取的膜细胞铺板培养4天，40倍放大。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1、选取一只产蛋期蛋鸭，解剖剪取卵巢组织，分离出3-6mm小卵泡，将小卵泡置于盛有灭菌pbs(0.01m)的培养皿中；
步骤2、用眼科镊剥离小卵泡外的结缔组织层，固定住卵泡后用眼科剪将小卵泡剪破，将卵泡膜翻转，卵泡膜内层朝上，用眼科镊刮除卵黄和颗粒细胞层；
步骤3、在卵泡膜层中加入0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶(sigma)消化液(市售)，置于干净的培养皿中，于37℃培养箱内消化25-35min；
步骤4、用镊子再次刮除步骤3中的组织内外两面细胞，吹打、冲洗组织层；
步骤5、将步骤4中冲洗干净的组织层置于新配置的0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶消化液(市售)中，于37℃培养箱内消化15-25min，每隔5min吹打组织；
步骤6、将步骤5中制备得到的组织剪成碎片，于37℃培养箱内用新配置的0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶消化液(市售)消化35-45min，每隔15min吹打组织；
其中，ⅱ型胶原蛋白酶能很好的消化上皮组织，尤其是卵泡膜层；
消化步骤和时长减少则消化不完全，无法得到大量单个颗粒细胞；若消化时间过长将损伤细胞膜，影响细胞活力。
步骤7、将混悬液用250目细胞网筛过滤，收集滤液，加入10％(v/v)胎牛血清终止消化，400g，10min离心收集细胞沉淀；制备得到蛋鸭小卵泡膜细胞。
实施例1
一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1、选取一只产蛋期蛋鸭，解剖剪取卵巢组织，分离出3-6mm小卵泡，将小卵泡置于盛有灭菌pbs的培养皿中；
步骤2、用眼科镊剥离小卵泡外的结缔组织层，固定住卵泡后用眼科剪将小卵泡剪破，将卵泡膜翻转，卵泡膜内层朝上，用眼科镊刮除卵黄和颗粒细胞层；
步骤3、在卵泡膜层中加入0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶消化液，置于干净的培养皿中，于37℃培养箱内消化25min；
步骤4、用镊子再次刮除步骤3中的组织内外两面细胞，吹打、冲洗组织层；
步骤5、将步骤4中冲洗干净的组织层置于新配置的0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶消化液中，于37℃培养箱内消化15min，每隔5min吹打组织；
步骤6、将步骤5中制备得到的组织剪成碎片，于37℃培养箱内用新配置的0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶消化液(市售)消化35min，每隔15min吹打组织；
步骤7、将混悬液用250目细胞网筛过滤，收集滤液，加入10％(v/v)胎牛血清终止消化，400g，10min离心收集细胞沉淀。
本实施例1得到比较纯的单一膜细胞，卵黄和红细胞干扰很小，有利于卵泡膜后续培养研究，便于研究家禽膜细胞在卵泡发育中的机制。
实施例2
一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1、选取一只产蛋期蛋鸭，解剖剪取卵巢组织，分离出3-6mm小卵泡，将小卵泡置于盛有灭菌pbs的培养皿中；
步骤2、用眼科镊剥离小卵泡外的结缔组织层，固定住卵泡后用眼科剪将小卵泡剪破，将卵泡膜翻转，卵泡膜内层朝上，用眼科镊刮除卵黄和颗粒细胞层；
步骤3、在卵泡膜层中加入0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶消化液，置于干净的培养皿中，于37℃培养箱内消化30min；
步骤4、用镊子再次刮除步骤3中的组织内外两面细胞，吹打、冲洗组织层；
步骤5、将步骤4中冲洗干净的组织层置于新配置的0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶消化液中，于37℃培养箱内消化20min，每隔5min吹打组织；
步骤6、将步骤5中制备得到的组织剪成碎片，于37℃培养箱内用新配置的0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶消化液(市售)消化40min，每隔15min吹打组织；
步骤7、将混悬液用250目细胞网筛过滤，收集滤液，加入10％(v/v)胎牛血清终止消化，400g，10min离心收集细胞沉淀。
本实施例2成功建立了蛋鸭小卵泡的膜细胞分离提取的方法，培养24h后膜细胞已经贴壁，见图1。培养48h后膜细胞贴壁率超过50％，见图2。培养4天后膜细胞完全铺满培养皿，见图3。得到比较纯的单一膜细胞，卵黄和红细胞干扰很小，有利于卵泡膜后续培养研究，便于研究家禽膜细胞在卵泡发育中的机制。收集细胞，用pcr法检验3β-hsd基因表达，结果显示样品为阳性，实施例2的细胞为膜细胞，见图4。
实施例3
一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1、选取一只产蛋期蛋鸭，解剖剪取卵巢组织，分离出3-6mm小卵泡，将小卵泡置于盛有灭菌pbs的培养皿中；
步骤2、用眼科镊剥离小卵泡外的结缔组织层，固定住卵泡后用眼科剪将小卵泡剪破，将卵泡膜翻转，卵泡膜内层朝上，用眼科镊刮除卵黄和颗粒细胞层；
步骤3、在卵泡膜层中加入0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶消化液，置于干净的培养皿中，于37℃培养箱内消化35min；
步骤4、用镊子再次刮除步骤3中的组织内外两面细胞，吹打、冲洗组织层；
步骤5、将步骤4中冲洗干净的组织层置于新配置的0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶消化液中，于37℃培养箱内消化25min，每隔5min吹打组织；
步骤6、将步骤5中制备得到的组织剪成碎片，于37℃培养箱内用新配置的0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶消化液(市售)消化45min，每隔15min吹打组织；
步骤7、将混悬液用250目细胞网筛过滤，收集滤液，加入10％(v/v)胎牛血清终止消化，400g，10min离心收集细胞沉淀；
本实施例3得到比较纯的单一膜细胞，卵黄和红细胞干扰很小，有利于卵泡膜后续培养研究，便于研究家禽膜细胞在卵泡发育中的机制。
对比例1
步骤1、选取一只产蛋期蛋鸭，解剖剪取卵巢组织，分离出3-6mm小卵泡，将小卵泡置于盛有灭菌pbs的培养皿中；
步骤2、用眼科镊剥离小卵泡外的结缔组织层，固定住卵泡后用眼科剪将小卵泡剪破，将卵泡膜翻转，卵泡膜内层朝上，用眼科镊刮除卵黄和颗粒细胞层；
步骤3、加入300iu/ml透明质酸酶，吹打组织，37℃消化20min，吹洗组织；
步骤4、将组织剪成碎片，加入混合消化液(0.1％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶，0.1％(g/v)蛋白酶，0.1％(g/v)透明质酸酶)，置于37℃培养箱，消化40min；
步骤5、将步骤4中混悬液吹打后，加10％胎牛血清终止消化，用100目细胞筛网过滤；冲洗干净的组织层置于新配置的0.2％(g/v)ⅱ型胶原蛋白酶消化液中，于37℃培养箱内消化25min，每隔5min吹打组织；
步骤6、滤液经400g，10min离心收集细胞沉淀；
本对比例1与实施例2相比较，24h，48h和4天细胞贴壁状况如图5-7所示，组织未充分消化成单个细胞，获得细胞量偏低，相同铺板细胞密度下，细胞贴壁率较低。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。