本发明涉及一种重组蛋白，具体涉及一种重组霍乱毒素b亚基蛋白、pedv灭活疫苗及制备与应用。
背景技术：
猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)是猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)的主要病原，主要造成猪肠道接触性传染病，其特征为呕吐、腹泻和脱水等。pedv属于尼多病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一种单股正链具有感染性的rna病毒，只有一个血清型。1971年首次在英国育肥猪猪场发现，对4～5周龄断奶前仔猪影响较大。随后，欧洲及亚洲多国也开始流行。2013年北美开始爆发，pedv成为全球流行的病毒并且严重损害了全球养殖业。
对于pedv的防控，除了做好生物防控外，目前疫苗的接种是防控pedv感染的主要手段。目前商品化的疫苗主要是以全病毒灭活苗和弱毒疫苗为主，但对目前流行毒株的保护效果不是很理想，究其原因可能如下：灭活疫苗肌注后不能够产生有效的黏膜免疫，弱毒疫苗致弱后在肠道稳定性和增殖能力降低，产生的保护力有限。对于pedv疫苗效力的研究发现，控制pedv最佳的手段是在仔猪胃肠道内产生大量的黏膜分泌性免疫球蛋白a(secretoryimmunoglobulina，siga)抗体，但目前的灭活疫苗均采用注射的方式，无法有效地激活黏膜免疫去提升siga水平。此外，有些养殖场还通过反饲的手段进行防控，虽然在一定的程度上具有保护效果，但也同时存在其他病毒感染的风险，因此不建议过多采用该方法。对于新生仔猪来说，出生后并还不具备成熟的胃肠道免疫系统，因此目前较好地免疫方式是通过免疫分娩前的母猪，通过母猪体内的免疫转化，使仔猪从初乳中获得保护力。虽然目前对pedv疫苗的研发依然是研究热点，但新型疫苗一直受到成本和批量生产的制约，所以提高传统疫苗的黏膜免疫效果是目前开发pedv疫苗的关键。
霍乱弧菌的霍乱毒素(choleraeenterotoxin，ct)是目前是研究较为热门的黏膜佐剂，同时也是良好的免疫刺激剂，其中ct的b亚单位(ctb)可识别肠黏膜上皮细胞膜的受体神经节苷脂gm1，并与之结合形成复合物，并且本身不具有毒性。因此利用ctb的特性，已有许多研究发现其与病毒关键的结构蛋白融合表达使用，或与关键蛋白在表达后混合使用，二者均有明显的增强免疫效果，目前，ctb已经被广泛地应用于黏膜疫苗的研究，通过滴鼻、皮下以及肌肉注射方式，均可以增强抗原特异性的黏膜免疫反应。
大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统，具有产量高、生长速度快、操作简单、成本低的优点，但大肠杆菌的表达的蛋白中的杂蛋白较多，仍需进一步纯化来获得目的蛋白，纯化流程较复杂。目前蛋白质的纯化主要依据相关蛋白质的理化及生物学性质不同将其与杂蛋白区分开来，无论是产生在上清的可溶性蛋白还是处于沉淀的包涵体蛋白，均能通过有效的手段将所需的目的蛋白纯化出来。纯化后的ctb蛋白利用壳聚糖/tpp离子交联法制备处理，处理后的ctb蛋白与各种佐剂配合使用从而有效提升pedv传统疫苗的免疫效果。
技术实现要素：
为了克服现有技术pedv传统灭活疫苗黏膜免疫效果差，免疫途径单一等缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种重组霍乱毒素b亚基蛋白的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述方法制备得到的重组霍乱毒素b亚基蛋白，该蛋白可有效提升灭活pedv的免疫效果和改良免疫途径。
本发明的再一目的在于提供上述重组霍乱毒素b亚基蛋白的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种pedv灭活疫苗。
本发明的第五个目的在于提供上述pedv灭活疫苗的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种重组霍乱毒素b亚基蛋白的制备方法，包含如下步骤：
(1)表达：将表达重组霍乱毒素b亚基蛋白的菌株诱导表达，然后将菌体破碎，分离，收集破碎后的菌体；
(2)变性：步骤(1)收集的破碎后的菌体洗涤后加入变性液，超声至澄清，然后30～40℃变性处理1.5～2.5h；离心，收集上清，过滤除杂，得到清液；
(3)纯化：将步骤(2)制得的清液采用镍柱纯化，得到重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白；
(4)复性：将步骤(3)中制得的重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白依次在8m、6m、4m、2m和0m尿素溶液中透析，得到复性后的重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白；
(5)交联：冰浴条件下，将壳聚糖/醋酸溶液与步骤(4)制得的复性后的重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白混合均匀，调整体系ph值为5.3～5.8；然后20～40℃搅拌处理5～15min，随后边搅拌边缓慢滴加三聚磷酸钠(tpp)溶液，其中，交联剂三聚磷酸钠和壳聚糖的质量比1:5；滴加完成后继续搅拌进行交联反应；离心，弃上清，收集沉淀并重溶，得到重组霍乱毒素b亚基蛋白；
步骤(1)中所述的重组霍乱毒素b亚基蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示；
步骤(1)中所述的重组霍乱毒素b亚基蛋白优选是将霍乱弧菌的霍乱毒素b亚基蛋白基因进行原核表达得到的重组蛋白；
所述的霍乱毒素b亚基蛋白基因的核苷酸序列如seqidno:2所示，是在该基因两端分别添加5’-bamhi和3’-xhoi酶切位点得到；
所述的原核表达的载体优选为pet-32a载体；
步骤(1)中所述的表达重组霍乱毒素b亚基蛋白的菌株优选为大肠杆菌；
步骤(1)中所述的诱导表达的条件优选为：终浓度为1mmol/l的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)30℃诱导表达6h；
步骤(2)中所述的洗涤的具体操作优选为：
在破碎后的菌体中加入pbs重悬，然后离心，弃上清；重复上述操作2～4次；所述的离心的条件优选为12000rpm离心10min；
步骤(2)中所述的变性液包含如下终浓度的组分：8mol/l尿素，0.1mol/lnah2po4，0.01mol/ltris，ph＝8.0；
步骤(2)中所述的超声的条件优选为功率200w，工作时间/间歇时间5sec/5sec；
步骤(2)中所述的变性处理的条件优选为37℃变性处理2h；
步骤(2)中所述的离心的条件优选为12000rpm离心10min；
步骤(2)中所述的过滤除杂优选为采用0.45μm滤膜过滤杂质；
步骤(3)中所述的镍柱纯化的具体操作优选为：
清液上镍柱，使用20mmol/l咪唑洗脱液冲洗杂蛋白后，再使用500mmol/l咪唑洗脱液冲洗目的蛋白；
步骤(4)中所述的透析的条件为4℃透析10～12h；
步骤(4)中所述的透析的过程中使用的透析袋优选进行如下活化处理：透析袋加入1mmedta2na和2wt％nahco3中，放入微波炉中火煮沸15min，取出后冷却，用ddh2o清洗三次，待冷却后加入1mmedta2na重复煮沸，冷却；
步骤(5)中所述的壳聚糖/醋酸溶液中壳聚糖的浓度优选为1mg/ml，醋酸的体积分数优选为1％，ph＝5；
步骤(5)中所述的壳聚糖/醋酸溶液的配制方法优选为：
将0.1g壳聚糖溶于100ml体积分数为1％的醋酸溶液中，调节ph值为5，过滤除去不溶杂质，得到1mg/ml的壳聚糖醋酸溶液；
步骤(5)中所述的壳聚糖/醋酸溶液、复性后的重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白和三聚磷酸钠溶液的体积比优选为5:5:4，其中，复性后的重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白的初始浓度优选为0.5mg/ml，三聚磷酸钠的初始浓度优选为0.25mg/ml；
步骤(5)中所述的混合均匀优选为冰浴振荡混合30min；
步骤(5)中所述的体系ph值优选为5.5；
步骤(5)中所述的搅拌处理的条件优选为25℃1200rpm搅拌10min；
步骤(5)中所述的继续搅拌的时间优选为30min；
步骤(5)中所述的离心的条件优选为15000～20000rpm离心30min；
步骤(5)中所述的重溶的具体操作优选为：
用ddh2o将沉淀重悬，然后采用超声使沉淀溶解；
所述的超声的条件优选为50w，工作时间/间歇时间5sec/5sec；
一种重组霍乱毒素b亚基蛋白，通过上述制备方法制备得到；
所述的重组霍乱毒素b亚基蛋白在佐剂和疫苗制备领域中的应用；
一种疫苗佐剂，包含上述重组霍乱毒素b亚基蛋白和壳聚糖；
一种pedv灭活疫苗，包含上述重组霍乱毒素b亚基蛋白；
所述的pedv灭活疫苗的制备方法，包含如下步骤：
(1)将pedv病毒液灭活，得到pedv灭活病毒液；
(2)将上述重组霍乱毒素b亚基蛋白加入到壳聚糖溶液中，混匀，得到佐剂；然后与pedv灭活病毒液混匀，得到pedv灭活疫苗；
步骤(1)中所述的pedv病毒液的滴度优选为10-4tcid50；
步骤(1)中所述的灭活的具体操作优选为：无菌条件下，在pedv病毒液中加入甲醛溶液并混匀，37℃灭活48h；灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和甲醛；
所述的甲醛溶液的初始质量分数优选为40％；
所述的甲醛溶液加入pedv病毒液中后终质量分数优选为0.3％；
所述的硫代硫酸钠溶液的用量优选为pedv病毒液和甲醛溶液混合后的体积；
步骤(2)中所述的重组霍乱毒素b亚基蛋白的浓度优选为0.5mg/ml；
步骤(2)中所述的壳聚糖的初始质量分数优选为0.4％；
步骤(2)中所述的重组霍乱毒素b亚基蛋白和壳聚糖溶液的体积比优选为1:10；
步骤(2)中所述的佐剂与pedv灭活病毒液的体积比优选为1:1；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明使用大肠杆菌表达系统表达重组霍乱毒素b亚基蛋白，一方面本发明提供的纯化方法制备蛋白，生产成本低廉，适于大规模工业生产，另一方面，该蛋白具有良好的免疫刺激效果，并且能适用于口服免疫。
(2)本发明利用壳聚糖/tpp离子交联法交联重组霍乱毒素b亚基蛋白后，具有缓释的效果，可作为佐剂，与质量分数为0.4％的壳聚糖佐剂混合使用，作为黏膜免疫佐剂，能够更好地发挥佐剂的效果。
(3)本发明制得的灭活疫苗具有良好的安全性，采用口服的免疫途径免疫动物后，适合养殖场大规模免疫，产生的pedv抗体速度快、水平高且持续时间长。
(4)本发明制得的重组霍乱毒素b亚基蛋白作为佐剂具有良好的发展前景，不但可以和一种灭活病毒配合使用，还能和多种灭活病毒配合制备成多联苗。
(5)本发明为着手解决传统pedv灭活疫苗在黏膜免疫上的不足，通过表达黏膜佐剂分子，与常规的灭活疫苗联合使用，互相弥补，从黏膜的局部免疫和血清中的全身免疫两个方面入手，提升现有的pedv疫苗的整体免疫防控效果。
附图说明
图1是本发明实施例2中大肠杆菌表达的目的蛋白的sds-page(考马斯亮蓝染色)电泳图；其中，m：蛋白marker；1：pet-32a-ctb/bl-21(de3)plyss菌株的表达(全菌未破碎)；2：pet-32a-ctb/bl-21(de3)plyss菌株的可溶性的表达(菌体破碎后的上清)；3：pet-32a-ctb/bl-21(de3)plyss菌株的非可溶性表达(菌体破碎后的沉淀)；4：空载体pet-32a/bl-21(de3)plyss菌株以同样条件处理诱导后的对照；左侧数字为marker大小，单位为kda，图中箭头所指为与对照相比，疑似的融合表达的目的蛋白。
图2是本发明实施例2中纯化前后的目的蛋白的sds-page(考马斯亮蓝染色)电泳图；其中，m：蛋白marker；1：纯化后蛋白(菌体破碎的沉淀，经过变性-复性-纯化后的蛋白)；2：未纯化的蛋白(菌体破碎后的沉淀溶于变性液)。
图3是本发明实施例2中大肠杆菌表达的目的蛋白的westernblot电泳图；其中，m：蛋白marker；1：pet-32a-ctb/bl-21(de3)plyss菌株的可溶性的表达(菌体破碎后的上清)；2：pet-32a-ctb/bl-21(de3)plyss菌株的非可溶性表达(菌体破碎后的沉淀)；3：pet-32a-ctb/bl-21(de3)plyss菌株的表达(全菌未破碎)；4：空载体pet-32a/bl-21(de3)plyss菌株以同样条件处理诱导后的对照。左侧数字为marker大小，单位为kda，图中条带与图1结果相比，确定其为融合表达的目的蛋白。
图4是本发明实施例2中交联后的目的蛋白缓释效果的结果分析图；其中，纵坐标代表测量的蛋白浓度，横坐标为释放的时间。
图5是本发明效果实施例中灭活疫苗通过口服免疫小鼠后不同时间血清中pedv特异性igg抗体水平结果分析图；其中共三组：分别为pedv灭活+0.4％壳聚糖+ctb交联剂(实施例3)组、pedv灭活+质量分数0.4％壳聚糖(对比实施例)组和pbs对照组；纵坐标代表以450nm波长检测的样品吸光度；28d、35d、42d、49d、56d分别代表一免后28天、35天、42天、49天、56天。
图6是本发明效果实施例中灭活疫苗通过口服免疫小鼠后不同时间肠黏膜组织中pedv特异性iga抗体水平结果分析图；其中共三组：分别为pedv灭活+0.4％壳聚糖+ctb交联剂(实施例3)组、pedv灭活+质量分数0.4％壳聚糖(对比实施例)组和pbs对照组；纵坐标代表以450nm波长检测的样品吸光度。42d、49d、56d分别代表一免后42天、49天、56天。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
1mg/ml壳聚糖/醋酸溶液：称取一定量的壳聚糖溶于体积分数为1％醋酸溶液(1ml冰醋酸溶于100mlddh2o)中，配成1mg/ml，放入锥形瓶中磁力搅拌(1200rpm)，调节ph值为5，依次用0.45μm和0.22μm滤器过滤，保存备用；
质量分数为0.4％的壳聚糖溶液：称取一定量的壳聚糖溶于体积分数为1％醋酸溶液，得到质量分数为0.4％的壳聚糖溶液；
三聚磷酸钠tpp溶液：称取一定量的tpp溶于去离子水中，配成0.25mg/ml，调节ph值为5；依次用0.45μm和0.22μm滤器过滤，保存备用；
测定蛋白浓度：使用bca试剂盒测定蛋白浓度；
pedvgd-a毒株，已在申请号为“201310453489.3”、申请名称为“一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用”的专利中公开；
实施例1可溶性重组蛋白表达载体的构建
(1)ctb蛋白基因的获得
以ncbi数据库中的霍乱毒素b亚基蛋白(ctb)蛋白的序列为基础，经比对后，选出ctb蛋白氨基酸序列，氨基酸如下所示，委托北京六合华大基因科技公司进行基因合成，基因合成时两端加入酶切位点(bamhi和xhoi)，加入酶切位点后的核苷酸序列如下所示，合成后的基因命名为ctb-gene。
氨基酸序列：
miklkfgvfftvllssayahgtpqnitdlcaeyhntqihtlndkifsyteslagkremaiitfkngatfqvevpgsqhidsqkkaiermkdtlriaylteakveklcvwnnktphaiaaisman.
核苷酸序列：
cgcggatccatgattaaattaaaatttggtgttttttttacagttttactatcttcagcatatgcacatggaacacctcaaaatattactgatttgtgtgcagaataccacaacacacaaatacatacgctaaatgataagatattttcgtatacagaatctctagctggaaaaagagagatggctatcattacttttaagaatggtgcaacttttcaagtagaagtaccaggtagtcaacatatagattcacaaaaaaaagcgattgaaaggatgaaggataccctgaggattgcatatcttactgaagctaaagtcgaaaagttatgtgtatggaataataaaacgcctcatgcgattgccgcaattagtatggcaaattaactcgagcgg
(2)重组表达载体质粒的构建
将ctb-gene及pet-32a同时用bamhi和xhoi两种限制性内切酶进行双酶切，然后回收纯化，16℃连接15h；连接产物转化到e.colidh5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的lb平板，37℃过夜培养；挑取平板上的单菌落，在含氨苄青霉素的液体lb培养基培养4h，然后进行菌液pcr鉴定和送华大基因公司测序；将测序正确的菌液按照体积比1:1000加入到新鲜的含氨苄青霉素的lb中，培养过夜，之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为pet-32a-ctb。
(3)重组表达菌株的构建
将重组质粒pet-32a-ctb转化大肠杆菌bl-21(de3)plyss，涂布到含氨苄青霉素的lb平板，37℃过夜培养，获得重组表达菌株pet-32a-ctb/bl-21(de3)plyss菌株。
实施例2重组霍乱毒素b亚基蛋白的制备
(1)表达：从-20℃中取出实施例1制得的pet-32a-ctb/bl-21(de3)plyss菌株，以体积比1:1000接入含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中37℃，220rpm摇床上过夜培养，得到种子液；种子液以体积比1:100接入含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基，温度37℃，220rpm摇床上培养4h左右，培养至菌体浓度a600达到0.6；在菌液中加入终浓度为1mm的iptg，在诱导温度30℃下，以150rpm转速进行诱导6h，收集菌体，采用pbs以体积比1:10重悬菌体，将重悬后的菌体利用超声破碎仪破碎(条件：功率200w，工作时间/间歇时间＝5sec/5sec)，超声次数根据破碎后菌液是否呈清亮状态；然后直接取部分菌液样品进行sds-page分析，结果如图1所示，从图1可以看出，与泳道4的空载体pet-32a/bl-21(de3)plyss菌株相比，1和3泳道在约30kda处明显多出一条蛋白条带，与预期相符，表明ctb蛋白能成功表达，且大部分存于3泳道沉淀中，为不可溶性的包涵体蛋白；将剩余破碎后的菌液4℃12000rpm离心10min，收集上清和沉淀，分别进行sds-page分析，最终确定目的蛋白为沉淀部分(图1)；
(2)变性：将(1)制得的沉淀重悬于pbs中，12000rpm离心10min，弃上清；再次用pbs重悬，重复离心，弃上清；总共用pbs洗涤3次；洗涤后12000rpm离心10min，收集沉淀，用变性液(8mol/l尿素，0.1mol/lnah2po4，0.01mol/ltris，ph＝8.0)重悬沉淀后，超声(功率200w，工作时间/间歇时间＝5sec/5sec)，至澄清(沉淀溶解)；然后放入37℃摇床，150rpm变性处理2h；12000rpm离心收集上清，并用0.45μm滤膜过滤，备样进行sds-page，其余-20℃保存。
(3)纯化：使用ni-nta亲和层析柱对蛋白进行纯化，具体包含如下步骤：
①上柱及预处理：将镍柱填料装填至柱子中，先用ddh2o过柱洗涤，再用500mmol/l咪唑洗脱液过柱，最后用20mmol/l咪唑洗脱液过柱；
②上样：将步骤(2)制得的上清加入柱子内，过柱2遍；
③冲洗杂蛋白：用20mmol/l咪唑洗脱液过柱冲洗杂蛋白；
④洗脱：用500mmol/l咪唑洗脱液过柱，得到重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白；
(4)复性：步骤(3)纯化后的蛋白用不同的复性缓冲液进行梯度透析复性，透析袋用终浓度1mmedta2na和终浓度2wt％nahco3浸泡，放入微波炉中火15min煮沸，取出后冷却，用ddh2o清洗三次，加入终浓度1mmedta2na重复煮沸，冷却后将需要复性的重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白转入透析袋中放入大烧杯，随后加入8m尿素的pbs溶液，置于4℃冰箱11h，取出弃掉8m尿素的pbs溶液；再加入6m尿素的pbs溶液进入烧杯中，重复4℃11h，取出弃掉6m尿素的pbs溶液；以此类推，按照8m、6m、4m、2m、0m尿素pbs溶液依次更换复性液，最后取出透析袋中的液体，取部分样品进行sds-page和western-blot检测。结果如图2和图3所示，由图2可看出，相比未纯化蛋白(泳道1)，通过本研究变性-纯化-复性方法后蛋白纯度大大提高(泳道2)，同时通过western-blot进一步确认ctb蛋白能与his标签单克隆抗体特异性识别。
(5)交联：冰浴条件下，将5ml步骤(4)复性后的重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白(浓度为0.5mg/ml)与5ml1mg/ml的壳聚糖/醋酸溶液冰浴振荡混合30min，调整体系ph为5.5；然后采用常温磁力搅拌器25℃1200rpm搅拌处理10min；随后边搅拌边用注射器向其中缓慢滴加4ml0.25mg/mltpp，其中，壳聚糖与tpp质量比为5:1；滴加完成后继续25℃搅拌30min，15000rpm、4℃离心30min，弃上清，收集沉淀，沉淀经ddh2o洗三次，然后再次用ddh2o将沉淀重悬，超声振荡(50w，工作时间/间歇时间5sec/5sec)使沉淀溶解，得到重组霍乱毒素b亚基蛋白，4℃保存。
将交联后的重组霍乱毒素b亚基蛋白以体积比1:1加入到质量分数为0.4％的壳聚糖溶液中，充分振荡混匀，置于37℃摇床中100rpm振荡，在不同的时间(0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h和48h)取出，取出后以15000rpm离心30min，取上清使用分光光度计测定蛋白含量。结果见图4。从图中可知，前18h缓慢释放，于24～48h稳定释放，可持续至48h。
实施例3重组霍乱毒素b亚基蛋白的制备
(1)表达：从-20℃中取出实施例1制得的pet-32a-ctb/bl-21(de3)plyss菌株，以体积比1:1000接入含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中37℃，220rpm摇床上过夜培养，得到种子液；种子液以体积比1:100接入含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基，温度37℃，220rpm摇床上培养4h左右，培养至菌体浓度a600达到0.6；在菌液中加入终浓度为1mm的iptg，在诱导温度30℃下，以150rpm转速进行诱导6h，收集菌体，采用pbs以体积比1:10重悬菌体，将重悬后的菌体利用超声破碎仪破碎(条件：功率200w，工作时间/间歇时间＝5sec/5sec)，超声次数根据破碎后菌液是否呈清亮状态；然后破碎后的菌液4℃12000rpm离心10min，收集沉淀；
(2)变性：将(1)制得的沉淀重悬于pbs中，12000rpm离心10min，弃上清；再次用pbs重悬，重复离心，弃上清；总共用pbs洗涤3次；洗涤后12000rpm离心10min，收集沉淀，用变性液(8mol/l尿素，0.1mol/lnah2po4，0.01mol/ltris，ph＝8.0)重悬沉淀后，超声(功率200w，工作时间/间歇时间＝5sec/5sec)，至澄清(沉淀溶解)；然后放入40℃摇床，150rpm变性处理1.5h；12000rpm离心收集上清，并用0.45μm滤膜过滤；
(3)纯化：使用ni-nta亲和层析柱对蛋白进行纯化，具体包含如下步骤：
①上柱及预处理：将镍柱填料装填至柱子中，先用ddh2o过柱洗涤，再用500mmol/l咪唑洗脱液过柱，最后用20mmol/l咪唑洗脱液过柱；
②上样：将步骤(2)制得的上清加入柱子内，过柱2遍；
③冲洗杂蛋白：用20mmol/l咪唑洗脱液过柱冲洗杂蛋白；
④洗脱：用500mmol/l咪唑洗脱液过柱，得到重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白；
(4)复性：步骤(3)纯化后的蛋白用不同的复性缓冲液进行梯度透析复性，透析袋用终浓度1mmedta2na和终浓度2wt％nahco3浸泡，放入微波炉中火15min煮沸，取出后冷却，用ddh2o清洗三次，加入终浓度1mmedta2na重复煮沸，冷却后将需要复性的重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白转入透析袋中放入大烧杯，随后加入8m尿素的pbs溶液，置于4℃冰箱10h，取出弃掉8m尿素的pbs溶液；再加入6m尿素的pbs溶液进入烧杯中，重复4℃10h，取出弃掉6m尿素的pbs溶液；以此类推，按照8m、6m、4m、2m、0m尿素pbs溶液依次更换复性液，最后取出透析袋中的液体；
(5)交联：冰浴条件下，将5ml步骤(4)复性后的重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白(浓度为0.5mg/ml)与5ml1mg/ml的壳聚糖/醋酸溶液冰浴振荡混合30min，调整体系ph为5.3；然后采用常温磁力搅拌器40℃1200rpm搅拌处理5min；随后边搅拌边用注射器向其中缓慢滴加4ml0.25mg/mltpp，其中，壳聚糖与tpp质量比为5:1；滴加完成后继续25℃搅拌30min，20000rpm、4℃离心30min，弃上清，收集沉淀，沉淀经ddh2o洗三次，然后再次用ddh2o将沉淀重悬，超声振荡(50w，工作时间/间歇时间5sec/5sec)使沉淀溶解，得到重组霍乱毒素b亚基蛋白，4℃保存。
将交联后的重组霍乱毒素b亚基蛋白以体积比1:1加入到质量分数为0.4％的壳聚糖溶液中，充分振荡混匀，置于37℃摇床中100rpm振荡，在不同的时间(0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h和48h)取出，取出后以15000rpm离心30min，取上清使用分光光度计测定蛋白含量。结果同实施例2，前18h缓慢释放，于24～48h稳定释放，可持续至48h。
实施例4重组霍乱毒素b亚基蛋白的制备
(1)表达：从-20℃中取出实施例1制得的pet-32a-ctb/bl-21(de3)plyss菌株，以体积比1:1000接入含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中37℃，220rpm摇床上过夜培养，得到种子液；种子液以体积比1:100接入含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基，温度37℃，220rpm摇床上培养4h左右，培养至菌体浓度a600达到0.6；在菌液中加入终浓度为1mm的iptg，在诱导温度30℃下，以150rpm转速进行诱导6h，收集菌体，采用pbs以体积比1:10重悬菌体，将重悬后的菌体利用超声破碎仪破碎(条件：功率200w，工作时间/间歇时间＝5sec/5sec)，超声次数根据破碎后菌液是否呈清亮状态；然后破碎后的菌液4℃12000rpm离心10min，收集沉淀；
(2)变性：将(1)制得的沉淀重悬于pbs中，12000rpm离心10min，弃上清；再次用pbs重悬，重复离心，弃上清；总共用pbs洗涤3次；洗涤后12000rpm离心10min，收集沉淀，用变性液(8mol/l尿素，0.1mol/lnah2po4，0.01mol/ltris，ph＝8.0)重悬沉淀后，超声(功率200w，工作时间/间歇时间＝5sec/5sec)，至澄清(沉淀溶解)；然后放入30℃摇床，150rpm变性处理1.5h；12000rpm离心收集上清，并用0.45μm滤膜过滤；
(3)纯化：使用ni-nta亲和层析柱对蛋白进行纯化，具体包含如下步骤：
①上柱及预处理：将镍柱填料装填至柱子中，先用ddh2o过柱洗涤，再用500mmol/l咪唑洗脱液过柱，最后用20mmol/l咪唑洗脱液过柱；
②上样：将步骤(2)制得的上清加入柱子内，过柱2遍；
③冲洗杂蛋白：用20mmol/l咪唑洗脱液过柱冲洗杂蛋白；
④洗脱：用500mmol/l咪唑洗脱液过柱，得到重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白；
(4)复性：步骤(3)纯化后的蛋白用不同的复性缓冲液进行梯度透析复性，透析袋用终浓度1mmedta2na和终浓度2wt％nahco3浸泡，放入微波炉中火15min煮沸，取出后冷却，用ddh2o清洗三次，加入终浓度1mmedta2na重复煮沸，冷却后将需要复性的重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白转入透析袋中放入大烧杯，随后加入8m尿素的pbs溶液，置于4℃冰箱12h，取出弃掉8m尿素的pbs溶液；再加入6m尿素的pbs溶液进入烧杯中，重复4℃12h，取出弃掉6m尿素的pbs溶液；以此类推，按照8m、6m、4m、2m、0m尿素pbs溶液依次更换复性液，最后取出透析袋中的液体；
(5)交联：冰浴条件下，将5ml步骤(4)复性后的重组霍乱毒素b亚基纯化蛋白(浓度为0.5mg/ml)与5ml1mg/ml的壳聚糖/醋酸溶液冰浴振荡混合30min，调整体系ph为5.8；然后采用常温磁力搅拌器20℃1200rpm搅拌处理15min；随后边搅拌边用注射器向其中缓慢滴加4ml0.25mg/mltpp，其中，壳聚糖与tpp质量比为5:1；滴加完成后继续25℃搅拌30min，18000rpm、4℃离心30min，弃上清，收集沉淀，沉淀经ddh2o洗三次，然后再次用ddh2o将沉淀重悬，超声振荡(50w，工作时间/间歇时间5sec/5sec)使沉淀溶解，得到重组霍乱毒素b亚基蛋白，4℃保存。
将交联后的重组霍乱毒素b亚基蛋白以体积比1:1加入到质量分数为0.4％的壳聚糖溶液中，充分振荡混匀，置于37℃摇床中100rpm振荡，在不同的时间(0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h和48h)取出，取出后以15000rpm离心30min，取上清使用分光光度计测定蛋白含量。结果同实施例2，前18h缓慢释放，于24～48h稳定释放，可持续至48h。
实施例5pedv灭活疫苗的制备
(1)pedv的灭活
将pedvgd-a毒株经过细胞培养扩大后，正常收回毒液(滴度10-4tcid50)，无菌条件下加入初始质量分数为40％的甲醛溶液至pedv病毒液中，至甲醛终体积分数为0.3％，摇匀；然后放入37℃温箱中，灭活48h(每隔一段时间摇匀)；灭活后加入等体积的硫代硫酸钠溶液中和甲醛，细胞实验验证灭活病毒效果；
(2)制备pedv口服疫苗
将实施例2制得的浓度为0.5mg/ml的重组霍乱毒素b亚基蛋白以体积比1:1加入到质量分数为0.4％的壳聚糖佐剂中，充分振荡混匀，得到佐剂；然后与pedv灭活病毒液以体积比1:1混合，得到pedv灭活疫苗。
对比实施例
(1)pedv的灭活：同实施例3；
(2)制备疫苗:将质量分数为0.4％的壳聚糖佐剂与pedv灭活病毒液以体积比1:1混合，得到疫苗。
效果实施例pedv灭活疫苗的小鼠免疫试验
将27只6周龄pedv抗体阴性的balb/c小鼠(购自广东省医学实验动物中心)随机分为3组，每组9只。每组均采用口服的方式免疫，共免疫两次，每次间隔一周。第一组：每只小鼠免疫100μl实施例3制得的pedv灭活疫苗；第二组：每只小鼠免疫100μl对比实施例制得的疫苗；第三组：每只小鼠免疫100μl无菌pbs(对照组)。
第二次免疫后第二周(实验第四周，第28天)至第二次免疫后第五周(实验第八周，第56天)，每周随机挑选3只小鼠进行眼眶静脉采血，析出的血清使用本实验室制备的pedvelisa检测igg试剂盒进行抗体检测。检测结果见图5。
实验第六周(第42天)至实验第八周(第56天)，每周在采集完血液后，随机挑选3只小鼠进行安乐死，采集肠组织，研磨后使用pedvelisa检测iga试剂盒进行抗体检测。检测结果见图6。
结果显示：实施例3制得的pedv灭活疫苗免疫小鼠后通过口服免疫途径都能快速在血清及肠组织产生针对pedv的抗体(分别为igg抗体和iga抗体)，且与对比实施例制得的疫苗相比产生的抗体更加迅速、水平更高。
因此本发明制得的pedv灭活疫苗充分激活了小鼠体内免疫系统，从采集的血清中来看，其血清pedv特异性igg抗体有明显的提升，在实验期第35天时与单独使用质量分数0.4％的壳聚糖溶液作为佐剂的灭活pedv组有明显的差异，随后在实验期第49天达到高峰，这表明该疫苗有效的激活了全身性免疫。对于肠组织中iga抗体，同样在实验期第49天达到顶峰，并且单独使用0.4％壳聚糖溶液作为佐剂的灭活pedv组相对pbs对照组只有少量提升，因此本发明制得的重组霍乱毒素b亚基蛋白的免疫增强效果是非常明显的。最终，本发明制得的pedv灭活疫苗通过口服免疫小鼠，能在血清及肠道中分别提升igg抗体和iga抗体的水平，有效地激活全身性免疫和肠道局部的黏膜免疫，发挥更强的保护效果和抗病毒效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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<110>华南农业大学
<120>重组霍乱毒素b亚基蛋白、pedv灭活疫苗及制备与应用
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