本发明属于食品致病菌检测技术领域，具体涉及一种叶类蔬菜中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法。
背景技术：
食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，食源性致病菌对人类健康造成极大危害，是食品安全的重大隐患。食源性疾病并不随经济发展和技术进步而减少或消失，世界范围内食品安全恶性事件接连发生，食源性疾病未能受到有效控制，食源性疾病发生率居高不下，食品安全形势严峻。尽管政府监管部门不断加大对食品安全的监管力度，对食品安全研究领域科研投入逐年加大，同时食品企业也不断提高生产过程中食品安全意识，引进了haccp等先进的管理体系来确保食品安全，但是食源性致病菌污染食品进而导致食源性疾病暴发日益频繁。目前对致病菌污染食品途径控制当中，还无法找到一种完全有效杜绝致病菌污染的方式，开发出快速灵敏实用性强的致病菌检测方法就成为确保食品安全的一个重要保障。
现阶段常用的快速检测方法虽然得到广泛应用，常规pcr和免疫学检测方法，通常面临的问题是检测方法灵敏度不够高，一般食品样品经过选择性增菌处理后，待检细菌浓度要达到104-105cfu/ml才能得到比较准确结果，当食品样品中存在防腐剂，天然抗菌，抑菌成分时，往往待检致病菌浓度达不到检测限，导致出现假阳性或者假阴性结果。此外，食品中含有大量的pcr反应抑制因子，比如脂肪、蛋白质、酶、抗生素、有机和无机化学物质，多糖类物质等，这些抑制因子极大地影响了pcr方法对食品中致病菌检测的应用。目前，对于克服pcr反应抑制因子的方法是通过检测前12-24小时增菌的手段，提高检测的灵敏度，但同时也延长了检测时间。
综上，现有技术存在的问题是，常规pcr方法和酶联免疫法灵敏度不够高，容易出现假阳性或者假阴性结果。
技术实现要素：
本发明提供的一种叶类蔬菜中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，解决了常规pcr和酶联免疫法灵敏度不够高，容易出现假阳性或者假阴性结果的问题。
本发明的目的是提供一种叶类蔬菜中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，包括以下步骤：
s1，收集待测样品
s2，制备环糊精处理样品
向待测叶菜样品中加无菌生理盐水，均质处理，加入环糊精，并使溶液中环糊精最终浓度为10g/100ml，均质处理，离心去除大颗粒物质，所得上清液离心，收集沉淀物溶于0.01m醋酸生理盐水缓冲液中，得到环糊精处理样品；
s3，制备牛乳蛋白
脱脂乳粉与超纯水混匀，确保脱脂乳粉彻底溶解；加入体积分数95％乙醇溶液，搅拌2min沉淀牛乳蛋白；沉淀的牛乳蛋白室温条件下离心；最终将沉淀的牛乳蛋白重新悬浮在超纯水中，调ph至9.0，得到牛乳蛋白溶液；
s4，制备牛乳蛋白包被活性炭
将活性炭用超纯水清洗，55℃干燥，得到干燥活性炭；向s3制备的牛乳蛋白溶液中加入干燥活性炭，混合液体在37℃、150rpm震荡包被120min，震荡完成后，倒掉上层液体，底层的活性炭用超纯水冲洗，干燥，得到牛乳蛋白包被活性炭；
s5，制备牛乳蛋白包被活性炭处理样品
用质量分数0.85％生理盐水清洗牛乳蛋白包被活性炭，将环糊精处理样品与清洗好的牛乳蛋白包被活性炭混合，室温震荡；将震荡后的混合物转移至装有玻璃棉的容器内，用所述0.01m醋酸生理盐水缓冲液清洗并收集洗脱液；洗脱液离心，弃去上清液；将沉淀悬浮在5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鲑鱼精dna溶液和超纯水；沸水浴，得到的细胞裂解物冰上冷却至室温，离心，取上清，并加入与上清等量体积4℃预冷的无水乙醇，离心，弃去上清液，保留沉淀的dna，加入无菌超纯水溶解沉淀的dna，得到dna模板，备用；
s6，pcr检测
pcr检测使用的引物序列为：
iap1：5’-acaagctgcagctgatgcag-3’
iap2：5’-tgagagcgtgtgtagtagct-3’
如果获得的pcr检测产物片段为131bp，则结果为阳性。
优选的，上述叶类蔬菜中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法中，s2的具体步骤为：取待测叶菜样品中加入无菌质量分数0.85％生理盐水，待测叶菜样品与无菌质量分数0.85％生理盐水的比例为1g：3ml，均质处理，加入环糊精，并使溶液中环糊精最终浓度为10g/100ml，继续均质2min，1000rpm离心5min，去除大颗粒物质，所得上清液10000rpm离心10min，收集沉淀物溶于0.01m醋酸生理盐水缓冲液中，得到环糊精处理样品。
优选的，上述叶类蔬菜中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法中，s3的具体步骤如下：将脱脂乳粉与超纯水按照24g：25ml的比例混匀，确保脱脂乳粉彻底溶解；加入相当于超纯水2倍体积的体积分数95％乙醇溶液，搅拌2min沉淀牛乳蛋白；沉淀的牛乳蛋白室温条件下5000rpm离心5min；最终将沉淀的牛乳蛋白重新悬浮在相当于乙醇溶液3倍体积的超纯水中，用0.1m氢氧化钠溶液调ph至9.0，得到牛乳蛋白溶液。
优选的，上述叶类蔬菜中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法中，s4的具体步骤如下：将粒径0.85～2.0nm的活性炭用超纯水清洗3次，55℃干燥，得到干燥活性炭；向s3制备的牛乳蛋白溶液中加入干燥活性炭，活性炭与牛乳蛋白溶液的比例为44g：150ml，混合液体在37℃、150rpm震荡包被120min，震荡完成后，倒掉上层液体，底层的活性炭用超纯水冲洗3次，55℃干燥，得到牛乳蛋白包被活性炭。
优选的，上述叶类蔬菜中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法中，s5中，将沉淀悬浮在5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鲑鱼精dna溶液和超纯水，其中，牛乳蛋白包被活性炭、牛血清白蛋白溶液、鲑鱼精dna溶液和超纯水的比例为4.6g:100μl:100μl:300μl。
优选的，上述叶类蔬菜中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法中，s6中，pcr采用50μlpcr反应体系：5μl10×pcrbuffer，4μldntps混合物，0.5μl引物iap1，0.5μl引物iap2，0.25μltaqdna聚合酶，模板1μl，ddh2o38.75μl；
pcr反应条件：94℃预变性4min；94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸7min；4℃保存。
与现有技术相比，一种叶类蔬菜中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，具有以下有益效果：
(1)本发明的方法是一种从叶类蔬菜中灵敏快速实用性强无需前增菌的pcr检测方法，大大缩短目前常规单核细胞增生李斯特氏菌检测及快速检测方法的检测时间(新建立的检测方法对样品的检测时间为4小时)，且检测限仅为10cfu/25g，检测灵敏度高，不容易出现假阴性结果，可以确保食品从农场到餐桌流通过程中的食品安全实时检测，进而更好地确保消费者健康。
(2)由于食品中含有大量的pcr反应抑制因子，比如脂肪、蛋白质、酶、抗生素、有机和无机化学物质，多糖类物质等，这些抑制因子极大地影响了pcr方法对食品中致病菌检测的应用。目前，对于克服pcr反应抑制因子的方法是通过检测前12-24小时增菌的手段，提高检测的灵敏度，但同时也延长了检测时间。
本发明的目的是建立有效的样品处理方法提高致病菌从食品中的回收率，消除pcr反应抑制因子。由于叶菜类蔬菜表面有一层蜡质结构，这种蜡质结构会影响到膨润土包被活性炭对叶菜类中单核细胞增生李斯特氏菌的吸附富集能力，进而会影响到该致病菌的检测结果。我们采用牛乳蛋白包被活性炭则能够较好的保持对该致病菌的吸附富集能力，可以更为灵敏准确的检测出叶菜类中的致病菌，因此对于叶菜类中单核细胞增生李斯特氏菌检测，本发明方法采用牛乳蛋白包被活性炭则能更好的确保检测灵敏度和准确性。另外在样品处理过程中添加定量鲑鱼精dna可以进一步去除pcr反应抑制因子，提高检测灵敏度，所以新建立的检测方法对样品的检测时间仅需要4小时。
附图说明
图1是阳性和阴性检测结果电泳图；
其中，m泳道为dnamaker，1、3-28号泳道为阳性检测结果，2号泳道为阴性检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下面实例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行。
实施例1
一种叶类蔬菜中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，包括以下步骤：
s1，收集待测样品
本实施例1收集的待测样品为人工污染样品，人工污染样品按以下方法制备：取25g叶菜样品(菠菜)人工污染1ml单核细胞增生李斯特氏菌菌悬液(浓度范围分别为100cfu/ml、101cfu/ml、102cfu/ml、103cfu/ml、104cfu/ml、105cfu/ml)，人工污染的样品放入4℃冰箱中保存过夜，确保致病菌有效的吸附在样品上，得到人工污染样品，检测开始前要对样品中的待检致病菌浓度进行实际测试，测试方法参照现行国家食品中各种致病菌检测方法进行。
s2，制备环糊精处理样品
取25g人工污染样品中加入75ml无菌质量分数0.85％生理盐水，利用均质机进行均质处理，加入环糊精溶液，并使溶液中环糊精最终浓度为5g/100ml，继续均质处理2min，1000rpm低速离心5min，去除大颗粒物质，所得上清液10000rpm高速离心10min，收集沉淀物溶于30ml0.01m醋酸生理盐水缓冲液中，得到环糊精处理样品。
其中，每升0.01m醋酸生理盐水缓冲液中溶质为0.01mol的乙酸和0.01mol的乙酸钠，溶剂为质量分数0.85％nacl溶液，用0.1m盐酸溶液调节ph为5.0。
s3，制备牛乳蛋白
婴幼儿脱脂乳粉24.0g加入到400ml烧杯中，加入25ml超纯水，磁力搅拌器中速搅拌2min，确保脱脂乳粉彻底溶解；取95％(体积分数)乙醇溶液50ml加入上述烧杯中，磁力搅拌2min沉淀牛乳蛋白；沉淀的牛乳蛋白转移到250ml离心瓶，室温条件下(20～25℃)、5000rpm(或者8000g)离心5min；最终沉淀的牛乳蛋白重新悬浮在150ml超纯水中，用0.1m氢氧化钠溶液调ph至9.0，得到牛乳蛋白溶液，备用。
s4，制备牛乳蛋白包被活性炭
将粒径0.85～2.0nm的活性炭用超纯水清洗3次，55℃干燥，得到干燥活性炭；将s3制备的150ml牛乳蛋白溶液转移到1l烧杯中，加入44g干燥活性炭，混合液体在37℃、150rpm震荡包被120min，震荡完成后，小心倾倒掉上层液体，底层的活性炭用超纯水轻轻冲洗3次，去除未被结合的牛乳蛋白，烧杯放置到55℃培养箱中干燥，直到牛乳蛋白包被的活性炭彻底干燥(干燥至水分含量≤2％)，得到牛乳蛋白包被活性炭，备用。
s5，制备牛乳蛋白包被活性炭处理样品
取4.6g牛乳蛋白包被活性炭加入到250ml烧杯中，用20ml智爱玲分数0.85％生理盐水清洗2次，将30ml环糊精处理样品与清洗好的牛乳蛋白包被活性炭混合，混合物在室温下160rpm旋转震荡15min；取0.2g无菌玻璃棉放至50ml无菌塑料注射器底部，将震荡后的混合物转移至装有玻璃棉的注射器内，以无菌离心管为收集容器，用所述0.01m醋酸生理盐水缓冲液清洗直至在无菌离心管中收集到30ml洗脱液；30ml洗脱液经10000rpm离心10min，弃去上清液保留沉淀；沉淀悬浮在0.5ml含有100μl5mg/ml牛血清白蛋白溶液(溶质为牛血清白蛋白，溶剂为无菌超纯水)中，加入100μl0.05mg/ml鲑鱼精dna溶液和300μl无菌超纯水；
将离心管放入沸水中，沸水浴热裂解细胞10min，将得到的细胞裂解物冰上冷却至室温，12000rpm离心5min，将上清液转移至干净离心管内，加入与该上清液等量体积4℃预冷的无水乙醇，以沉淀dna，离心管再次12000离心15min，弃去上清液，保留沉淀，加入100μl无菌超纯水溶解沉淀的dna，dna样品分装，每份10μl，得到dna模板，备用。
s6，pcr检测
针对单核细胞增生李斯特氏菌毒力基因(iap)设计特异引物序列，优化反应条件。所述引物序列为：
iap1：5’-acaagctgcagctgatgcag-3’
iap2：5’-tgagagcgtgtgtagtagct-3’
50μlpcr反应体系：5μl10×pcrbuffer，4μldntps混合物，0.5μl引物iap1(40μmol/l)，0.5μl引物iap2(40μmol/l)，0.25μl(5u/μl)taqdna聚合酶，模板1μl，ddh2o38.75μl。
pcr反应条件：94℃预变性4min；94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸7min；4℃保存。
如果获得的pcr检测产物片段为131bp，则结果为阳性，阳性和阴性检测结果电泳图如图1所示。其中，m泳道为dnamaker，1、3-28号泳道为阳性检测结果，2号泳道为阴性检测结果。
需要说明的是，实施例1中使用的环糊精是β-环糊精。
实施例2
一种叶类蔬菜中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，包括以下步骤：
实施例2的人工污染样品用生菜、油麦菜、油菜或者大白菜制备，或者直接选用菠菜、生菜、油麦菜、油菜或者大白菜作为待测样品进行后续s2的操作。其余s2～s6的步骤与实施例1相同，此处不予赘述。
实施例3
一种叶类蔬菜中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，包括以下步骤：
将实施例1的s3中的“脱脂乳粉24.0g”中的质量改为“12.0g、6.0g、3.0g、1.5g、0.75g或者0.38g中任一个”，其余操作同实施例1。
下面是实施例1的方法为例，说明本发明的效果。
一、不同引物的检测效果
我们对不同的食品中常见微生物进行实际测试，利用本发明实施例1的方法制备人工污染样品(叶菜样品包括菠菜、生菜、油麦菜、油菜或者大白菜)和提取不同微生物的dna，并利用本发明实施例1中的引物进行pcr反应，作为实验组，验证检测方法的特异性。所述微生物包括提取单核细胞增生李斯特氏菌，其他李斯特氏菌及非李斯特氏菌。
以已经公开发表的单核细胞增生李斯特氏菌检测引物特异性(prfa:5’-cccaagtagcaggacatgctaa-3’；prfb:5’-ggtatcacaaagctcacgag-3’)作为对照，其余操作同实验组。同时以现行国家食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测标准方法作为对比，来验证新建立的pcr检测方法的实用性，结果见表1。
表1不同引物检测方法的特异性
注：表1中“+”表示阳性结果，“—”表示阴性结果。
表1结果表明，实施例1采用的引物序列具有较好的特异性，只对单核细胞增生李斯特氏菌呈阳性检测结果，而对其他李斯特氏菌及非李斯特氏菌呈阴性检测结果。而另外一种prfa引物对于部分单核细胞增生李斯特氏菌呈阴性结果，部分其他李斯特氏菌检测呈阳性结果，表明该引物序列的特异性并不是很理想，存在假阴性检测结果的缺陷。现行国家食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测标准方法与实施例1的结果相同。
二、检测限的确定
将不同浓度的单核细胞增生李斯特氏菌人工污染到叶菜样品(包括菠菜、生菜、油麦菜、油菜或者大白菜)中，利用实施例1的检测方法进行检测，确定实施例1的检测灵敏度，结果见表2。由表2可知，实施例1的检测方法的检测灵敏度为10cfu/25g，且稳定性良好。生菜、油麦菜、油菜或者大白菜的检测结果与菠菜的检测结果完全相同，此处仅以菠菜的结果作为示例，即在菌体浓度为1cfu/25g时，检测结果为阴性，当菌体浓度大于等于10cfu/25g时，检测结果为阳性。说明本发明的方法对于叶菜样品(包括菠菜、生菜、油麦菜、油菜或者大白菜)均通用。
表2用菠菜制备的人工污染乳品的灵敏度
注：表1中“+”表示阳性结果，“—”表示阴性结果。
三、与现行国家标准方法的比较
采集市售新鲜菠菜、生菜、油麦菜、油菜或者大白菜各500份，分别采用本发明实施例1的快速检测方法和现行国家检测标准进行检测对比，用来验证该快速检测方法的实用性，结果见表3。由表3可知，实施例1的方法与现有国家标准方法的检出率、符合率和活体菌检测率均相同，但是实施例1的方法检测时间明显缩短，仅为4小时。
表3实际样品测试结果
四、保存时长实验
本发明的检测方法中所用到的主要试剂耗材有牛乳蛋白、牛乳蛋白包被活性炭、各种缓冲液等。其中，牛乳蛋白、牛乳蛋白包被活性炭采用实施例1的方法制备，各种缓冲液如未特殊提及，则采用现有方法制备。
为了测试本发明方法中所用到试剂耗材的稳定性，将方法中所用的试剂耗材均保存在-20℃冷冻条件下，分别保存3个月、6个月、12个月，随后分别采集市售的菠菜、生菜、油麦菜、油菜或者大白菜各500份进行测试比对，并与现行国家检测标准比对，确认本发明方法所用的试剂耗材在长时间保存下的稳定性与实用性。
表4人工污染样品保存时长实验测试结果
注：表4中“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。
表4的结果显示，将上述试剂耗材在-20℃保存3个月、6个月、12个月后对菠菜、生菜、油麦菜、油菜或者大白菜等样品测试其检测灵敏度，其检测灵敏度为10cfu/25g，结果证明本发明方法中的试剂耗材均可以在-20℃冷冻条件下至少保存12个月，其检测灵敏度不会受到影响。
为了测试本发明方法中所用到试剂耗材的稳定性，将方法中所用的试剂耗材均保存在-20℃冷冻条件下，分别保存3个月、6个月、12个月，随后分别采集市售的菠菜、生菜、油麦菜、油菜或者大白菜各500份进行测试比对，并与现行国家检测标准比对，确认本发明方法所用的试剂耗材在长时间保存下的稳定性与实用性。表5是实际样品的测试结果，表5结果显示本发明方法所用到的试剂耗材以及国家标准方法制备的试剂耗材在-20℃保存3个月、6个月、12个月条件下对菠菜、生菜、油麦菜、油菜或者大白菜等样品进行检测，并采用国家检测标准比对，本发明方法的检出率，符合率与国家检测标准方法均一致，活体菌检测率达到100％，结果证实本发明方法的实用性极好，所用试剂耗材(牛乳蛋白、牛乳蛋白包被活性炭等)可以在冷冻条件下稳定保存至少12个月。
表5实际样品保存时长实验测试结果
五、不同包被材料对检测结果灵敏度的影响
对比例：将实施例1中的“牛乳蛋白包被活性炭”改为“膨润土包被活性炭”，具体步骤如下：将200目的活性炭用去离子清洗3次，沥干备用。向4g膨润土中加入200ml超纯水，震荡1min，700rpm离心1min，弃沉淀，将120ml含有1.52g的膨润土的上层溶液转至1升的烧杯，加入30g沥干的活性炭(湿重)，烧杯放在旋转摇床中150rpm、37℃摇床过夜(≥12h)，随后将烧杯中的溶液放置在55℃烘箱中烘干，直至膨润土包被的活性炭变干(水分含量≤1％)，得到膨润土包被活性炭。需要说明的是，膨润土需要先进行清洗，除掉一些杂质，才能使用，我们实验证实了离心后的膨润土溶液中膨润土的含量是1.52g/120ml，所以不能直接将1.52g的膨润土加入到120ml水中，否则会影响检测结果。对比例的其余操作步骤同实施例1。
按照上文“二、检测限的确定”中所述方法测定人工污染样品的灵敏度，结果显示，按照实施例1的方法菠菜、生菜、油麦菜、油菜或者大白菜样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测限为10cfu/25g；按照对比例的方法菠菜、生菜、油麦菜、油菜或者大白菜样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测限为100cfu/25g。
我们各取市售菠菜、生菜、油菜、油麦菜和大白菜500份作为实际样品，检测实际样品中的单核细胞增生李斯特氏菌，结果显示，实施例1的牛乳蛋白包被活性炭材料中菠菜的阳性检出率为1.4％、生菜的阳性检出率为2.6％，油菜、油麦菜和大白菜的阳性检出率均为0％；对比例的膨润土包被活性炭中菠菜的阳性检出率为0.6％、生菜的阳性检出率为1.2％，油菜、油麦菜和大白菜的阳性检出率均为0％。
上述结果说明对于菠菜、生菜、油麦菜、油菜或者大白菜等叶菜样品，使用牛乳蛋白作为包被材料效果更好。叶菜类蔬菜表面有一层蜡质结构，这种蜡质结构会影响到膨润土包被活性炭对叶菜类中单核细胞增生李斯特氏菌的吸附富集能力，进而会影响到该致病菌的检测结果。而采用牛乳蛋白包被活性炭则能够较好的保持对该致病菌的吸附富集能力，可以更为灵敏准确的检测出叶菜类中的致病菌，因此对于叶菜类中单核细胞增生李斯特氏菌检测，本发明方法采用牛乳蛋白包被活性炭则能更好的确保检测灵敏度和准确性。
六、不同毒力基因对检测结果灵敏度的影响
本发明实施例1针对iap毒力基因设计引物，对在河北省、北京市、天津市等各大叶菜类蔬菜生产基地采集的叶菜类样品中一共分离鉴定的472株单核细胞增生李斯特氏菌(所有菌株均经过api10300生化鉴定试剂盒与bd全自动微生物菌株鉴定仪鉴定确保472株菌株为单核细胞增生李斯特氏菌)，其中本发明方法所设计的iap引物序列特异性达到了100％，而我们之前在牡蛎中检测单核细胞增生李斯特氏菌所设计的inlb引物序列在检测比对中发现有11株菌出现了inlb基因缺失现象，为了确保在叶菜类中准确检测单核细胞增生李斯特氏菌避免出现假阴性结果，在本发明方法中则采用了iap引物序列。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例1，尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。