本发明属于载体构建领域，具体涉及一种重组蝙蝠腺相关病毒载体及其用途。
背景技术：
腺相关病毒(adeno-associatedvirus,aav)为无包膜单链线状dna病毒，直径约25nm，病毒颗粒结构为正二十面体，属于微小病毒科伴随病毒属，最早在1965年atchison在分离腺病毒时作为污染物被发现。aav需要在腺病毒或者疱疹病毒的辅助下才可以完成复制，在缺少辅助病毒的情况下，野生型aav可以整合其基因组到人类19号染色体的一个特别位点。aav基因组大小约4.7kb,包括两个开放阅读框，分别为rep和cap。rep编码四个多功能蛋白，与病毒的复制和整合有关，cap编码3个衣壳蛋白，与aav的组织趋向性和免疫学性质相关。
目前在除人类的非灵长类动物中发现的aav血清型及变种已经有100多种，来自人类和灵长类动物的也有13种，由于aav的非致病性、广泛的细胞和组织亲嗜性等优点，一些aav血清型已经被用于某些临床疾病的基因治疗，如aav8被用于血友病b的基因治疗，aav1被用于脂蛋白脂肪酶缺乏的基因治疗。此外，越来越多的非灵长类动物aav也逐渐被研究改造。
但是在以前的临床研究中发现，人群中有59％的人自然感染aav2，人体免疫系统对aav载体的免疫反应严重影响aav载体介导的转基因表达的效率。中和抗体直接影响载体进入机体细胞导致其携带的目的基因达不到预期的表达水平或者完全不表达，从而大大降低基因治疗的效率。aav中和抗体是在aav载体进入机体后，其衣壳蛋白作为抗原呈递给b淋巴细胞产生的能够与aav载体表面结合的一种抗体，从而阻止aav载体黏附靶细胞受体或在机体细胞中运输，从而导致aav载体携带的目的基因无法进入细胞的特定位点以进行表达，从而大大降低基因转导的效率。不同的aav血清型表面有一些相同的抗体结合区域，即aav会与针对不同血清型aav中和抗体发生交叉反应，从而增加了aav载体被中和的概率。
为了克服体内预存中和抗体的影响，科研工作者们尝试了很多的方法：1、从灵长类动物和非灵长类动物中发现新的aav血清型。2、采用免疫抑制抑制机体对aav的免疫反应。3、利用空的aav衣壳诱捕针对aav载体的中和抗体。4、利用定向进化等基因工程方法改造aav衣壳蛋白，产生能逃逸aav抗体的aav突变株。以上方法各有特点，但是目前看来，发现新的aav血清型和定向进化已经成为提升aav抵抗中和抗体能力的两个重要方法。同时已经有科研工作者从非灵长类动物如牛和山羊等分离出新的aav，它们对人aav中和抗体有一定的抵抗能力。
蝙蝠是地球上许多人畜共患病病毒的储存库，和人体的健康密切相关。
目前，还没有采用蝙蝠aav作为基因治疗载体的相关报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题为：通过新的方法构建重组aav载体，抵抗人源aav抗体的中和，同时该重组蝙蝠aav载体对小鼠肌肉组织也有一定的转导能力。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种重组蝙蝠腺相关病毒载体，该重组载体的表达框架为：从5’到3’端依次为人aav2的rep基因，蝙蝠aav的cap基因和多聚腺苷酸加尾信号。
其中，上述重组蝙蝠腺相关病毒载体中，所述的人aav为aav2，所述人aav2的rep基因核苷酸序列为seqidno.1所示。
seqidno.1人aav2的rep基因核苷酸序列
acgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgggcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgatttaaatcaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttt
其中，上述重组蝙蝠腺相关病毒载体中，所述蝙蝠aav的cap基因为07yn的cap基因、09yn的cap基因、10hb的cap基因或1285的cap基因。
进一步的，上述重组蝙蝠腺相关病毒载体中，所述的07yn的cap基因的核苷酸序列为seqidno.2所示。
seqidno.207yn的cap基因的核苷酸序列
atgtcgtttgtcgatcaccccccagactggctcgaggagatcggagaggggctctccgagttcatcggactagaggcgggaccgccgaagcctaagccgggctaccgggaccgcgagcgcggcctcgtcgtccccggctacaagtacctcgggcccttcaacggactcgacaggggcgagcccgtcaacgcggccgacgcggcggccaagaagcacgacgaggagtacgaccggctcctcaaggagggggacaacccgtacctcacctacaaccacgcggacgccgagttccagaaggacctccggggcgacgccagcctagccggcaacgccgcgaacgcgctcttccaggccaagaagagggtcctcgagcccttcggactggtcgagggcgagccggagccgaagaagacgccttccgtcaagaggccgcacgcatcgccggactcgtcgagcggcgtcgggaagaagggcgaccagcccgcgaggaaaaggctcgactttggaacggagcccgcgagtcaagacggagccggacgagcggcgcaggcaaccggagatatggcatctgctgaagtggctgcgggtggtggcggaccagtgggcgacgatgcacaaggtgccgatggagtgggtagcgcctcgggaaattggcattgcgattccgtttggatggacggcgctgtcatcaccaagtccacccgaacctggagcctgcccgcctacaacaaccacctctaccgccagatccagtccagcggcaccggagacggcacgtactttggttacagcacgccttggggatacttcgatttcaatcgattccactgccacttttctcccagggactggcagcggctcatcaacaaccactggggcatccgccccaagcggctccactttaagctcttcaacatccaggtcaaggaggtcacgacgaccgacggcaccacgaccatcgccaacaacctcaccagcaccatacaggtctttgcggacacggagtaccagctcccgtacgtgctcggcaacgcccacgagggctgcctgccgccgttcccggcggacgtcttcatgctgccgcagtacgcgtacctgacgctcaacgccaaccccacgaaccagggcgcggccgcgctcagcctgccgcagagcgccttctactgcctggagtactttccgagccagatgctgaggaccgggaacaacttctcgttcagctacgagttcgagaagctgcccttccactcgatgttcatgcacagccagagcctggaccggctcatgaacccgctcatcgaccagtacctctggtacctcaacgccacgaccggcaacaacctctccttcaacaaggccggcgccaagaacttccccgagtacttccgcaactggctgcccgggcccggccagcgcgtgcagcagtggagcacgatcggaacccagaacaacgcgcagaccggcacgtgggccagcgccaacaagtggatcctcatgggcaggtccagcaagatggcccccgggctggcccagccggtcaggaacgcccagaccgtcaccaacggctcgcagctcatcttcaacaacgagaccatcaagggctccaccgcgacggcctccaccgtacactcggggctgctcgtcaccaacgagtcggagaccgccccgaccaaccccaactcggcgacaaagtggggcgtcatgacggacaaccagcagaccacctccactacgccgaccgtcagcgacgacctcgaggcgcacgtcttcccgggcatggtctggcaggaccgcgacatctacctgcagggcccgatatgggccaagatcccggagacggacggccacttccacccgtccccgctcatgggcggcttcgggctcaagaacccgccgccgcagatcctcgtcaagaacacgcccgtgcccgccgtgccgcccacgaccttcacaccgcagaaggtcaactccttcatcacgcagtactccaccggccaggtcaccgtcgagatcgagtgggagctgcgcaaggagaagagcaagcgctggaaccccgagatccagtacacctccaacttcgagaactcggccaacgtacagttctccgtcaacggcgacggcgcgtacatcgagccgcgaccgatcggaacccggtacctcacccacaacctgtaa。
其中，上述重组蝙蝠腺相关病毒载体中，所述的09yn的cap基因的核苷酸序列为seqidno.3所示。
seqidno.309yn的cap基因的核苷酸序列
atgtcgtttgtcgatcaccccccagactggctcgaggagatcggagaggggctctccgagtttatcggactagaggcgggaccgccgaagcctaagccgggctaccaggaccgcgcgcgcggcctcgtcgtccccggctacaagtacctcgggcccttcaacggactcgacaggggcgagcccgtcaacgcggccgacgcggcggccaagaagcacgacgaggagtacgaccggctcctcaaggagggggacaacccgtacctcacctacaaccacgccgacgcccagttccagcaggacctccggggcgacgccagcctagccggcaacgccgcgaacgcgctcttccaggccaagaagagggtcctcgagcccttcggactggtcgagggagagccggagccgaagaagacgccttccgtcaagaggccgcacgcatcgccggactcgtcgagcggcgtcgggaagaagggcgaccagcccgcgaggaagaggctcgactttggaacggagcccgcgagtcaagacggagccggacgagcggcgcaggcaaccggagatatggcatctgctgaagtggctgcgggtggtggcggaccagtgggcgacgatgcacaaggtgccgatggagtgggtagcgcctcgggaaattggcattgcgattccgtttggatggacggcgctgtcatcaccaagtccacccgaacctggagcctgcccgcctacaacaaccacctctaccgccagatccagtccagcggcaccggagacggcacgtactttggttacagcacgccttggggatacttcgatttcaatcgattccactgccacttttctcccagggactggcagcggctcatcaacaaccactggggcatccgccccaagcggctccacttcaagctcttcaacatccaggtcaaggaggtcacgacgaccgacggcaccacgaccatcgccaacaacctcaccagcaccatacaggtctttgcggacacggagtaccagctcccgtacgtgctcggcaacgcccacgagggctgcctgccgccgttcccggcggacgtcttcatgctgccgcagtacgcgtacctgacgctcaacgccaacccgacgtcgcagagcgcggccgcgctcagcctgccgcagagcgccttctactgcctcgagtacttcccgagccagatgctgaggaccgggaacaacttctcgttcagctacgagttcgagaagctgcccttccactcgatgttcatgcacagccagagcctggaccggctcatgaacccgctcatcgaccagtacctctggtacctcaacgccacgaccggcaacaacctctccttcaacaaggccggcgccaagaacttccccgagtacttccgcaactggctgcccgggcccggccagcgcgtgcagcagtggagcacgatcgggacccagaacaacgcgcagaccggcacgtgggccagcgccaacaagtggatcctcatgggcaggtccagcaagatggcccccgggctggcccagccggtccggaacgcccagaccgtcaccaacggctcgcagctcatcttcaacaacgagaccatcaagggctccaccgcgacggcctccaccgtgcactcggggctgctcgtcaccaacgagtcggagaccgccccgaccaaccccaactcggcgacaaagtggggcgtcatgacggacaatcagcagaccacctccactacgccgaccgtcagcgacgacctcgaggcgcacgtcttcccgggcatggtctggcaggaccgcgacatctacctgcagggcccgatctgggccaagatcccggagacggacggccacttccacccgtccccgctcatgggcggcttcgggctcaagaacccgccgccgcagatcctcgtcaagaacacgcccgtgcccgccgtgccgcccacgaccttcacgccgcagaaggtcaactccttcatcacgcagtactccaccggccaggtcaccgtcgagatcgagtgggagctgcgcaaggagaagagcaagcgctggaaccccgagatccagtacacgtccaacttcgagaactcggccaacgttcagttctccgtcaacggcgacggcgcgtacatcgagccccgcccgatcggaacccgatacctcacccacaccctgtaa。
其中，上述重组蝙蝠腺相关病毒载体中，所述的10hb的cap基因的核苷酸序列为seqidno.4所示。
seqidno.410hb的cap基因的核苷酸序列
atgtcgtttgtcgatcaccccccagactggctcgaggagatcggagaggggctctccgagtttatcggactagaggcgggaccgccgaagcctaagccgggctaccaggaccgcgcgcgcggcctcgtcgtccccggctacaagtacctcgggcccttcaacggactcgacaggggcgagcccgtcaacgcggccgacgcggcggccaagaagcacgacgaggagtacgaccggctcctcaaggcgggggacaacccgtacctcacctacaaccacgcggacgccgagttccagaaggacctccggggcgacgccagcctagccggcaacgccgcgaacgcgctcttccaggccaagaagagggtcctcgagcccttcggactggtcgagggagagccggagccgaagaagacgccttccgtcaagaggccgcacgcatcgccggactcgtcgagcggaatcgggaagaggggcgaccagcccgcgaggaagaggctcgactttggaacggagcccgcgagtcaagacggagcgggaagagcggccaacgcagccggagatatggcatctgctgaggtggctgcgggtggtggcggaccagtgggcgacgatgcacaaggtgccgatggagtgggtcagtcctcgggaaattggcattgcgattccgtttggatgggcgaccgagtgctcaccaagtccacccggacctggagcctgcccacctacaacaaccacctgtacaagcagatcaacggcagcggaaccggggacgcggtgtactttggttacagcacgccttggggatacttcgatttcaatcgattccactgccacttttctccccgagactggcagcgcctcgtcaacaaccactggggcatccgcccccgaaggctcaacttcaagctcttcaacatccaggtcaaggaggtcacgacgacggacggcaccaagaccatcgccaataacctcacgtccaccgtccaggtgtttgcggacacggagcaccagctcccgtacatcctaggctccgcgcacgagggctgcatgccgcccttccccgcggacgtcttcatgctgccgcagtacggctacctcacgctcaacgggcccggcagcaacaacaacaacctcagcacgccctcgagcgccttctactgcctcgagtacttcccgagccagatgctgcgcacgggcaacaacttcgtcttcacctacgagttcgagaaggtgcccttccactcgatgttcatgcacaaccaggcgctggaccgcctcatgaacccgctcgtcgaccagtacctctggtacctcgacgccacctccggcaacaacctcaccttccgcaaggccggcgccaagaacttccccgagtacttccgcaactggatcccaggcccgggctgccgcaaccagcagtggaacaaggtcggcaccaagaacaacccgcagaccggcacgtgggcgtccgccaacaagtggcggctgcagggccgcctcaacaagtacgcgcccggacagcccaacgcccccgcggagggcttcctcaccaacgccggcgacctggccttcgccaacgccaaggccaccggcgccaccacggccgccggaaccgtgcccgccgacatcctgctcaccagcgagagcgagaccaccaccaccaacatgatgtccaacaacggctggggcgcgatcgcctccaacaaccagaacgcgtccgtcgcgcccaccgtgcagtacgaggactcggcgcacgtgctgcccggcatggtctggcaggaccgcgacatctacctgcagggcccgatctgggccaagatcccggagacggacggccacttccacccctcgccgctcatgggcggcttcggactcaagaacccgcccccgcagatcctcatcaagaacacgcccgtgcccgccgaccccccgacgcagttctcctcgcagaagatcaactccttcatcacgcagtactccaccggccagatgaccgtcgagatcgagtgggagctgcgcaaggagaactccaagcgctggaaccccgagatccagtacacggccaacttcaacaacagcgccaacgcgcagttctccgtcaacaacaacggcctctacatcgaggaccgcaccatcggaacccgatacctcacccacaccctgtaa。
其中，上述重组蝙蝠腺相关病毒载体中，所述的1285的cap基因的核苷酸序列为seqidno.5所示。
seqidno.51285的cap基因的核苷酸序列
atgtcgtttgtcgatcaccccccagactggctcgaggagatcggagaggggctctccgagtttatcggactagaggcgggaccgccgaagcctaagccgggctaccaggaccgcgcgcgcggcctcgtcgtccccggctacaagtacctcgggcccttcaacggactcgacaggggcgagcccgtcaacgcggccgacgcggcggccaagaagcacgacgaggagtacgaccggctcctcaaggagggggacaacccgtacctcacctacaaccacgcggacgccgagttccagaaggacctccggggcgacgccagcctagccggcaacgccgcgaacgcgctcttccaggccaagaagagggtcctcgagcccttcggactggtcgagggcgagccggagccgaagaagacgccttccgtcaagaggccgcacgaatcgccggactcgtcgagcggcgtcgggaagaagggcgaccagcccgcgaggaaaaggctcgactttggaacggagcccgcgagtcaagacggagccggacgagcggcgcaggcaaccggagatatggcatctgctgaagtggctgcgggtggtggcggaccagtgggcgacgatgcacaaggtgccgatggagtgggtagcgcctcgggaaattggcattgcgattccgtttggatggacggcgctgtcatcaccaagtccacccgaacctggagcctgcccgcctacaacaaccacctctaccgccagatccagtccagcggcaccggagacggcacgtactttggttacagcacgccttggggatacttcgatttcaatcgattccactgccacttttctcccagggactggcagcggctcatcaacaaccactggggcatccgccccaagcggctccactttaagctcttcaacatccaggtcaaggaggtcacgacgaccgacggcaccacgaccatcgccaacaacctcaccagcaccatacaggtctttgcggacacggagtaccagctcccgtacgtgctcggcaacgcccacgagggctgcctgccgccgttcccggcggacgtcttcatgctgccgcagtacgcgtacctgacgctcaacgccaacccgacgaaccagggcgcggccgcgctcagcctgccgcagagcgccttctactgcctggagtactttccgagccagatgctgaggaccgggaacaacttctcgttcagctacgagttcgagaagctgcccttccactcgatgttcatgcacagccagagcctggaccggctcatgaacccgctcatcgaccagtacctctggtacctcaacgccacgaccggcaacaacctctccttcaacaaggccggcgccaagaacttccccgagtacttccgcaactggctgcccgggcccggccagcgcgtgcagcagtggagcacgatcggaacccagaacaacgcgcagaccggcacgtgggccagcgccaacaagtggatcctcatgggcaggtccagcaagatggcccccgggctggcccagccggtcaggaacgcccagaccgtcaccaacggctcgcagctcatcttcaacaacgagaccatcaagggctccaccgcgacggcctccaccgtacactcggggctgctcgtcaccaacgagtcggagaccgccccgaccaaccccaactcggcgacaaagtggggcgtcatgacggacaaccagcagaccacctccactacgccgaccgtcagcgacgacctcgaggcgcacgtcttcccgggcatggtctggcaggaccgcgacatctacctgcagggcccgatatgggccaagatcccggagacggacggccacttccacccgtccccgctcatgggcggcttcgggctcaagaacccgccgccgcagatcctcgtcaagaacacgcccgtgcccgccgtgccgcccacgaccttcacaccgcagaaggtcaactccttcatcacgcagtactccaccggccaggtcaccgtcgagatcgagtgggagctgcgcaaggagaagagcaagcgctggaaccccgagatccagtacacctccaacttcgagaactcggccaacgtacagttctccgtcaacggcgacggcgcgtacatcgagccgcgaccgatcggaacccggtacctcacccacaacctgtaa。
其中，上述重组蝙蝠腺相关病毒载体中，所述的表达框架由启动子启动表达。
进一步的，所述人aav2的rep基因由位于rep编码序列上游的p5或p19启动子调控表达。
其中，上述重组蝙蝠腺相关病毒载体中，所述蝙蝠aav的cap基因由位于rep基因下游的p40启动子调控表达。
进一步的，上述重组蝙蝠腺相关病毒载体中，所述的多聚腺苷酸信号为人aav2基因组中携带的多聚腺苷酸信号。
本发明还提供了一种上述重组蝙蝠腺相关病毒载体携带目的基因在体内靶向肌肉的用途。
本发明的有益效果为：
本发明根据物种差异，选择重组蝙蝠aav作为基因治疗的载体，通过pcr、酶切、连接的方法完成四种载体的构建，不需要特殊的载体质粒和试剂，方法简单，可操作性强；该重组载体可以逃逸人体内预存aav中和抗体的中和，能够转导小鼠的骨骼肌细胞，可以用于肌肉相关疾病的基因治疗。
附图说明
图1所示为4种野生型蝙蝠aav质粒(uf1-07yn、uf1-09yn、uf1-1285、uf1-10hb)生产携带荧光素酶报告基因的野生型aav的点杂交的结果；
图2所示为4种重组蝙蝠aav质粒(07yn、1285、09yn、10hb)生产携带荧光素酶报告基因的重组aav的点杂交的结果；
图3所示为小鼠静脉注射aav2、aav8以及3种蝙蝠aav(1285、09yn、10hb)载体2周后，小鼠体内各组织中荧光素酶的表达情况；
图4所示为小鼠肌肉注射aav2、aav8以及4种蝙蝠aav载体(07yn、1285、09yn、10hb)2周后，小鼠肌肉组织中荧光素酶的表达情况；
图5所示为小鼠静脉注射aav中和抗体24h后，再静脉注射aav2以及2种蝙蝠aav载体(09yn、10hb)，2周后小鼠肌肉组织中荧光素酶的表达情况；
图6所示为小鼠静脉注射aav中和抗体24h后，再肌肉注射aav2以及2种蝙蝠aav载体(09yn、10hb)，2周后小鼠肌肉组织中荧光素酶的表达情况。
具体实施方式
本发明提供了一种重组蝙蝠腺相关病毒载体，将蝙蝠aav的衣壳蛋白基因与人源的aav2的复制蛋白基因结合，构建得到4种重组蝙蝠腺相关病毒载体aav2-07yn，aav2-09yn，aav2-10hb和aav2-1285。
人体能够产生针对以aav2为代表的各种人aav血清型的中和抗体，而蝙蝠aav衣壳序列与代表性的人aav如aav2衣壳蛋白序列同源性约为60％，因此，本发明将蝙蝠aav的衣壳蛋白基因与人源的aav2的复制蛋白基因结合构建的重组载体能够逃避人aav的中和抗体中和，用于基因治疗。
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，而不是对本发明的限制。实施例中没有注明的具体技术或者条件，按照本领域的文献所描述的技术或者条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过普通市购可以获得的商品。
实施例1重组载体的构建
(1)从2007年收集的云南蝙蝠aav粪便样本扩增蝙蝠aav全长衣壳基因(genbank，no.gu226971)，得到2.5kb的pcr产物07yn，引物如下：
bt-cap5`:5`-cccaagcttcgggggaatctgactccgtgaacttcgccgaga-3`(seqidno.6)。
bt-cap3`:5`-ggaagatctcgcagagaccaaagttcaactgaaacga-3`(seqidno.7)。
用hindiii/bglii酶切上述pcr产物，回收2.5kb的片段，同时用hindiii/noti酶切uf1-aav8，回收6.0kb的片段，将两个片段用t4dna连接酶连接，则构建质粒uf1-07yn。
(2)为了对更多的蝙蝠dna样本进行pcr扩增，设计了一个简并引物dcap3`，与引物bt-cap5`一起，分别从云南和湖北获得的蝙蝠粪便样本扩增蝙蝠aav全长衣壳基因，得到两个2.5kb的pcr产物09yn和10hb，引物如下：
dcap3`:5`-ggaagatctactgamacgaat(h/-)ammcggtttattg-3`(seqidno.8)
其中，序列中的(h/-)：“h”代表a、c或t碱基，“-”代表碱基的缺失。
用hindiii/bglii酶切以上pcr产物，回收2.5kb的片段，同时用hindiii/noti酶切uf1-aav8，回收6.0kb的片段，将回收的两部分片段采用t4dna连接酶连接，则构建质粒uf1-09yn、uf1-10hb。
(3)此外，通过基因组dna的3`末端快速扩增(rapidamplificationofgenomicdnaends)获得蝙蝠aav基因组的3`非编码区序列，并由此设计了蝙蝠aav衣壳蛋白基因下游的另一个引物bt-cap3`-n1，与引物bt-cap5`一起从大足鼠耳蝙蝠(myotisricketti)肠dna样本扩增蝙蝠aav全长衣壳蛋白基因，得到2.5kb的pcr产物1285，引物如下：
bt-cap3`-n1:5`-ggaagatctacgcgagagaccggacttgactgaaacgaa-3`(seqidno.9)。
用hindiii/bglii酶切以上pcr产物，回收2.5kb的片段，同时用hindiii/noti酶切uf1-aav8，回收6.0kb的片段，将两个片段采用t4dna连接酶连接，则构建质粒uf1-1285。
将以上构建好的uf1-07yn，用hindiii/bglii酶切，回收2.5kb片段，同时用hindiii/noti酶切aav2/9，回收4.6kb片段，将回收的两部分片段连接，则构建质粒aav2-07yn，用类似的方法构建aav2-09yn、aav2-10hb、aav2-1285。
实施例2aav质粒包装野生型蝙蝠aav的能力验证
将构建的aav质粒(uf1-07yn,uf1-09yn,uf1-1285,uf1-10hb)和阳性对照uf1-aav8分别与腺病毒5辅助包装质粒phelper用磷酸钙共沉淀的方法包装出重组病毒。实验步骤、试剂、条件、方法如下：
实验中所述的标准质粒为uf1-aav8，它和重组野生型病毒均携带rep基因，因此可用靶向rep基因的探针进行点杂交实验，以测定重组野生型病毒的滴度。阳性和阴性对照均为用质粒uf1-aav8转染293细胞得到的上清，前者加入了包装aav必须的腺病毒phelper质粒，后者未加入phelper质粒，设置这两个对照主要是确保转染的成功以及点杂交的阳性信号是来自于致密的病毒颗粒而不是转染过程中引入的质粒污染。
将293细胞按1:3传代至6孔板中，24小时后，细胞密度约为70-80％，将腺病毒phelper质粒、野生型蝙蝠aav质粒uf1-07yn按1:1的质量比加入300μl0.25mcacl2，然后将质粒-cacl2混合液逐滴加入等体积的2×hbs中用于转染293细胞，8小时之后换液，56小时之后收集细胞，2500rpm离心10min，用100μl培养基重悬细胞沉淀，经3次反复冻融之后，2500rpm离心10min，取上清用于点杂交检测病毒包装效力。用同样的方法检测野生型蝙蝠aav载体质粒uf1-09yn,uf1-1285,uf1-10hb的病毒包装能力。结果如图1所示，说明4种野生型蝙蝠aav质粒均有包装报告基因的能力。
实施例3aav质粒包装重组型蝙蝠aav的能力验证
将腺病毒phelper质粒，重组型蝙蝠aav质粒aav2-07yn，aav2-09yn，aav2-1285，aav2-10hb与携带aav2itr和荧光素酶报告基因的质粒aav-luc1(来自美国北卡罗来纳大学)、用磷酸钙沉淀的方法包装出重组病毒。实验步骤、试剂、条件、方法如下：质粒名称中的aav2表示的是采用的aav2的rep基因，图中的aav2表示的是用aav2衣壳蛋白基因包装产生的重组型aav2病毒。
将293细胞按1:3传代至6孔板中，24小时后，细胞密度约为70-80％，将腺病毒phelper质粒、aav包装质粒(包括aav2-07yn，aav2-09yn，aav2-1285，aav2-10hb)、携带aav2itr和荧光素酶报告基因的aav-luc质粒按4:1:3的质量比加入300μl0.25mcacl2，然后将质粒-cacl2混合液逐滴加入等体积的2×hbs中用于转染293细胞，8小时之后换液，56小时之后收集细胞，2500rpm离心10min，用100ul培养基重悬细胞沉淀，经3次反复冻融之后，2500rpm离心10min，取上清用于斑点杂交检测病毒包装效力，结果如图2所示，结果显示实施例1构建的几种重组蝙蝠aav均有包装报告基因的能力。
实施例4重组蝙蝠aav载体的体内组织趋向性研究
将aav包装质粒aav2/1、aav2/2、aav2/8(来自美国北卡罗来纳大学)和蝙蝠aav包装质粒aav2-07yn，aav2-09yn，aav2-1285，aav2-10hb分别用于生产和纯化携带荧光素酶的重组型aav病毒，以静脉注射(5×1011载体基因组)和肌肉注射(1010载体基因组)的方式注入c57b6小鼠，以研究它们对小鼠不同器官的转导能力。
在将各种aav载体静脉注射小鼠后，各个器官中荧光素酶报告基因的表达结果如图3所示。蝙蝠aav对多数器官包括肝脏没有显著的转导，但可以以较低的水平转导小鼠的骨骼肌。
类似地，将各种aav载体直接肌肉注射小鼠后，骨骼肌中荧光素酶报告基因的表达结果如图4所示。蝙蝠aav能对小鼠骨骼肌进行一定程度的转导，其中10hb对肌肉的转导效率较高，其转基因表达水平与aav2相当。
实施例5重组蝙蝠aav在体内逃逸人aav抗体中和能力的研究
采用实施例1所述的方法生产和纯化携带荧光素酶报告基因的重组型aav2以及蝙蝠aav09yn和10hb载体，以静脉和肌肉两种注射的方式检测aav载体在小鼠体内逃逸人aav抗体的能力。
载体注射之前24h将静脉注射用免疫球蛋白(intravenousimmunoglobulin，ivig)静脉注射到scid小鼠(重症联合免疫缺陷)，使血浆中的抗体浓度达到约5mg/ml，再将5×1011载体基因组的aav载体静脉注射进入scid小鼠，两周后取出腓肠肌检测荧光素酶的活性，得到的结果如图5所示。没有抗体处理的时候，对照组aav2的荧光素酶表达分别是重组蝙蝠aav09yn和10hb的5倍和3倍，然而在抗体处理后，aav2介导的肌肉中的转基因表达是pbs处理组的1/6，09yn和10hb的转基因表达也分别下降到pbs处理组的1/2和1/4，此时10hb的表达和aav2的表达相当。据此我们看出3种重组蝙蝠aav在静脉注射的条件下对人aav抗体抵抗中和的能力为09yn>10hb>aav2。
类似地，在aav载体注射之前24h将静脉注射ivig到scid小鼠使血浆中的抗体浓度达到约10mg/ml，然后将1010载体基因组的aav载体直接肌肉注射入scid小鼠，两周后取出腓肠肌检测荧光素酶的活性，得到的结果如图6所示。没有抗体处理的时候，aav2载体介导的骨骼肌中的转基因表达分别为蝙蝠aav09yn和10hb的100倍和4倍。在抗体处理后，aav2和09yn的表达基本被完全抑制，但是10hb的表达减少到无抗体对照的14％，仍可检测到每mg蛋白酶活强度为2.4×105rlu。由此可见，蝙蝠aav10hb能够有效地逃逸人aav抗体的中和并转导骨骼肌，因此具有作为肌肉相关疾病基因治疗载体的潜力。
由实验结果可知：静脉注射条件下aav载体受到抗体中和的可能性更强，而肌肉注射可以在一定程度上减少抗体中和的影响。
序列表
<110>四川大学
<120>重组蝙蝠腺相关病毒载体及其用途
<130>a180216k（序）
<141>2018-04-12
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