本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及番茄slcyp724b2基因在干旱和对细菌性斑点病抗性中的应用。
背景技术：
番茄是全世界栽培最广泛的蔬菜作物之一，我国的番茄种植面积和产量都位居世界前列，番茄也是植物科学研究的重要模式植物，其在生产过程中受到各种非生物和生物胁迫的影响。
番茄原产地在南美洲热带地区，属于需水量较多的一种蔬菜作物，番茄在生长过程中很容易受到干旱胁迫的影响，干旱导致番茄体内活性氧积累，光合作用减弱，细胞结构稳定性受到破坏，直接影响了番茄的生长发育和产量形成。尽管常规育种在提高番茄的抗旱性方面已经取得了很多进展，但由于抗旱性状的生理和遗传复杂性，在改善抗旱性或开发抗旱品种方面具有局限性，因此，通过生物技术和常规育种相结合的方法研究番茄对干旱的适应性及其机制，对解决干旱引起的番茄生理失调、产量损失具有重要意义。
引起番茄细菌性斑点病的病原微生物为丁香假单胞菌番茄致病变种(pseudomonassyringaepv.tomato)。丁香假单胞菌菌体为短杆状，有一至数根极生鞭毛，无荚膜、无芽孢的革兰氏阴性细菌。虽然也可在烟草、拟南芥中致病，但pseudomonassyringaepv.tomato(pst)是以番茄为主要宿主的丁香假单胞菌番茄致病变种。它对番茄的危害主要表现在叶片上，通常是从番茄的下位成熟叶片开始发病，开始发病时病斑形状是水滴大小的斑点，逐渐变成暗褐色直至变为黑褐色且病斑一直往上位叶蔓延。病害也可发生在叶脉上，沿着叶脉脉络不断发展，使叶片受损枯萎。另外，该病的发生降低了番茄产量和风味。因此，培育能够提高番茄对细菌性斑点病抗性的品种在生产上具有重要的意义。
slcyp724b2基因是番茄br生物合成途径中的c22α-羟基化酶，属于细胞色素p450家族，体外实验的研究表明，cyp724b2在番茄br生物合成途径中发挥c-22羟基化酶的作用，能够催化c27，c28，c29甾醇的羟基化，促进油菜素内酯的合成。通过对slcyp724b2基因的克隆、转基因技术培育内源油菜素内酯含量升高的番茄材料，在提高番茄对非生物胁迫与生物胁迫的抗性方面，具有很好的应用前景。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种既能提高番茄抗旱性又能提高对细菌性斑点病抗性的基因以及蛋白质。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种调控番茄抗性和细菌性斑点病抗性的基因slcyp724b2，该基因具有seqidno：1所示的核苷酸序列。
本发明同时提供了一种上述基因编码的蛋白质，该蛋白质具有seqidno：2所示的蛋白质序列。
本发明还同时提供了含有上述基因的质粒以及含有上述基因的植物表达载体。
本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞。
本发明还同时提供了上述基因的用途：用于构建转基因番茄，所述转基因番茄能够提高对干旱和对细菌性斑点病的抗性。
本发明首次构建了番茄slcyp724b2基因过表达和基因沉默转基因植株，并进行功能研究。通过干旱和pstdc3000接种实验，发现slcyp724b2基因在番茄抗旱和抗细菌性病害中起到正向调控作用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是slcyp724b2基因过表达载体pgwb17::slcyp724b2载体图谱。
图2是slcyp724b2基因沉默表达载体pbin19::slcyp724b2i载体图谱。
图3是slcyp724b2基因过表达和基因沉默的株系中slcyp724b2基因的表达量。
图4是slcyp724b2基因过表达和基因沉默转基因植株对干旱的抗性表型。
图5是slcyp724b2基因过表达和基因沉默转基因植株干旱前后电导率变化。
图6是slcyp724b2基因过表达和基因沉默转基因植株对pstdc3000的抗性表型。
图7是slcyp724b2基因过表达和基因沉默转基因植株在pstdc3000侵染前后细菌生物量变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
一、获得番茄slcyp724b2基因全长序列：
用primerpremier6.0设计全基因扩增引物，取种植在浙江大学紫金港校区温室的野生型番茄ac(ailsacraig)叶片cdna为模版(cdna的提取方式为常规技术，例如可参照cn104561025a)，设计特异性引物slcyp724b2-f和slcyp724b2-r，用primerstar高保真酶pcr扩增slcyp724b2片段。
引物序列为：slcyp724b2-f：5’-atgggtgaagaaggtagtc-3’
slcyp724b2-r：5’-agtagaatttttatgaagtctg-3’
pcr扩增反应体系：2xprimerstarbuffer25ul、dntpmixture5ul、primerstardnapolymerase1ul、ddh2o16ul、cdna1ul、上下游引物各1ul，共50ul。pcr反应程序为：94℃预变性90秒；94℃变性30秒，57℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；最后72℃终延伸5分钟，将获得的pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后将扩增条带用axygendna凝胶试剂盒回收纯化，将回收产物构建到pqb-v3载体上，将上述重组质粒送到擎科公司测序确认。
所得的基因slcyp724b2的核苷酸序列如seqidno：1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno：2所示。
二、slcyp724b2基因过表达载体的构建
slcyp724b2过表达载体的构建，以pgwb17为终载体，构建具有camv35s重组型过表达启动子的pgwb17-35s::slcyp724b2载体。利用lr反应将目的片段从pqb-v3初始载体中转移到带有pgwb17终载体上。使用
三、slcyp724b2基因rnai沉默载体的构建
rnai干扰载体以phannibal为原始载体，通过pcr和酶切重组，构建camv35s启动子驱动下的slcyp724b2发卡沉默单元。选取slcyp724b2基因全长片段中约453bp的片段，确定该片段的序列没有编码的其它基因，以这样的序列作为rna干扰的片段。最终利用原始载体phannibal和中间载体pbin19共同的酶切位点sacⅰ&speⅰ酶切位点最终整合到植物双元载体pbin19上。
453bp的片段为：
gggtgaagaaggtagtcttttgataattgttatcaccctagtttttagttttgtaattggcataacattaaaccatttttggcctttgttcttcaataattatggtactactcttcatgttattcccaagggcacttttggatggcctttacttggtgaaaccctttcctttttgaagcctcatccttctaattctattggtactttccttcaacaacattgttctaggtatgggaaagtgttcaagtcacatttatttttctccccaacagtggtgtcatgtgaccaagaccttaattacttcatattacaaaacgaagataagttatttcagtgtagttatccaaagccaattcatggtatacttggcaaagtttcattgcttgtggctgttggcgacacacataaaaggcttaggaatgtttcattatcactaatcagcaccattaagtc。
具体步骤如下：
根据phannibal载体的多克隆位点和slcyp724b2基因的序列，构建slcyp724b2基因rnai载体的引物为：
用primerstar高保真酶进行扩增，pcr扩增反应体系：2xprimerstarbuffer25ul、dntpmixture5ul、primerstardnapolymerase1ul、ddh2o16ul、cdna1ul、上下游引物各1ul，共50ul。
hindⅲ&xbaⅰ双酶切原始phannibal质粒和上述pcr产物，t4连接酶连接并转化到大肠杆菌中，菌落pcr和酶切筛选阳性克隆。正确转化子命名为phannibal::slcyp724b2。
kpnⅰ&xhoⅰ双酶切phannibal::slcyp724b2质粒和上述pcr产物。t4连接酶连接并转化到大肠杆菌中，菌落pcr筛选阳性克隆。正确转化子命名为phannibal::slcyp724b2i。
用sacⅰ&speⅰ双酶phannibal::slcyp724b2i质粒，sacⅰ&xbaⅰ双酶切pbin19质粒。omegadna纯化试剂盒纯化酶切产物，分光光度计测定核酸浓度，t4连接并转化大肠杆菌top10感受态中，抗性培养基筛选，并用菌落pcr筛选阳性克隆，即为番茄slcyp724b2基因最终的rnai载体，正确转化子命名为pbin19::slcyp724b2i(图2)。
四、转基因材料的构建与检测：
将过表达载体pgwb17::slcyp724b2和基因沉默载体pbin19::slcyp724b2i转化农杆菌lba4404，并进行番茄子叶侵染，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗，利用pcr和rt-pcr验证阳性转基因植株。将t2代种子播在卡那霉素(50mg/l)的培养基上发芽，得到9个过表达和7个基因沉默转基因株系。
备注说明：满足种子在卡那霉素(50mg/l)的培养基上长侧根与未长侧根的分离比符合3：1且基因表达量升高两倍以上条件的属于过表达；满足种子在卡那霉素(50mg/l)的培养基上长侧根与未长侧根的分离比符合3：1且基因表达量降低50％以上条件的属于因沉默。选取基因转录水平较高的2个过表达和转录水平较低的2个基因沉默的株系作为研究对象(图3)。
图3中，ac代表未转基因的野生型番茄ailsacraig，oe-2代表slcyp724b2的一个过表达株系，oe-3代表slcyp724b2基因的一个过表达株系，rnai-9代表slcyp724b2的一个基因沉默株系，rnai-11代表slcyp724b2的一个基因沉默株系。
五、转基因株系抗逆性研究
1、抗旱性研究
野生型(ac)、过表达(oe)和基因沉默株系番茄植株培养40天时，选取大小一致的植株进行干旱处理，将上述三种材料分为两组，一组为对照组，一组为实验组。先将番茄植株浇水至饱和，之后对照组植株正常浇水，直至实验结束。实验组之后每隔一天测量一次土壤相对含水量，使土壤相对含水量从100％逐渐降至25％，干旱胁迫处理时间10-14天，干旱胁迫处理结束后与相同条件下未进行干旱处理的对照组进行比较，观察野生型(ac)、过表达(oe)和rnai株系番茄植株与未经干旱处理的对照组的性能差别以及电导率，结果显示过表达(oe)番茄植株能够显著提高番茄植株的抗旱性(图4)。干旱处理后过表达(oe)番茄植株电导率显著低于野生型(wt)和rnai株系番茄(图5)。
2、抗细菌性病害研究
pstdc3000菌种置于含25mg/l利福平的固体king’sb培养基(蛋白胨10g，k2hpo41.5g，甘油15ml，琼脂15g，h2o1l)上于28℃培养箱中培养2天后得以活化，挑取单菌落于含有同样抗生素的液体培养基中28℃，200rpm，扩大培养8-16h，直至od600＝0.6-1.0，然后于2500g离心10min，收集菌体。将收集的菌体用10mmmgcl2溶液重悬，并调节细菌浓度至od600＝0.1，加0.02％的有机硅，对番茄植株进行喷施，使得细菌菌液能够浸润叶片，细菌悬浮液通过气孔进入细胞间隙。3天后观察叶片发病情况，根据图6，可得知：过表达(oe)株系植株发病病况较轻，基因沉默株系番茄植株发病较为严重。
然后用直径为0.9cm的打孔器随机在接种了pstdc3000的番茄叶片上打6个叶圆片，然后放到含有500ul10mmmgcl2的磨样管中。用磨样仪4000rpm，研磨20sec。直到稀释到107倍，从每个稀释倍数中吸取10ul点到king’sb固体培养基上，28℃培养4天，取菌落数范围在9-90的点计算菌落形成单位(cfu)的数量。根据图7，可得知：过表达(oe)株系植株细菌生物量较少，基因沉默株系番茄植株细菌生物量较多。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110>浙江大学
<120>番茄slcyp724b2基因及其应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1443
<212>dna
<213>番茄(solanumlycopersicum)
<400>1
atgggtgaagaaggtagtcttttgataattgttatcaccctagtttttagttttgtaatt60
ggcataacattaaaccatttttggcctttgttcttcaataattatggtactactcttcat120
gttattcccaagggcacttttggatggcctttacttggtgaaaccctttcctttttgaag180
cctcatccttctaattctattggtactttccttcaacaacattgttctaggtatgggaaa240
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