本发明涉及柑橘转基因领域，具体涉及一种简单快速的柑橘无标记转基因方法。
背景技术：
柑橘类种质创新所应用的转基因方法很多，实验室中主要用根癌农杆菌介导的转化法，所用的外植体很多，有无菌实生菌的上胚轴切段、子叶、成年态茎段及田间成年树腋芽等。利用无菌实生菌上胚切段、子叶切块的遗传转化率频率较高，但外植体需无菌培养，成本也高，而且得到的转基因植株也带有抗性标记。李琳洁等发表的《柑橘无标记转基因转化体系的建立》（《湖南农业大学学报(自科版)》,2010,36(6):649-652）中通过β-雌二醇诱导表达系统控制重组酶系统cre基因表达来剔除标记基因nptⅱ，但切除并不完全，出现了嵌合体现象。陈善春等公开了《一种柑桔的转基因方法》（申请号：200910104100.8），但是该方法的田间转化率不高，只有9.6%。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速简便、转化率高且无抗性标记的柑橘的转基因方法。该方法包括无标记基因载体的构建，盆栽实生幼苗的准备，实生幼苗的顶端切除、农杆菌多次侵染，切口处形成愈伤和芽，再生苗的分子生物学鉴定，最终获得无标记转基因植株。构建无标记基因载体能够使转基因植株不带有抗生素基因，通过对伤口处进行农杆菌多次侵染提高转化效率来替代抗性标记筛选转基因植株。该方法无需准备试管砧木苗，不用专业的技术人员进行无菌操作。操作步骤简便、转化效率较高、转基因植株无抗性标记。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种简单快速的柑橘无标记转基因方法，包括以下步骤：
（1）无标记基因载体的构建：将二元载体pfgc5941的maspromoter和bar抗性筛选标记切除，将gus基因替代chsaintron，构建一个没有bar抗性筛选标记的载体，命名为35s-gus；
（2）土播实生幼苗的准备：将柑橘种子洗泡后播种于营养土中，然后放在温室中，浇水保湿促发芽；
（3）携带有35s-gus载体的农杆菌侵染液的准备：通过冻融法将35s-gus载体转化入农杆菌eha105感受态，将携带有35s-gus载体的农杆菌置于含有利福平和卡那霉素的lb培养基上培养，然后置于含有乙酰丁香酮的ms液体培养基中培养，得到携带有35s-gus载体的农杆菌侵染液；
（4）顶端切除、侵染：待步骤（2）中的柑橘种子播种后得到实生幼苗，切除实生幼苗上部的芽和叶，然后将携带有35s-gus载体的农杆菌侵染液灌入小吸头里面，将小吸头插在实生幼苗的伤口上，使携带有35s-gus载体的农杆菌充分地接触到伤口上；再将侵染过的实生幼苗转移到黑暗下共培养，共培养后弃去伤口上的小吸头，然后转到温室中正常培养，得无标记转基因柑橘植株。
优选的，步骤（2）所述柑橘种子不用剥皮、不用消毒，直接播种于营养土中。
优选的，步骤（2）所述柑橘种子选自7成熟以上的柑橘果子或购买的种子。
优选的，步骤（2）所述温室的温度为25-28℃。
优选的，步骤（4）所述实生幼苗是柑橘种子播种1个月后得到的。
优选的，步骤（4）所述播种后得到的实生幼苗长有2-4片嫩叶。
优选的，步骤（4）所述切除是在实生幼苗茎段5cm的地方切除上部的芽和叶。
优选的，步骤（4）所述黑暗下共培养的时间为12h。
优选的，步骤（4）所述温室的温度为25-28℃。
优选的，步骤（4）中，每周进行1次用携带有35s-gus载体的农杆菌的小吸头侵染实生幼苗的伤口，5-8周后产生愈伤或芽的时候停止。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明构建无标记基因载体能够使转基因植株不带有抗生素基因。
2、本发明在土播实生幼苗时，种子不用剥皮、不用消毒，直接播到营养土中，生长快、成本低、可周年进行。
3、本发明选生长约1月的实生幼苗为起始材料，这种苗带2-4片嫩叶，叶基部还未木质化，有利于转化。
4、本发明在转化过程中，用小吸头携带农杆菌直接插在伤口上的侵染方法操作简单，无需准备试管砧木苗，不用专业的技术人员进行无菌操作，可重复多次侵染，提高转化率。
5、本发明的柑橘转基因方法转化率可达到11.4%；且本发明没有由实验室转到田间的过程，不会由此产生转基因植株死亡的现象。由于在转化前已经将载体的抗性标记去除，不会出现嵌合体现象。
附图说明
图1为无标记基因载体的构建示意图。
图2为农杆菌侵染照片。
图3为5-8周后长出的愈伤和芽照片。
图4为3个月的再生苗照片。
图5a、图5b为pcr检测沙田柚再生苗结果图。
图6为gus染色鉴定结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不仅限于此
实施例1
1、无标记基因载体的构建
用kpni和ecori内切酶将二元载体pfgc5941的maspromoter和大部分的bar抗性筛选标记切除，通过asci和bamhi两个酶切位点将gus基因替代chsaintron，构建一个没有bar抗性筛选标记的载体，命名为35s-gus，过程如图1所示。
2、土播实生幼苗的准备
选7成熟以上的柑橘果子取种子，也可用购买来的种子，洗泡后直接播种于营养土中，与田间普通播种育苗基本相同。
所述营养土中，泥炭土与椰糠各50wt%，营养土装在10cm育苗盆，播种后再盖上1cm厚的营养土，然后放在温度25℃促发芽。
3、携带有35s-gus载体的农杆菌侵染液的准备
通过冻融法将35s-gus载体转化入农杆菌eha105感受态，将携带有35s-gus载体的农杆菌在含有50mg/lrif（利福平）、50mg/lkan（卡那霉素）的lb固体培养基上划线，28℃暗培养2天后挑取单克隆接种到1ml含有50mg/lrif、50mg/lkan的lb液体培养基中28℃、200rpm摇菌过夜，取0.1ml菌液加入到20ml含有50mg/lrif、50mg/lkan的lb液体培养基28℃、200rpm摇菌至od600值为1.0，然后在4000rpm下离心收集菌体，加入20ml含有100μmol/l乙酰丁香酮的ms液体培养基中，然后在28℃震荡培养2小时后得到用于侵染的携带有35s-gus载体的农杆菌侵染液。
4、顶端切除、侵染
播种后一个月，实生幼苗长有2-4片嫩叶时，在实生幼苗茎段5cm的地方，按45°切除上部的芽和叶，然后将准备好的携带有35s-gus载体的农杆菌侵染液灌入小吸头里面，将小吸头插在伤口上，使里面的农杆菌充分地接触到伤口（见图2）。将侵染过的实生幼苗转移到黑暗下共培养12h后，弃去伤口上的小吸头，转到25℃的温室中正常培养。用小吸头侵染的方式将每周进行一次，5-8周后产生愈伤或芽的时候停止（见图3）。
5、再生苗的分子生物学鉴定
当再生苗有2-3片时，可取部分叶提取dna，在gus基因和pfgc5941载体上设计特异引物（gusf：gaatggtgattaccgacgaaaacggc；5941r：cggcggtaaggatctgagctacacatgc；目标片段1541bp）进行pcr检测，结果如图5a、图5b所示；将检测有阳性条带的植株叶片用打孔器进行打孔，然后进行gus染色鉴定，结果如图6所示。3个月的再生苗照片如图4所示。共提取96株再生苗dna，pcr鉴定有目的带的有11株，转化效率为11.4%。
6、转基因植株扩繁、土播营养土回收处理
对验证确定获得的转基因植株进行嫁接扩繁。同时原土播营养土回收进行灭菌处理，以免质粒向环境释放。
本发明的转基因方法由于不需要通过抗生素筛选得到抗性芽，因此能够构建无抗性基因载体进行无标记遗传转化。该转基因方法操作快速简单，不需要无菌操作，能够通过农杆菌多次侵染伤口提高转化效率，可以在非转基因植株进行再次侵染，循环利用。