本发明涉及γ-l-谷氨酰正丙胺的制备领域，尤其涉及一种γ-l-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法。
背景技术：
γ-l-谷氨酰正丙胺是一种重要的γ-谷氨酰烷基胺，γ-谷氨酰烷基胺具有重要的生理活性。γ-l-谷氨酰正丙胺可用于医药领域，具有非常广泛的应用前景。
γ-谷氨酰转肽酶(ec2.3.2.2)作为一种重要的酶参与谷氨酰循环反应，它能特异性地催化谷氨酰基团的迁移过程，从而获得含有谷氨酰基团化合物。目前为止，利用γ-谷氨酰转肽酶催化合成γ-d-谷氨酰-l-色氨酸、谷胱甘肽、茶氨酸、γ-谷氨酰-牛磺酸等化合物的报道很多，但却尚未有利用该酶制备γ-l-谷氨酰正丙胺的报道。
据此，目前急需一种利用γ-谷氨酰转肽酶制备γ-l-谷氨酰正丙胺的方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种以γ-谷氨酰转肽酶为酶源的γ-l-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种γ-l-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将具有γ-谷氨酰转肽酶活性的菌株在培养基中培养发酵，发酵液离心后得到含γ-谷氨酰转肽酶的湿菌体；
(2)将上述湿菌体中加入转化液，并于35-50℃，ph6-11条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离后得到γ-l-谷氨酰正丙胺；其中，转换液具体包括l-谷氨酸-γ-甲酯、正丙胺，以及乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇中的一种。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，具有γ-谷氨酰转肽酶活性的菌株选自枯草芽孢杆菌cgmccno:1.1628、大肠杆菌atcc15489、施氏假单胞菌cgmccno:1.202以及铜绿假单胞菌cgmccno：1.1129中的一种。
作为本发明的优选方式之一，所述枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、施氏假单胞菌和铜绿假单胞菌均直接购自国内外市场。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，培养基成分包括：10-45g/l碳源物质、5-40g/l氮源物质、1.5g/l柠檬酸、2.0g/l硫酸铵、4.0g/lk2hpo4、2.0g/lmgso4、0.05g/lcacl2、0.001g/lcocl2和0.0002g/lmnc4h6o4·4h2o。
作为本发明的优选方式之一，所述碳源物质具体采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述氮源物质具体采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、豆饼水解液中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，l-谷氨酸-γ-甲酯的浓度为5-80g/l。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，正丙胺的浓度为10-120g/l。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇的的浓度为0.001g/l-5.0g/l。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，等电点结晶法分离得γ-l-谷氨酰正丙胺的具体方法如下：
(1)将酶促反应后的转化液于3000-5000r/min转速下离心10-20min，去除菌体细胞；
(2)加热转化液，采用活性碳脱色，抽滤，再将脱色液通过阳离子交换树脂柱吸附，用3％氨水洗脱，收集洗脱液，调至ph3-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得γ-l-谷氨酰正丙胺粗品；
(3)采用乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得γ-l-谷氨酰正丙胺精品。
作为本发明的优选方式之一，所述阳离子交换树脂柱具体为732型阳离子交换树脂柱。
本发明相比现有技术的优点在于：采用γ-谷氨酰转肽酶的特定菌株于特定培养基中培养，高效表达γ-谷氨酰转肽酶，使酶法合成γ-l-谷氨酰正丙胺有较高的催化速率和转化率；其中，l-谷氨酸-γ-甲酯摩尔转化率达到91％以上；酶法合成γ-l-谷氨酰正丙胺更是具有反应条件温和、酶立体选择性强、催化效率高、成本低、工艺流程简单等优点，适合工业化生产。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种γ-l-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将1000ml大肠杆菌atcc15489在培养基(10g/l葡萄糖、5g/l牛肉膏、1.5g/l柠檬酸、2.0g/l硫酸铵、4.0g/lk2hpo4、2.0g/lmgso4、0.05g/lcacl2、0.001g/lcocl2和0.0002g/lmnc4h6o4·4h2o)中培养发酵，发酵液离心得到12g湿菌体，加入到500ml转化液中(转化液中含40gl-谷氨酸-γ-甲酯、60g正丙胺和0.005g/l乙酸乙酯)，ph6.0，35℃酶促反应12h，反应结束后，l-谷氨酸-γ-甲酯摩尔转化率为91％；
(2)将转化液3000r/min离心10min，去除菌体细胞；加热，活性碳脱色，抽滤，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附，用3％氨水洗脱，收集洗脱液，调至ph3-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得37.5gγ-l-谷氨酰正丙胺粗品；质量浓度为95％的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得35.3gγ-l-谷氨酰正丙胺精品，纯度为99.9％。
实施例2
本实施例的一种γ-l-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将1000ml铜绿假单胞菌cgmccno：1.1129在培养基(45g/l麦芽糖、40g/l酵母膏、1.5g/l柠檬酸、2.0g/l硫酸铵、4.0g/lk2hpo4、2.0g/lmgso4、0.05g/lcacl2、0.001g/lcocl2和0.0002g/lmnc4h6o4·4h2o)中培养发酵，发酵液离心得到15g湿菌体，加入到500ml转化液中，转化液中含20g的l-谷氨酸-γ-甲酯、30g的正丙胺和0.01g/l的乙酸丁酯，ph11，50℃酶促反应12h，反应结束后，l-谷氨酸-γ-甲酯摩尔转化率为90％；
(2)将转化液5000r/min离心20min，去除菌体细胞，加热，活性碳脱色，抽滤，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附，用3％氨水洗脱，收集洗脱液，调至ph3-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得18.7gγ-l-谷氨酰正丙胺粗品；质量浓度为95％的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得16.8gγ-l-谷氨酰正丙胺精品，纯度为99.8％。
实施例3
本实施例的一种γ-l-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将1000ml施氏假单胞菌cgmccno:1.202在培养基(20g/l蔗糖、20g/l玉米浆、1.5g/l柠檬酸、2.0g/l硫酸铵、4.0g/lk2hpo4、2.0g/lmgso4、0.05g/lcacl2、0.001g/lcocl2和0.0002g/lmnc4h6o4·4h2o)中培养发酵，发酵液离心得到湿菌体20g，加入到500ml转化液中，转化液中含40g的l-谷氨酸-γ-甲酯、60g的正丙胺和0.02g/l的辛醇，ph7.0，40℃酶促反应12h，反应结束后，l-谷氨酸-γ-甲酯摩尔转化率为89％；
(2)将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，加热，活性碳脱色，抽滤，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附，用3％氨水洗脱，收集洗脱液，调至ph3-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得35.9gγ-l-谷氨酰正丙胺粗品；质量浓度为95％的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得33.6gγ-l-谷氨酰正丙胺精品，纯度为99.8％。
实施例4
本实施例的一种γ-l-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将1000ml枯草芽孢杆菌cgmccno:1.1628在培养基(25g/l果糖、22g/l蛋白胨、1.5g/l柠檬酸、2.0g/l硫酸铵、4.0g/lk2hpo4、2.0g/lmgso4、0.05g/lcacl2、0.001g/lcocl2和0.0002g/lmnc4h6o4·4h2o)中培养发酵，发酵液离心得到15g湿菌体，加入到500ml转化液中，转化液中含20g的l-谷氨酸-γ-甲酯、30g的正丙胺和0.01g/l的正己醇，ph8.0，45℃酶促反应12h，反应结束后，l-谷氨酸-γ-甲酯摩尔转化率为91％；
(2)将转化液4000r/min离心10min，去除菌体细胞，加热，活性碳脱色，抽滤，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附，用3％氨水洗脱，收集洗脱液，调至ph3-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得18.9gγ-l-谷氨酰正丙胺粗品；质量浓度为95％的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得17.1gγ-l-谷氨酰正丙胺精品，纯度为99.8％。
实施例5
本实施例的一种γ-l-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将1000ml大肠杆菌atcc15489在培养基(30g/l葡萄糖、30g/l豆饼水解液、1.5g/l柠檬酸、2.0g/l硫酸铵、4.0g/lk2hpo4、2.0g/lmgso4、0.05g/lcacl2、0.001g/lcocl2和0.0002g/lmnc4h6o4·4h2o)中培养发酵，发酵液离心得到12g湿菌体，加入到500ml转化液中，转化液中含40g的l-谷氨酸-γ-甲酯、60g的正丙胺和0.005g/l的乙酸丁酯，ph9.0，45℃酶促反应12h，反应结束后，l-谷氨酸-γ-甲酯摩尔转化率为91％；
(2)将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，加热，活性碳脱色，抽滤，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附，用3％氨水洗脱，收集洗脱液，调至ph3-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得37.6gγ-l-谷氨酰正丙胺粗品；质量浓度为95％的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得35.3gγ-l-谷氨酰正丙胺精品，纯度为99.9％。
实施例6
本实施例的一种γ-l-谷氨酰正丙胺的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将1000ml施氏假单胞菌cgmccno:1.202在培养基(40g/l麦芽糖、35g/l酵母膏、1.5g/l柠檬酸、2.0g/l硫酸铵、4.0g/lk2hpo4、2.0g/lmgso4、0.05g/lcacl2、0.001g/lcocl2和0.0002g/lmnc4h6o4·4h2o)中培养发酵，发酵液离心得到15g湿菌体，加入到500ml转化液中，转化液中含20g的l-谷氨酸-γ-甲酯、30g的正丙胺和0.01g/l的正己醇，ph10，45℃酶促反应12h，反应结束后，l-谷氨酸-γ-甲酯摩尔转化率为90％；
(2)将转化液4000r/min离心10min，去除菌体细胞，加热，活性碳脱色，抽滤，将脱色液通过732型阳离子交换树脂柱吸附，用3％氨水洗脱，收集洗脱液，调至ph3-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得18.1gγ-l-谷氨酰正丙胺粗品，质量浓度为95％的乙醇洗涤，真空抽滤，烘干得16.3gγ-l-谷氨酰正丙胺精品，纯度为99.8％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。