本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其是一种獭兔皮肤真皮毛乳头细胞分离培养方法。
背景技术：
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毛发附着在皮肤的外表面，不仅对动物和人具有防御和保护功能，还具有增加信息交流和美观的作用(messenger，1993)。毛发由毛囊生成，毛囊(hairfollicle)是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛发生长的皮肤附属器官，是由胚胎期神经外胚层与间充质相互作用，最终发育形成的由多层细胞组成的、具有合成多种特异角质蛋白功能的复杂的动态器官，具有独特的结构和周期性再生(即经历生长期、衰退期和休止期的周期性循环)的特性。毛囊在形成与分化过程中，至少涉及到20种不同的细胞群，主要有毛乳头、毛母质、内根鞘、外根鞘等细胞组成。
由于毛囊具有周期性生长的特性，为组织再生提供了良好的模型。毛囊的周期性生长由毛囊干细胞介导发生，毛囊干细胞的静息与活化受到干细胞微环境的调控(paus等，2004)。毛囊干细胞位于毛囊隆突区，但目前人们对影响毛囊干细胞自我更新和分化的微环境了解并不多、更不彻底。其中，由休止期向生长期的转化，也就是生长期的启动是毛囊生长最关键的环节。当毛囊的周期性再生功能发生障碍时，就会出现脱发、斑秃等毛囊疾病。jahoda等2011报道，将毛乳头细胞制成微囊植入大鼠耳部皮下，能够诱导耳毛囊再生，并有将人的毛乳头细胞条件培养液用于临床斑秃的治疗。随着社会的发展，人们对具有保护与美观作用的毛发越来越重视，对毛囊周期性再生的研究越来越重要。
毛乳头(dermalpapilla)是毛囊真皮成分中最重要的部分，在毛囊中控制着毛囊发育、生长和重建，并在一定程度上决定了毛囊的大小。毛乳头细胞是真皮中的一群特异化的间充质来源的细胞，在毛囊周期变化过程中发挥关键作用，是整个毛囊中直接参与毛囊生长周期调控的关键组分。大量研究表明，在动物毛囊周期生长中，毛乳头细胞与毛囊干细胞发生定期规律性的信号交流，在毛囊周期启动中最为密切(millar，2002；aoi等，2012；hill等，2013)，说明毛乳头细胞可为毛囊干细胞提供微环境支持，并在毛囊周期性再生的起始阶段发挥作用。毛乳头是一个分泌因子的中心，可以生成大量的信号因子，通过激活或抑制毛囊周期性生长信号通路发挥调节作用(peus等，1996；roh等，2004；dipo等，2005)。
然而，由于毛乳头位于毛囊的基底部，体积小、又被毛囊包裹，因此分离困难。目前，在毛乳头的分离过程中最常用的方法主要是显微解剖法，此方法对仪器设备及无菌环境要求较高，需要操作者拥有较熟练的显微分离技术，工作强度大，耗时较长，同时获得的毛乳头细胞贴壁率较低，毛乳头细胞迁出困难。此外，显微解剖分离法可以分离触须毛囊、小鼠皮肤毛囊、山羊皮肤毛囊等较大的毛囊，而对于像獭兔皮肤毛囊数量多，个体小的毛囊毛乳头的分离并不适用，分离困难；另外机械分离造成毛乳头细胞损伤，细胞贴壁率低，培养獭兔真皮毛乳头细胞成功率不高。因此，获取獭兔皮肤毛囊毛乳头细胞不仅成为研究獭兔毛囊周期性生长变化、影响因素及调控机制的关键素材，为提高獭兔皮张质量的育种改良奠定基础，也还可以为医学领域的人类毛发再生研究提供模型。
技术实现要素：
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本发明提供了一种獭兔皮肤真皮毛乳头细胞分离培养方法，相比于现有技术，分离培养方法科学、合理，培养獭兔皮肤真皮毛乳头细胞成功率高且分离过程中无细胞机械损伤，贴壁率可达95-100％，成功培养率高达99％。采用该分离培养方法获得的獭兔皮肤真皮毛乳头细胞能够建立与完善适用于皮肤毛囊数量多的动物真皮毛乳头细胞的分离培养，不仅可以为阐明獭兔毛囊生长发育规律、影响因素及调控机制提供研究模型材料，为提高獭兔皮张质量的育种改良奠定基础，而且可以为医学领域的人类毛发再生研究提供素材，解决了现有技术中存在的问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：
一种獭兔皮肤真皮毛乳头细胞分离培养方法，包括如下操作步骤:
(1)取獭兔背部皮肤，剪成长条，置于ⅱ型分离酶溶液中，于4℃过夜消化，次日于37℃培养箱中消化后，去除表皮；
(2)将经步骤(1)去除表皮处理后剩余的皮肤真皮部分剪碎成泥，置于d型胶原酶中消化4-6h，至消化皮肤呈液态并在显微镜下观察有毛乳头游离出，用含胎牛血清的dmem终止消化；
(3)将经步骤(2)处理后的液态皮肤离心，收集细胞，弃去上清液，细胞培养基重悬，即得。
步骤(2)所述消化温度为37℃，消化时间为4-6h。
2000r/min离心4-6min，重复2次；500r/min离心2-4min，重复4次；2000r/min离心3-7min，重复2次；500r/min离心2-4min，重复4次。
步骤(3)所述离心的具体操作步骤依次为：2000r/min离心5min，重复2次；500r/min离心3min，重复4次；2000r/min离心5min，重复2次；500r/min离心3min，重复4次。
步骤(1)所述獭兔背部皮肤为25-35日龄獭兔背部皮肤。
本发明的有益效果：
(1)本发明分离培养方法利用ⅱ型分离酶和d型胶原酶相结合的方案，成功启动了獭兔皮肤真皮毛乳头细胞的原代培养，且大大提高了分离效率。现针对獭兔皮肤真皮毛乳头细胞的培养，尚未有采用上述酶结合进行其真皮毛乳头细胞培养的报道，且现有用于分离真皮毛乳头细胞的分离效率低，步骤繁琐，操作不便。
(2)本发明分离培养方法构建的獭兔皮肤真皮毛乳头细胞系能稳定传代，且生长分裂状态良好。
(3)本发明分离培养方法构建的獭兔皮肤真皮毛乳头细胞，在鉴定时毛乳头特异表达物α-sma表达呈阳性。
此外，经过形态学观察、生长曲线绘制及细胞免疫化学鉴定，结果显示表明，本发明分离培养方法获得的细胞为獭兔皮肤真皮源性毛乳头细胞，可为研究獭兔毛囊生长与分化的机制，尤其是在研究毛囊中各类细胞相互作用机制提供良好的实用模型。
附图说明：
图1为本发明培养的獭兔皮肤真皮毛乳头细胞(100x)；
图2为本发明培养的獭兔皮肤真皮毛乳头细胞giemsa染色(100x)；
图3为本发明培养的獭兔皮肤真皮毛乳头细胞特异标记物α-sma的表达；
图4为本发明培养的獭兔皮肤真皮毛乳头细胞特异标记物vimentin的表达；
图5为本发明培养的獭兔皮肤真皮毛乳头细胞生长曲线；
图6为本发明培养的獭兔皮肤真皮毛乳头细胞冻存后复苏生长情况。
其中：
图1包括图1a、图1b、图1c、图1d、图1e、图1f，
图1a为培养3-4天游离出来的毛乳头细胞，为三角形或短梭形；
图1b为培养第7天进入对数生长期细胞，形成成片的细胞；
图1c为培养9-10天时，细胞融合率达到80％以上，并开始出现死细胞；
图1d为培养14天的细胞完全融合，形成生长致密区。
图1e为传代后24h细胞，生长加速；
图1f为传代培养5-6天，细胞完全融合，形成生长致密区，漩涡样生长；
图3包括图3a、图3b、图3c和图3d，
图3a为α-sma免疫组化(100x)阳性结果；
图3b为α-sma免疫组化(100x)阴性对照；
图3c为α-sma免疫荧光(200x)阳性结果；
图3d为α-sma免疫荧光(200x)阴性对照；
图4包括图4a、图4b、图4c和图4d，
图4a为vimentin免疫组化(100x)阳性结果；
图4b为vimentin免疫组化(100x)阴性对照；
图4c为vimentin免疫荧光(200x)阳性结果；
图4d为vimentin免疫荧光(200x)阴性对照；
图6包括图6a和图6b，
图6a为解冻后培养24h的细胞，细胞形态均一，细胞生长迅速；
图6b为复苏培养大约5-6天细胞，融合度可达90％，细胞形态与冻存前基本一致，漩涡样生长。
具体实施方式：
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本发明进行详细阐述。
(一)材料与方法
1.主要试剂
dmem(dulbecco’smodifiedeaglemedium)basic(1x)培养基为gibco公司产品；胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)为gibco公司产品；ii型分离酶(dispaseii)和d型胶原酶(collagenased)为sigma公司产品；vimentin(vim)antibody，αsmoothmuscleactin(a-sma)antibodysa1021—小鼠iggsabc免疫组化染色试剂盒，sa1062--小鼠iggsabc－fitc免疫荧光染色试剂盒，dab显色液为武汉博士德产品；1×pbs缓冲液，青链霉素混合液(100×)，胰蛋白酶－edta消化液(0.25％)，姬姆萨染色液(giemsastain)，dapi溶液(1mg/ml),tritonx-100为索莱宝产品；6孔一次性细胞培养板，无菌细胞培养皿为杰特产品；
2.实验动物及样品采集
30日龄獭兔购自泰山区泰山种兔场，带至实验室，剪毛剪剪去背部兔毛，将皮肤组织先用碘酊消毒，酒精脱碘消毒，用无菌剪刀剪取皮肤，放置含青链霉素的pbs中；
3.溶液的配制
(1)0.25mg/mldispaseii溶液的配制：准确称取0.25gdispaseii酶粉末，加入100ml0.01mpbs中，完全溶解后分装，4℃保存；
(2)0.1mg/mlcollagenased溶液的配制:准确称取0.1gcollagenased酶粉末，加入100ml0.01mpbs中，完全溶解后分装，-20℃保存；
(3)细胞培养基的配制：dmem培养基中加入10％胎牛血清，青霉霉素混合液(100x)1％；
(4)细胞冻存液的配制：含10％dmso，30％胎牛血清的dmem。
(二)实施方案
本发明獭兔皮肤真皮毛乳头细胞分离培养方法，包括如下步骤：
1、取30日龄健康獭兔1只，颈椎脱臼处死后，背部皮肤剪毛，酒精棉消毒，灭菌剪刀剪取皮肤，放入加有双抗的pbs50ml离心管中，带至细胞间无菌超净工作台中，用镊子夹住皮肤，无菌pbs反复冲洗；
2、用眼科剪刀将皮肤剪成2cmx5cm长条，置于0.25mg/mldispaseii溶液中，于4℃过夜消化12-15h，次日于37℃培养箱中消化30min后pbs冲洗，揭去表皮；
3、将揭去表皮剩余真皮部分剪碎成泥，置于0.1mg/mlcollagenased溶液中37℃消化5h，观察呈液态，显微镜下见大量dp游离出来，用含10％(体积)胎牛血清的dmem终止消化；
4、差速离心收集细胞，具体操作为：2000r/min离心5min，重复2次，弃上清，收集毛乳头毛发纤维组织以及其他细胞成分的混合物；将收集的毛乳头毛发纤维组织以及其他细胞成分的混合物继续500r/min离心3min，重复4次，弃上清，去除混杂的其他散在细胞；继续2000r/min离心5min，重复2次；500r/min离心3min，重复4次；每次离心完弃上清用含含10％血清dmem培养基重悬，0.75um滤器过滤即得到较纯的dp；
5、滤液铺于六孔一次性细胞培养板，37℃，5％co2饱和湿度培养箱培养。每5天换液一次。
对照例1利用显微镜分离方法分离獭兔皮肤真皮毛乳头细胞
獭兔皮肤真皮毛乳头细胞分离培养方法，包括如下操作步骤：
1、取30日龄健康獭兔1只，颈椎脱臼处死后，背部皮肤剪毛，酒精棉消毒，灭菌剪刀剪取皮肤，放入加有双抗的pbs50ml离心管中，带至细胞间无菌超净工作台中，用镊子夹住皮肤，无菌pbs反复冲洗；
2、用无菌剪刀在超净台中沿真皮皮下组织交界处剪开，弃去表皮；无菌镊子轻压含有毛囊中下部的皮下脂肪部分挤出毛囊切缘尖端，然后用另一把镊子夹持切缘尖端将毛囊中下部从皮下脂肪中完整拔出；拔出的毛囊置于培养皿中，内盛无菌pbs；
3、显微镜下，在毛囊近毛球上方用镊子夹持，由于上皮部和真皮部连接比较紧密，较疏散的毛母质细胞及黑色素细胞等只能向毛球部游走聚集，这使得毛球部形成一内部富含压力的球形。此时用1ml注射器针头将毛球近毛乳头根茎部的真皮鞘切开，由于压力的释放将毛乳头完整释放出来；最后，用1ml注射器针头将毛乳头根茎部完全切断，并用巴氏吸管捡拾游离的毛乳头；
4、接种含10％胎牛血清，1％青霉霉素混合液(100x)的dmem培养液的六孔一次性细胞培养板，37℃，5％co2饱和湿度培养箱培养,每5天换液一次。
对照例2：利用d型胶原酶分离方法分离獭兔皮肤真皮乳头细胞
獭兔皮肤真皮毛乳头细胞分离培养方法，包括如下操作步骤：
1、取30日龄健康獭兔1只，颈椎脱臼处死后，背部皮肤剪毛，酒精棉消毒，灭菌剪刀剪取皮肤，放入加有双抗的pbs50ml离心管中，带至细胞间无菌超净工作台中，用镊子夹住皮肤，无菌pbs反复冲洗；
2、用无菌剪刀在超净台中将獭兔皮肤剪碎成泥，放于0.1mg/mlcollagenased溶液中37℃消化5个小时，观察呈液态，显微镜下见大量dp游离出来，用含胎牛血清的dmem终止消化；
3、差速离心收集细胞，具体操作为：2000r/min离心5min，重复2次，弃上清，收集毛乳头毛发纤维组织以及其他细胞成分的混合物；500r/min离心3min，重复4次，弃上清，去除混杂的其他散在细胞；2000r/min离心5min，重复2次；500r/min离心3min，重复4次；每次用含血清dmem培养基重悬，0.75um滤器过滤；
4、滤液铺于六孔一次性细胞培养板，37℃，5％co2饱和湿度培养箱培养。每5天换液一次。
(三)鉴定方法
1、形态学观察
显微镜普通光下观察分离培养的獭兔皮肤真皮毛乳头细胞贴壁及生长情况及细胞形态。当毛乳头细胞生长完全汇合后，进行传代培养。首先弃掉旧培养基，无菌pbs冲洗，每孔加入1ml0.25％的胰蛋白酶－edta消化液，常温下消化4min，显微镜下观察到细胞单层收缩突起出现空隙时，加入2ml含10％胎牛血清的细胞培养液终止消化，吹打，1000r/min离心收集细胞，按104个/孔铺板。
2、giemsa染色
将无菌的细胞爬片放入一次性6孔细胞培养板中，取2ml细胞悬液加入六孔板中，置于co2培养箱中培养；待细胞长成良好的单层细胞后，弃去培养基，pbs冲洗后加入无水甲醇固定15min，用镊子取出爬片，再用新的无水甲醇冲洗细胞，随即放入姬姆萨染色液中染色5-10min，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片，显微镜下观察拍照。
3、免疫组化鉴定
将无菌的细胞爬片放入一次性6孔细胞培养板中，取2ml细胞悬液加入六孔板中，置于co2培养箱中培养；待细胞长成良好的单层细胞后，用4％的多聚甲醛固定30min，pbs冲洗3次，每次3min，按照sa1021—小鼠iggsabc免疫组化染色试剂盒说明书步骤进行vimentin和a-sma蛋白表达的检测。
4、免疫荧光鉴定
将无菌的细胞爬片放入一次性6孔细胞培养板中，取2ml细胞悬液加入六孔板中，置于co2培养箱中培养；待细胞长成良好的单层细胞后，用4％的多聚甲醛固定30min，pbs冲洗3次，每次3min，按照sa1062-小鼠iggsabc－fitc免疫荧光染色试剂盒说明书步骤进行vimentin和a-sma蛋白表达的检测。
5、生长曲线绘制
取生长状况良好的细胞以104个/孔铺板，每天取3孔，连续统计14天，细胞计数板统计每天细胞密度；以培养时间为横坐标，以细胞密度为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
6、细胞冻存与复苏
选择对数期生长的细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入细胞冻存液(含10％dmso，20％胎牛血清的dmem培养液)，以106/ml细胞密度，分装于2ml的冻存管中，封口膜封口，标记好细胞名称和日期等。将冻存管依次置于4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，最后移入液氮中长期保存。
复苏细胞时，从液氮中取出冻存管，迅速投入40℃水浴中使其融化，5min内用预热的培养基稀释至原体积的10倍以上。低速离心10min，去上清加入新鲜培养基进行培养。
(四)鉴定结果与分析
1)分离培养方法效果比较
表1
从表1可以看出，利用本发明所提供的ii型分离酶与d型胶原酶结合的方法，可以获得1.0*108个毛乳头，可达千万个，而显微镜分离方法仅1万个，单一胶原酶d分离优于显微镜分离方法，但分离效率不如ii型分离酶与d型胶原酶结合的方法。另外，利用本发明所提供的方法分离的毛乳头贴壁率可达95-100％，培养成功率也高于其他两种方法。由此可见，本发明方法在获得的细胞数量，贴壁率及培养成功率等方面均明显优于现有方法。
此外，与现有报道的分离酶和胶原酶结合
2)形态学观察
本发明分离获得的毛乳头呈圆形、椭圆形，做悬浮培养，约8h后开始贴壁，培养24h多数毛乳头即可牢固贴壁，3-4天便可见有细胞从毛乳头边缘长出，并向四周放射性生长，迁出细胞为三角形或短梭形(图1a)。在第7天左右时，细胞进入对数生长期，胞浆丰富,生长迅速，向四周呈放射状生长，此时毛乳头逐渐失去其原来的形状，形成成片的细胞(图1b)。在9-10天左右时，细胞生长范围不再扩大，融合率达到80％以上，并开始出现死细胞(图1c)，约14天后细胞完全融合，形成生长致密区，融合后的细胞大致呈放射状排列，可进行第一次传代(图1d)。经过首次传代，12h细胞即可贴壁，24h细胞形态较原代细胞均一，细胞生长加速(图1e)，在培养5-6天，细胞完全融合，形成生长致密区，细胞以长梭形纤维样多极向排列，漩涡样生长，可进行再一次传代(图1f)。
3)giemsa染色
本发明分离培养的细胞培养形成良好单层的细胞爬片经giemsa染色后，可见细胞质呈淡蓝色，胞体近中央处可见具有1-2个核仁的细胞核，呈紫红色(图2)。
4)特异标记物表达
应用免疫细胞化学染色技术检测体外培养的毛乳头细胞的特异性标记物α-sma及毛囊真皮源性细胞标记物vimentin表达情况。α-sma免疫组化结果显示，与图3b为阴性对照相比，图3a中可明显观察到α-sma的表达；同时，免疫荧光结果也显示，与阴性对照图3d比，图3c细胞质发出绿色荧光，即分离培养的细胞表达α-sma蛋白。同样，vimentin的免疫组化图4a及免疫荧光图4c显示，分离培养该细胞表达vimentin。上述结果表明，本发明分离培养的毛乳头细胞确为毛囊真皮源性的毛乳头细胞。
5)生长曲线绘制
对本发明分离培养的细胞进行细胞生长曲线观察，细胞贴壁后的前3天，生长缓慢，数量无明显变化；4-10天进入对数生长期，第12天达到增殖高峰，12天后进入衰退期，表明分离的毛乳头细胞生长及分裂能力旺盛(图5)。
6)细胞冻存与复苏能力
对冻存3个月的本发明分离培养的对数期毛乳头细胞复苏后，台盼蓝染色计数统计发现，毛乳头细胞平均活率74.5％。解冻后的细胞经培养发现细胞贴壁依然迅速,12h细胞即可贴壁，24h细胞形态均一，细胞生长加速(图6a)；细胞培养皿中培养大约5-6天左右细胞汇合度可达90％，细胞形态与冻存前基本一致，细胞长满后继续培养发现，毛乳头细胞以长梭形纤维样多极向排列，漩涡样生长，细胞均又出现成层性生长，依然保留其所特有的凝集性生长特性(图6b)。
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。