本发明涉及蛋白分离提纯技术领域，具体涉及一种反胶束萃取—脉冲电场联合分离提纯蛋白的方法。
背景技术：
随着基因工程和细胞工程的发展，传统的溶剂萃取技术在抗生素等物质的生产中应用广泛，并显示出优良的分离性能，但难以应用于蛋白质的提取分离。一是大多数蛋白质不溶于有机溶剂，且接触有机溶剂后容易变形，二是蛋白质分子表面带的电荷多，普通离子缔合型萃取剂很难凑效。近年来，随着反胶束萃取技术的发展，为蛋白质分离提取技术提供了一个有较好开发前景的新工艺。
反胶束是表面活性剂在非极性溶剂中形成的球形、椭圆形或棒形的纳米尺度聚集体(10-100nm)，形成水-表面活性剂-有机溶剂三相体系，是热力学稳定和透明体系，能够增溶水和亲水分子，在分离生物物质方面具有萃取条件温和，生产成本低，可规模化放大等特点。
例如，公开号为cn102599326a的中国发明专利申请文献公开了一种大豆蛋白的萃取方法，特别是涉及一种反胶束萃取制备大豆蛋白的后萃方法，包括如下步骤：大豆粉碎，过80～120目筛、反胶束溶液的配制、反胶束前萃蛋白、在萃取压力为8-15mpa，萃取温度为40-50℃，二氧化碳流量为30-40l/h，萃取时间为1-2h下超临界后萃蛋白、蛋白的精制。
公开号为cn101343309a的中国发明专利申请文献公开了一种利用反胶束萃取技术同时分离大豆蛋白和油脂的方法,包括以下步骤:(1)配置反胶束溶液；(2)将预处理过的大豆原料添加到反胶束溶液中,实现同时萃取其中的蛋白和油脂；(3)加入电解质溶液,使蛋白质从反胶束转移到水相中从而分离出蛋白质,实现蛋白的反萃取,得到蛋白水溶液和混合油；(4)然后再进行处理得到蛋白产品和油脂产品。
目前该技术只能由于萃取一些小分子蛋白，如酶类、细胞色素c、牛血清蛋白(bsa)等，但对大分子蛋白的萃取能力还十分有限。主要的原因是混合反胶束体系虽然能够形成大的水池来容纳大分子蛋白，但是大蛋白分子进入胶束困难，缺少进入胶束内部的推动力。尤其是分离子型的表面活性剂在萃取时蛋白质的驱动力更小。
技术实现要素：
本发明提供了一种反胶束萃取—脉冲电场联合分离提纯蛋白的方法，能够提高蛋白的提取得率，缩短提取的时间，并且产品的品质也明显优于传统的提取方法。
一种反胶束萃取—脉冲电场联合分离提纯蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将目标蛋白原料加入反胶束溶液中，混合均匀后转移至脉冲电场提取腔中，脉冲电场提取腔置于冷却槽中，进行脉冲电场联合联合反胶束萃取；
(2)将步骤(1)处理后的脉冲电场提取腔中溶液进行固液分离，取上清液即得目标蛋白的前萃取液；
(3)对所得前萃取液进行反萃取，得含目标蛋白的后萃取液；
(4)所得后萃取液浓缩干燥后即得目标蛋白。
反胶束的形成原理：将表面活性剂溶于非极性有机溶剂中，并使其浓度超过超临界胶束浓度(cmc)，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体就是反胶束。在反胶束中，表面活性剂的非极性集团在外与非极性有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核，此极性核形成了一个能够溶解蛋白的“水池”。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质水溶液接触后，蛋白质与其他亲水性物质进入该“水池”。由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，保持了待提取蛋白质的活性。
反胶束法对提纯大分子蛋白具有一定的优势，但是由于蛋白分子扩散进胶束内部的推动力不足，本发明通过施加脉冲电场，从而为溶液中带电离子(胶束和蛋白质)提供一定的动能，促进了胶束和蛋白分子的碰撞，从而促使蛋白分子更容易进入到胶束的内部，实现了传质过程的强化。
脉冲电场的核心作用是增强带电颗粒间的作用力，强化作用过程，形成较大的反胶束。增强蛋白质与反胶束间碰撞的机会，脉冲电场联合反胶束法提取蛋白的优势在于，能够提高蛋白的提取得率，缩短提取的时间，并且产品的品质也明显优于传统的提取方法。
本发明中的反胶束萃取使用脉冲电场的作用跟脉冲电场辅助提取方法中脉冲电场的作用不同。脉冲电场辅助提取时，脉冲电场是使组织细胞发生穿孔，从而加速目标物质从组织细胞中溶出，减少高温或者高压的处理过程，提高提取效率和增强目标产物的活性。然而，本发明的反胶束萃取过程，使用脉冲电场的目的是：蛋白分子本身带有一定电荷，在脉冲电场作用下会因为电场力的作用而产生运动，促进了胶束和目标蛋白的碰撞，将目标蛋白分子挤入到亲水性物质的“水池”中，大大提高了过程的传质效率。与单纯使用反胶束萃取的方法相比，目标蛋白分子进入“水池”的速率和效率大大加强。
此外，反胶束萃取使用脉冲电场跟反胶束萃取使用超声波的作用也不同，反胶束萃取使用超声波，超声波的空化作用在溶液中形成气泡，气泡的增长和破裂压缩过程形成了具有湍流特征的水力学激流，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，从而提高了传质速率。反胶束萃取使用超声萃取的劣势是，空化作用会对目标蛋白产生极强的剪切作用，导致目标蛋白结构上改变而发生破坏。而反胶束萃取采用脉冲电场时，只要控制好脉冲电场的强度和脉冲的宽度，就可以避免蛋白发生破坏。优选地，所述目标蛋白原料为菜籽粕、大豆粉或含有藻蓝蛋白的浓缩液。
菜籽粕的预处理方法为：将菜籽粕放在通风处晾干，然后用粉碎机粉碎，过100目筛。
大豆粉的制备方法为：大豆经除杂、去皮，破碎，软化、轧胚后制得大豆粉，过80目筛。
含有藻蓝蛋白的浓缩液的制备方法为：将钝顶螺旋藻加水浸泡5小时后，在-20℃条件下冷冻2-3小时后再于20-25℃下融化，如此反复冻融3-4次实现对钝顶螺旋藻破壁处理。再将所得溶液离心处理，收集上清液即为含有藻蓝蛋白的粗提液，然后利用旋转蒸发器对粗提液进行浓缩即得。
优选地，所述反胶束溶液为十二氨基磺酸钠/异辛烷反胶束体系、十六烷基三甲基溴化铵/正辛醇反胶束体系或丁二酸二异辛酯磺酸钠/异辛烷反胶束体系。
十二氨基磺酸钠/异辛烷反胶束体系的配制方法为：称取8g十二氨基磺酸钠(sds)，置于500ml锥形瓶中，加入100ml异辛烷，搅拌溶液使溶质完全溶解。放置10分钟后，加入0.08mol/l氯化钾缓冲溶液。震荡摇匀，然后将溶液放置于振荡器中震荡15分钟。
十六烷基三甲基溴化铵/正辛醇反胶束体系的配制方法为：称取10g十六烷基三甲基溴化铵置于250ml锥形瓶中，然后加入100ml体积比为4:1的异辛烷/正丁醇溶液，再加入浓度为0.1mol/l氯化钾的kh2po4-k2hpo4缓冲溶液，用玻璃棒适当搅拌后放在振荡器上震荡溶解，形成透明的反胶束体系。
丁二酸二异辛酯磺酸钠/异辛烷反胶束体系的配制方法为：称取10g丁二酸二异辛酯磺酸钠表面活性剂置于250ml锥形瓶中，然后加入100ml异辛烷溶液，再加入浓度为0.08mol/l氯化钾的kh2po4-k2hpo4缓冲溶液，用玻璃棒适当搅拌后放在振荡器上震荡溶解，形成透明的反胶束体系。
优选地，反胶束溶液中目标蛋白原料的加入量为0.01g/ml～0.05g/ml。
优选地，脉冲电场联合联合反胶束萃取的条件为：调节高低压电极间距为3～5mm，接通双极性脉冲电源，脉冲宽度200ns-2μsns，电场强度5-30kkv/cm，脉冲频率10-500hz，处理时间为4～6分钟。
进一步优选地，脉冲电场联合联合反胶束萃取的条件为：调节高低压电极间距为3～5mm，接通双极性脉冲电源，脉冲宽度400～600ns，电场强度5～10kv/cm，脉冲频率80～120hz，处理时间为4～6分钟。
最优选地，脉冲电场联合联合反胶束萃取的条件为：调节高低压电极间距为4mm，接通双极性脉冲电源，脉冲宽度500ns，电场强度8～10kv/cm，脉冲频率100hz，处理时间为5分钟。
在反萃取阶段，也可以利用脉冲电场对过程进行强化。优选地，步骤(3)反萃取在脉冲电场中进行，脉冲条件为：电场强度4～6kv/cm，脉冲宽度450～550ns，脉冲频率80～120hz，处理时间6～10分钟。
进一步优选地，步骤(3)反萃取在脉冲电场中进行，脉冲条件为：电场强度5kv/cm，脉冲宽度500ns，脉冲频率100hz，处理时间8分钟。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
目前还没有脉冲电场来辅助反胶束萃取的相关技术说明，反胶束萃取技术为蛋白的分离提供了一条新路径，具有成本低，溶剂可以反复使用，萃取率和反萃取率都很高的特点，但是反胶束萃取对大分子蛋白的萃取效率有限，大分子蛋白缺少进入胶束的推动力，传质效率低。而脉冲电场能够为大分子蛋白提供一定的动能，提供了大分子蛋白进入胶束的推动力，因而传质效率提高。与超声波辅助反胶束提取相比，脉冲电场辅助提取能够避免空化效应对蛋白分子的剪切破坏，从而保护了蛋白和酶的活性。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，本发明的保护范围不受实施例的限制，本发明的保护范围由权利要求书决定。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1：脉冲电场辅助反胶束法从菜籽粕中提取菜籽蛋白
菜籽粕是菜籽榨油过程中产生的一种副产物，含有35％-45％优质的植物蛋白。从菜籽粕中提取的菜籽蛋白液可广泛应用于食品添加剂、功能是食品及其它相关领域，应用前景广阔。目前提取的方法主要有水相法、水相酶解法、丙酮提取法、双液相提取法、超滤和渗滤法等。这些传统的方法均在提取时间长，提取效率低或者有机溶剂使用量大等问题。利用脉冲电场辅助反胶束法被证明可以从菜籽粕中提取菜籽蛋白，主要的工艺流程如下：
(1)菜籽粕预处理。将菜籽粕放在通风处晾干，然后用粉碎机粉碎，过100目筛。
(2)反束胶溶液的配制。称取8g十二氨基磺酸钠(sds)，置于500ml锥形瓶中，加入100ml异辛烷，搅拌溶液使溶质完全溶解。放置10分钟后，加入0.08mol/l氯化钾缓冲溶液。震荡摇匀，然后将溶液放置于振荡器中震荡15分钟。
(3)脉冲电场联合反胶束法提取菜籽蛋白。取2g菜籽粕粉，加入到上述反束胶溶液中。用玻璃棒搅拌后摇匀，放在振荡器上震荡10分钟。然后将浊液转移至脉冲电场提取腔中。脉冲电场提取腔为一平板电极，高低压电极间距为4mm。接通双极性脉冲电源，电压8kv，脉冲宽度500ns，脉冲频率100hz，处理时间为5分钟。
(4)固液分离。将脉冲电场提取腔中的溶液转移至离心管中，以4000r/min进行离心10分钟，取含有菜籽蛋白的上清液，即目标蛋白的前萃取液。
(5)从前萃取液中反萃取出菜籽蛋白。量取60ml前萃取液在旋转蒸器上蒸发，回收得到异辛烷。然后加入1.2mol/l氯化钾缓冲溶液30ml，并调节溶液的ph值至9.8，用玻璃棒搅拌后放在振荡器上震荡5-10分钟，使固形物完全溶解。然后加入体积浓度为15％的乙醇5ml，然后将溶液放置恒温震荡器中振荡35分钟。再将溶液转移至离心管中，在3000r/min的转速下离心10分钟，下层清液为含有目标蛋白的后萃取液。
(6)菜籽蛋白的浓缩干燥。取下层含有目标蛋白的后萃取液，经浓缩、渗析后进行冷冻干燥，即制得菜籽蛋白成品。称重发现，菜籽蛋白的总提取率为75.2％。提纯总耗时约2h(步骤二至步骤五，不含前处理和浓缩干燥的时间)。
利用传统的碱溶酸沉法从菜籽粕中提取一定量的菜籽蛋白，经工艺优化后得到菜籽蛋白的提取率为50.2％，提取总时间约为4.2h(同样不含前处理和浓缩干燥的时间)。由此可见，脉冲电场辅助反胶束能够大幅度缩减提纯时间，并且蛋白的提取率也明显提高。通过测定两种方法制备得到蛋白的理化和功能性质，发现：脉冲电场辅助反束胶法制备的菜籽蛋白在蛋白含水量和灰分含量比较低，其溶解性、起泡性及乳化性都优于碱溶酸沉法得到的蛋白。说明脉冲辅助反束胶法制备的大豆蛋白的性能要优于碱溶酸沉法。
实施例2脉冲电场辅助反胶束法从大豆原料中提取大豆蛋白
大豆中植物蛋白质含量丰富，可达40％左右，且营养价值高，接近于完全蛋白质，是植物蛋白质的重要原料。目前大豆蛋白的工业萃取方法主要为传统的碱溶酸沉法，该方法在生产过程中引入大量的酸和碱，不仅生产成本高，易引起一系列的环境污染问题，而且酸碱的使用会导致蛋白质折构型的变化。目前也出现了一些新工艺，如利用反胶束提取大豆蛋白，但在提取时间和效率有待进一步的提升。本发明利用脉冲电场辅助反胶束的方法，证实可以用该方法实现快速高效地从大豆中提取大豆蛋白。
本实施例的脉冲电场联合反胶束提取大豆蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)大豆粉制备。大豆经除杂、去皮，破碎，软化、轧胚后制得大豆粉，过80目筛。
(2)反胶束溶液的配制。采用十六烷基三甲基溴化铵/正辛醇反胶束体系。称取10g十六烷基三甲基溴化铵置于250ml锥形瓶中，然后加入100ml体积比为4:1的异辛烷/正丁醇溶液，再加入浓度为0.1mol/l氯化钾的kh2po4-k2hpo4缓冲溶液，用玻璃棒适当搅拌后放在振荡器上震荡溶解，形成透明的反胶束体系。
(3)脉冲电场联合反胶束萃取大豆中的蛋白。将1.5g的大豆粉加入到盛有上述反胶束溶液的锥形瓶中，用玻璃板适当搅拌后放在振荡器上震荡均匀，然后将溶液转移到脉冲电场提取腔中，脉冲电场提取腔放在冷却槽中。采用双极性脉冲电源，脉冲宽度200ns,电场强度10kv/cm，放电频率300hz，处理时间4分钟，再放置10分钟，
(4)固液分离。将脉冲电场提取腔中的溶液转移至离心管中，然后以4000r/min的速率对提取液进行离心分离10分钟。萃取液分为两层，上层为含有大豆蛋白分子的十六烷基三甲基溴化铵层，下层为残渣。除去残渣，保留上层清液。
(5)反萃取。反萃取的过程也可引入脉冲电场进行过程强化。量取50ml前萃取液，然后加入氯化钾缓冲溶液，使氯化钾的摩尔浓度达到1.0mol/l，再用稀氨水调节溶液的ph值至8.5。振荡后然后将溶液转移至脉冲提取腔，脉冲电场处理参数为：电场强度5kv/cm，脉冲宽度500ns，脉冲频率100hz，处理时间8分钟。再将溶液转移至离心管中，在3000r/min的转速下离心10分钟，下层清液为含有目标蛋白的后萃取液。
(6)浓缩干燥，得到产品。取下层含有目标蛋白的后萃取液，经浓缩、渗析后进行冷冻干燥，即制得大豆蛋白成品。称重发现，大豆蛋白的总提取率为79.3％。跟传统碱溶酸沉法相比，产率得到了大幅度的提升，提取时间也大幅缩短。经大豆蛋白的品质对比，发现脉冲电场辅助反束胶法制备的大豆蛋白在溶解性、起泡性及乳化性都优于碱溶酸沉法得到的蛋白。
实施例3脉冲电场辅助反胶束法从钝顶螺旋藻(spirulinaplatensis)中提取藻蓝蛋白
钝顶螺旋藻富含蛋白质、维生素和脂肪酸等物质，其中，蛋白质含量高达细胞干重的50％-70％。在所含蛋白中，藻蓝蛋白的生物活性较强，具有抗辐射、抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、辅助造血干细胞修复、保护人体神经组织免受损伤等作用，其含量在总蛋白中占7％左右。我国年产900吨螺旋藻粉，但是深加工产品蓝藻蛋白的加工能力较弱，目前主要以多级柱层析法纯化得到，提取纯化的步骤较长，成本较高。本发明提供了一种脉冲电场联合双水相从钝顶螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法，主要包括以下步骤：
(1)钝顶螺旋藻破碎。将钝顶螺旋藻加水浸泡5小时后，在-20℃条件下冷冻2-3小时后再于20-25℃下融化，如此反复冻融3-4次实现对钝顶螺旋藻破壁处理。再将所得溶液离心处理，收集上清液即为含有藻蓝蛋白的粗提液。然后利用旋转蒸发器对粗提液进行浓缩。
(2)反胶束溶液的配制。采用丁二酸二异辛酯磺酸钠/异辛烷反胶束体系。称取10g丁二酸二异辛酯磺酸钠表面活性剂置于250ml锥形瓶中，然后加入100ml异辛烷溶液，再加入浓度为0.08mol/l氯化钾的kh2po4-k2hpo4缓冲溶液，用玻璃棒适当搅拌后放在振荡器上震荡溶解，形成透明的反胶束体系。
(3)脉冲电场联合反胶束萃取大豆中的蛋白。将含有藻蓝蛋白的浓缩液加入到盛有上述反胶束溶液的锥形瓶中，用玻璃板适当搅拌后放在振荡器上震荡均匀，然后将溶液转移到脉冲电场提取腔中，脉冲电场提取腔放在冷却槽中。采用双极性脉冲电源，脉冲宽度500ns,电场强度8kv/cm，放电频率100hz，处理时间5分钟，再放置10分钟，
(4)固液分离。将脉冲电场提取腔中的溶液转移至离心管中，然后以4000r/min的速率对提取液进行离心分离10分钟。保留上层清液。
(5)反萃取。量取50ml上层清液的过滤液，然后加入氯化钾缓冲溶液，使氯化钾的摩尔浓度达到1.0mol/l，再调节溶液的ph值至7.0。振荡后然后将溶液转移至脉冲提取腔，脉冲电场处理参数为：电场强度5kv/cm，脉冲宽度500ns，脉冲频率100hz，处理时间8分钟。再将溶液转移至离心管中，在3000r/min的转速下离心10分钟，下层清液为含有目标蛋白的后萃取液。
(6)浓缩干燥，得到产品。取下层含有目标蛋白的后萃取液，经浓缩、渗析后进行冷冻干燥，即制得藻蓝蛋白的成品。
以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征并不局限于此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。