本发明属于动物疫病检测
技术领域：
，具体涉及一种用于检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr引物、检测方法及试剂盒。
背景技术：
：猪链球菌2型：猪链球菌(streptococcussuis，ss)属于革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧，形态呈球状或卵圆状，常成对或以短链形式排列，无芽抱，可形成荚膜。根据其荚膜多糖(cps)，将ss分为35个血清型，即1/2型和1～34型，其中猪链球菌2型是毒力最强、流行最广泛的血清型。主要引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎、脑炎、流产、多浆膜炎、支气管肺炎、化脓性淋巴结炎型和呼吸道疾病等。临床上常突然发病，体温升高至40℃～43℃，呼吸急促，从鼻孔中流出浆液性分泌物，结膜潮红，流泪，耳尖、颈部、腹下及四肢末端皮肤发绀或有出血点等急性败血型表现，多在2～3d内死亡。短期内波及到大片地区，发病率和死亡率都很高。猪多杀性巴氏杆菌：猪多杀性巴氏杆菌(pasteurellamultocida，pm)为革兰氏阴性菌，属于巴氏杆菌科(pasteurellaceae)巴氏杆菌属(pasteurella)。pm为短杆状或球杆状，两端钝圆，根据荚膜多糖抗原的不同，可以分为a,b,d,e和f5个血清型(carterandchengappa,1981)。pm引起的猪肺疫，俗称“锁喉风”或“肿脖子瘟”。一般认为在发病前猪只已带菌，在受到不良环境的刺激后，主要表现为剧烈咳嗽、气喘，最后窒息死亡，急性病例为出血性败血病、咽喉炎和肺炎的病状，慢性病例主要为慢性肺炎症状，散发性发生。副猪嗜血杆菌：副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis，hps)是一种形态多样、无溶血性、无运动性、nad依赖型、革兰阴性短小杆菌。菌株大多呈球杆状或双球状，某些时候可呈短链状。hps是猪上呼吸道的一种常在细菌，在特定的条件下可引起严重的全身性疾病，其主要特征是以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主。副猪嗜血杆菌有15种血清型，主要在中国流行并具有较强毒力的为血清型1、4、5、12和13。副猪嗜血杆菌病的临床症状、剖检病变和流行病学特征与猪的链球菌病、猪多杀性巴氏杆菌病都有相似之处，临床很容易将由这几种细菌所引起的疾病相混淆。给临床确诊带来了难度。因此，需要实验室技术加以确定。目前主要包括细菌的分离纯化培养之后的革兰氏染色镜检、生化鉴定等。然而这些方法操作比较繁复，耗费时间长且很难准确区分猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌。因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌联合检测鉴别方法，准确认别猪感染的病因并对症下药，对生猪养殖行业意义重大。技术实现要素：为解决以上问题，本发明提供用于检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr引物、检测方法及试剂盒，建立一种能够同时鉴别诊断ss2型、pm和hps的三重pcr检测方法，且具有很高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因，从而实施正确的治疗方案，挽回经济损失。本发明第一方面提供一种用于检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr引物，所述引物根据检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的高度保守的特异性序列设计三重pcr引物，其中，猪链球菌2型的检测引物，由seqidno：1所示的核苷酸序列的正向引物和seqidno：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；猪多杀性巴氏杆菌的检测引物，由seqidno：5所示的核苷酸序列的正向引物和seqidno：6所示的核苷酸序列的反向引物组成；检测副猪嗜血杆菌的检测引物，由seqidno：9所示的核苷酸序列的正向引物和seqidno：10所示的核苷酸序列的反向引物组成。上述的检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr引物在制备检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的制品中的应用。本发明第二方面提供一种用于检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr检测方法，包括以下步骤：1)从待检样品制备基因组总dna；2)以制备的基因组dna为模板，利用如权利要求1所述的三重pcr引物，在同一反应体系中进行三重pcr扩增，得到扩增产物；3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。在本发明一实施例中，所述用于检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr反应体系总体积为25μl，包括：1)seqidno：1、seqidno：2、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：9、seqidno：10所示核苷酸序列各0.75μl；2)2×taqplusmastermix12.5μl；3)ddh205.0μl；4)待测样品的dna模板3μl。在本发明一实施例中，所述用于检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三pcr反应条件包括：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环结束后；72℃终延伸10min。在本发明一实施例中，所述的用于检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr检测方法，其特征在于，所述的三重pcr检测方法的检测灵敏度低至0.02ng/μl(即20pg/μl)。本发明所述的“检测灵敏度低至20pg/μl”，本领域技术人员可以理解的是，针对dna含量低至20pg/μl的样品，均可被本发明提供的技术方案检测出。本发明第三方面提供一种于检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr引物，还包括ddh20、2×taqplusmastermix、阳性质控品、阴性质控品。在本发明一实施例中，所述的用于检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr检测试剂盒可特异性检测鉴定猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌，不能检测出胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪支气管败血波氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。本发明第四方面提供一种如本发明第一方面所述的三重pcr引物、如本发明第二方面所述的三重pcr检测方法或如本发明第三方面所述的三重pcr检测试剂盒在猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。本发明的有益效果在于：本发明提供的试剂盒具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，可以同时进行大批量的样本分析，一次反应便能鉴别猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌三种临床症状相似的病原菌，能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因，有利于对症下病实施正确的治疗方案，具有很好的应用前景。附图说明图1为本发明实施例提供的三重pcr检测的引物筛选电泳图，其中，m为dl1000dnamarks，泳道1为ss2-1-f/r、pm-2-f/r、hps-1-f/r；泳道2为ss2-1-f/r、pm-1-f/r、hps-1-f/r；泳道3为ss2-1-f/r、pm-1-f/r、hps-2-f/r；泳道4为ss2-1-f/r、pm-2-f/r、hps-2-f/r；泳道5为ss2-2-f/r、pm-2-f/r、hps-1-f/r；泳道6为ss2-2-f/r、pm-1-f/r、hps-1-f/r；泳道7为ss2-2-f/r、pm-1-f/r、hps-2-f/r；泳道8为ss2-2-f/r、pm-2-f/r、hps-2-f/r；泳道9为阴性对照。图2为本发明实施例提供的猪链球菌2型检测的退火温度优化电泳图，其中，m为dl1000dnamarks，泳道1～8为不同退火温度，分别为62.0℃、61.0℃、60.0℃、59.0℃、58.0℃、57.0℃、56.0℃、55.0℃；泳道9为阴性对照。图3为本发明实施例提供的猪多杀性巴氏杆菌检测的退火温度优化电泳图，其中，m为dl1000dnamarks，泳道1～8为不同退火温度，分别为62.0℃、61.0℃、60.0℃、59.0℃、58.0℃、57.0℃、56.0℃、55.0℃；泳道9为阴性对照。图4为本发明实施例提供的副猪嗜血杆菌检测的退火温度优化电泳图，其中，m为dl1000dnamarks，泳道1～8为不同退火温度，分别为62.0℃、61.0℃、60.0℃、59.0℃、58.0℃、57.0℃、56.0℃、55.0℃；泳道9为阴性对照。图5为本发明实施例提供的三重pcr检测退火温度优化电泳图，其中，m为dl1000dnamarks，泳道1～8为不同退火温度，分别为62.0℃、61.0℃、60.0℃、59.0℃、58.0℃、57.0℃、56.0℃、55.0℃；泳道9为阴性对照。图6为本发明实施例提供的三重pcr检测的引物浓度优化电泳图，其中，m为dl1000dnamarks，泳道1～9和泳道10～18为ss2-f/r、pm-f/r与hps-f/r引物浓度组合，泳道19为阴性对照，其中泳道5即ss2-f/r、pm-f/r与hps-f/r的加入浓度均为0.2μmol/l为最优。图7为本发明实施例提供的三重pcr检测的特异性试验的电泳图，其中泳道1为猪链球菌2型检测的电泳结果，泳道2为猪多杀性巴氏杆菌检测的电泳结果，泳道3为副猪嗜血杆菌的电泳结果，泳道4为猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌混合检测的电泳结果，泳道5、6、7、8、9分别为胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪支气管败血波氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的电泳结果，显示未检出，泳道10为阴性对照。图8为本发明实施例提供的猪链球菌2型pcr检测的敏感性试验的电泳图，ss2原始dna浓度为260ng/μl，按照10倍梯度稀释，即泳道1～7的dna浓度为26ng/μl，2.6ng/μl，0.26ng/μl，26pg/μl，2.6pg/μl，0.26pg/μl，26fg/μl，泳道8为阴性对照；其中泳道5为检出最低含量2.6pg/μl。图9为本发明实施例提供的猪多杀性巴氏杆菌检测的敏感性试验的电泳图，pm原始dna浓度为420ng/μl，按照10倍梯度稀释，即泳道1～7的dna浓度为42ng/μl，4.2ng/μl，0.42ng/μl，42pg/μl，4.2pg/μl，0.42pg/μl，42fg/μl，泳道8为阴性对照；其中泳道5为检出最低含量4.2pg/μl。图10为本发明实施例提供的副猪嗜血杆菌检测的敏感性试验的电泳图，hps原始dna浓度为200ng/μl，按照10倍梯度稀释，即泳道1～7的dna浓度为20ng/μl，2ng/μl，0.20ng/μl，20pg/μl，2.0pg/μl，0.20pg/μl，20fg/μl，泳道8为阴性对照；其中泳道5为检出最低含量2.0pg/μl。图11为本发明实施例提供的猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌混合检测的敏感性试验的电泳图，混合原始dna浓度为200ng/μl，按照10倍梯度稀释，即泳道1～7的dna浓度为20ng/μl，2ng/μl，0.20ng/μl，20pg/μl，2.0pg/μl，0.20pg/μl，20fg/μl，泳道8为阴性对照；其中泳道为检出最低含量20pg/μl。图12为本发明实施例提供的三重pcr检测重复性电泳图，其中，m为dl1000dnamarks，泳道1～5为阳性样品检测；6为阴性对照。具体实施方式以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。1.猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌的纯化培养1)按照大豆酪蛋白琼脂培养基(tryticsoyagar，tsa)使用方法再加上5％的小牛血清配制培养基来分离纯化猪链球菌2型和猪多杀性巴氏杆菌；按照大豆酪蛋白琼脂培养基(tryticsoyagar，tsa)使用方法再加上5％的小牛血清和终浓度为25ug/ml的过滤无菌的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)分离纯化副猪嗜血杆菌；2)按照胰蛋白胨大豆肉汤(tryticsoybroth，tsb)使用方法再加上5％的小牛血清配制培养基来培养猪链球菌2型和猪多杀性巴氏杆菌；按照胰蛋白胨大豆肉汤(tryticsoybroth，tsb)使用方法再加上5％的小牛血清和终浓度为25ug/ml的过滤无菌的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)培养副猪嗜血杆菌；3)挑取tsa固体培养基的ss2、pm和hps得单菌落，接种于tsb液体培养基中，放于恒温震荡摇床中37℃、220r/min震荡培养12小时；2.猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌核酸模板的制备1)取细菌培养液，按照天根细菌基因组dna提取试剂盒提取dna；2)提取后的dna置于冰上用于后续实验或置于-20℃保存。3.猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌三重pcr方法特异性引物筛选及体系优化1)猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌三重pcr引物设计分别选取猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌的保守基因cps2j、kmt1和tbpb基因，用primer5.0基因分析软件设计高度保守的特异性引物，所有引物均有北京睿博生物科技有限公司合成，具体序列见表1：表1针对猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌的特异性引物2)猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌三重pcr的反应体系及反应条件猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌三重pcr的反应体系见表2：表2猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌三重pcr的反应体系反应试剂加入体积2×taqplusmastermix12.5μl10μm引物(ss2、pm和hps)各0.75μl核酸模板(ss2、pm和hps)各1.0μl补水至25μl反应条件：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环结束后；72℃终延伸10min，反应结束后按照经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：如图1所示，ss2-1-f/r、pm-1-f/r、hps-1-f/r特异性条带较亮、清晰，因此，筛选ss2-1-f/r、pm-1-f/r、hps-1-f/r为猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌三重pcr鉴定引物。3)猪链球菌2型单重pcr的退火温度优化根据引物设计时primer5.0给出的参考值，对单重pcr退火温度进行摸索，设置62～55℃中的八个梯度(62.0℃、61.0℃、60.0℃、59.0℃、58.0℃、57.0℃、56.0℃、55.0℃)分别与cdna模板进行pcr扩增。结果：如图2所示，在退火温度为62～55℃时，条带都较亮、清晰，因此，退火温度可选62～55℃。4)猪多杀性巴氏杆菌单重pcr的退火温度优化根据引物设计时primer5.0给出的参考值，对单重pcr退火温度进行摸索，设置62～55℃中的八个梯度(62.0℃、61.0℃、60.0℃、59.0℃、58.0℃、57.0℃、56.0℃、55.0℃)分别与cdna模板进行pcr扩增。结果：如图3所示，在退火温度为59～55℃时，条带都较亮、清晰，因此，退火温度可选59～55℃。5)副猪嗜血杆菌单重pcr的退火温度优化根据引物设计时primer5.0给出的参考值，对单重pcr退火温度进行摸索，设置62～55℃中的八个梯度(62.0℃、61.0℃、60.0℃、59.0℃、58.0℃、57.0℃、56.0℃、55.0℃)分别与cdna模板进行pcr扩增。结果：如图4所示，在退火温度为59～55℃时，条带较亮、清晰，因此，最佳退火温度可选59～55℃。6)猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌三重pcr的退火温度优化根据ss2、pm和hps单重pcr温度，对三重pcr退火温度进行摸索，设置62～55℃中的八个梯度(62.0℃、61.0℃、60.0℃、59.0℃、58.0℃、57.0℃、56.0℃、55.0℃)分别与cdna模板进行pcr扩增。结果：如图5所示，在退火温度为59℃时，三个条带都较亮、清晰，因此，最佳退火温度为59℃。3)猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌三重pcr的引物浓度优化对猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌三重pcr引物ss2-f/r、pm-f/r和hps-f/r做引物浓度优化实验，引物浓度组合如表3所示：表3ss2-f/r、pm-f/r和hps-f/r引物浓度组合(μmol/l)按上述pcr反应条件进行扩增，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图6所示，组合5的引物浓度组合的双重pcr效果最好，即猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒引物浓度分别为0.3μmol/l时，条带较亮、清晰，确定双重pcr各引物浓度为0.3μmol/l为最优。本发明试剂盒的性能验证1)特异性试验采用优化后的多重pcr方法对猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪支气管败血波氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行扩增，并选择灭菌水做阴性对照，检验所建立方法的特异性。结果如图7所示，猪链球菌2型的目的片段大小为443bp；猪多杀性巴氏杆菌的目的片段大小为324bp；副猪嗜血杆菌的目的片段大小为560bp；而猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌混合感染目的片段大小有三条，分别为443bp、324bp和560bp；胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪支气管败血波氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均未见特异性条带扩增。2)敏感性试验a)单重rt-pcr敏感性试验分别以ss2、pm和hps的dna模板10倍倍比稀释的质粒(10-1～10-7)作为模板，用建立好的单重pcr方法进行扩增，扩增结果显示ss2最低检测量为2.6pg/μl，如所图8所示；pm最低检测量为4.2pg/μl，如图9所示；hps最低检测量为2.0pg/μl，如图10所示；b)多重rt-pcr敏感性试验以ss2、pm和hps的dna模板10倍倍比稀释的质粒(10-1～10-7)作为模板，用建立好的三重rt-pcr方法进行扩增，扩增结果显示ss2、pm和hps的最低检测量为20pg/μl；如图11所示。3)多重pcr重复性试验分别对5株已鉴定为ss2、pm和hps的菌株，进行基因组dna提取，随机选取3份混合，设置5个平行反应管，进行三重pcr扩增，对扩增结果进行对比。如图12所示结果相同，表明此三重pcr有较高的可重复性。综上所述，本发明提供的用于检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr试剂盒具备较高的检测灵敏性、特异性以及可重复性，一次反应便能鉴别猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌三种临床症状相似的病原菌，能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因，有利于对症下病实施正确的治疗方案，具有很好的应用前景。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12