一种检测Cr3+的罗丹明基荧光探针及其制备方法与流程

本发明属于荧光探针材料检测方法领域，具体涉及一种检测cr³⁺的罗丹明基荧光探针及其制备方法。

背景技术：

铬(iii)是一种生命必需的微量元素，具有多种生理功能。研究表明，铬(iii)有生物活性，铬(iii)的缺少会导致糖、脂肪等代谢系统紊乱，引起动脉硬化等多种疾病；但含量过高对生物和人类也有害，地面水中最高允许浓度规定为0.5mg/l。目前由于铬及其化合物被广泛应用于、电镀、皮革、颜料、耐火材料、印染、涂料等工业，通过废气、废液排放最终以离子形态进入大自然，铬的污染也逐渐增加，因此，寻找一种简便、快捷检测方法对铬离子的分析检测具有重要意义。

目前检测铬离子的主要方法有：高效液相色谱法，质谱法，原子吸收光谱法，原子发射光谱法，电化学传感等，但是这些方法用于复杂样品分析时，需要适当的预处理，仪器设备成本高，选择性较差，都不是理想的识别和检测铬(iii)浓度的方法。荧光法应用合适的探针可以对目标物实现高效、“裸眼”检测，无损耗，同时对目标物进行定性和定量分析。目前具有不同激发和发射波长的荧光团被用作化学检测器的信号接受者，例如香豆素，芘，1,8-萘二甲酰胺，罗丹明，花菁类，bodipy类等。其中以罗丹明为荧光基团构建的荧光探针，由于其优异的荧光性能和良好的可修饰性，目前已成为最受关注的荧光探针之一，但是目前的罗丹明铬离子荧光存在水溶性较差，灵敏度度低，抗干扰能力差，ph范围窄等问题。

如专利号cn106544008a公开了一种基于罗丹明6g的铬离子检测荧光探针分子、制备方法及用途，通过四步反应制得罗丹明6g铬离子荧光探针，所述探针对铬离子有很好的选择性，对na⁺，k⁺，ca²⁺，mg²⁺等常见金属离子及其阴离子具有很好的抗干扰能力。所述探针络合铬离子前后荧光发射约有13倍的增长，检测灵敏度高，且分辨时间短，可应用于环境水体样品、烟草样品、活体内的铬离子检测，具有广泛应用前景。所述探针分子细胞渗透性好，对细胞本身毒副作用小，实现了对线虫体内铬离子的荧光检测，但是所述探针检测分析所用ch3cn(乙腈)：tris-hcl(0.01mol/l,ph＝7.4)＝9:1(v:v)溶液，可见所述探针的水溶性较差。

专利号cn201610259469.6公开了一种利用罗丹明类荧光探针检测三价铬离子的方法，其特征在于，包括：配制不同浓度的三价铬离子溶液，静置，在激发波长为560nm的条件下，检测发射波长为582nm的荧光强度，以铬离子的浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到线性关系曲线；将罗丹明类荧光探针溶液加入到naoh/nah2po4缓冲溶液中得到含有荧光探针的缓冲体系，加入待测的三价铬离子溶液，静置，在激发波长为560nm的条件下，检测发射波长为582nm的荧光强度，根据步骤4中得到的线性关系曲线，计算铬离子的浓度。本发明荧光探针能选择性识别三价铬离子，并且不受其它常见离子的干扰、荧光强度高、荧光强度高，但是所述探针的ph范围较窄。

专利号cn201611043470.1公开了一种可同时用于银离子和三价铬离子检测的比率型荧光探针及其制备方法与应用。该荧光探针是三甘醇连接的双芘环和三唑的对称结构，当体系中没有被检测离子存在，在特定波长的发射光激发时，体系发出芘的激基缔合物的特征荧光发射带；当体系中分别加入银离子和三价铬离子时，两种被检测离子与识别基团通过不同的相互作用形成特定结构的络合物，破坏了探针分子的激基缔合物结构，从而可分别实现对银离子和三价铬离子的比率型荧光检测，在分析检测中能够避免外界条件的干扰，但是检测银离子和三价铬离子易相互影响，不利于区分。

因此为了解决仪器成本高、专业性强、耗时、操作复杂，而且对样品有损坏等问题和荧光探针水溶性较差、灵敏度度低、抗干扰能力差、ph范围窄等问题，设计合成新型的检测cr³⁺的罗丹明基荧光探针具有重要的意义。

技术实现要素：

为了解决荧光探针水溶性较差、抗干扰能力差、ph范围窄问题，本发明提供一种新型的检测cr³⁺的罗丹明基荧光探针及其制备方法。

一种检测cr³⁺的罗丹明基荧光探针，其反应方程式如图1所示。

其合成步骤如下：

(i)在惰性气体保护下，将溶于有机溶剂的罗丹明内酰胺，搅拌下逐滴加到nah和有机溶剂悬浮液中，控制反应温度-5～5℃，反应10～50min，接着将溶于有机溶剂的3-溴丙炔，逐滴加到反应体系中，加完后控制温度至20～50℃反应过夜，加入去离子水，chcl3萃取，饱和食盐水洗涤，干燥剂干燥，过滤，浓缩，柱层析分离纯化，得到白色固体(化合物1)；

(ii)将化合物1和叠氮磷脂二苯酯溶于有机溶剂，惰性气体保护下，加入抗坏血酸钠和cuso4·5h2o去离子水溶液，tlc监测反应进程，至原料点不再消失即可停止反应，加入去离子水，chcl3萃取，饱和食盐水洗涤，干燥剂干燥，过滤，浓缩，柱层析分离纯化，得到粉色固体。

进一步的，有机溶剂为无水甲醇、乙醇、乙腈、thf。

进一步的，步骤i中3-溴丙炔、罗丹明内酰胺和nah的摩尔比为1:1.0～1.5:0.8～1.0。

进一步的，步骤ii中化合物1、叠氮磷脂二苯酯、坏血酸钠和cuso4·5h2o的摩尔比为1:2～2.5:0.8～1.0:0.8～1.0。

进一步的，步骤i和ii中干燥剂为无水na2so4或无水mgso4。

进一步的，柱层析分离纯化溶剂为二氯甲烷与乙醇。

本发明基于罗丹明染料和磷脂二苯酯具有较好的水溶性，依据叠氮磷脂二苯酯经过铜(i)催化点击化学反应以及脱乙酰化反应设计出一种特殊结构的检测cr³⁺的罗丹明基荧光探针。此探针对铬离子有很好的选择性，对k⁺、na⁺、ca²⁺、mg²⁺、zn²⁺、cd²⁺、mn²⁺、fe³⁺、cu²⁺、pb²⁺等金属离子具有很好的抗干扰能力，而且检测灵敏度高，分辨时间短，可应用于环境水体样品、活细胞内的铬离子检测，具有广泛应用前景。

附图说明

图1为检测cr³⁺的罗丹明基荧光探针的反应方程式；

图2为检测cr³⁺的罗丹明基荧光探针对金属离子选择性的荧光发射光谱图；

图3为检测cr³⁺的罗丹明基荧光探针对3eq的cr³⁺和5eq其它干扰离子的荧光发射光谱图；

图4为检测cr³⁺的罗丹明基荧光探针对不同cr³⁺浓度的荧光发射光谱图；

图5为检测cr³⁺的罗丹明基荧光探针可逆性测试的荧光发射光谱图。

具体实施方式

如图1所示，合成罗丹明基cr³⁺荧光探针，具体方案如下：

实施例一

(i)将nah(0.01mmol)和无水thf(10ml)悬浮液冷却至-5℃，n2保护。将罗丹明内酰胺(0.01mmol)溶于无水thf(15ml)后，搅拌下逐滴加入反应液中，加完后-5℃反应30min，再将预先配置的溶液(0.01mmol3-溴丙炔和10ml无水thf)逐滴加入反应体系中，加完后控制温度至35℃反应过夜，加入去离子水，chcl3萃取，饱和食盐水洗涤，无水mgso4干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得到白色固体(化合物1)；

(ii)将化合物1(0.01mmol)和叠氮磷脂二苯酯(0.01mmol)溶于15mlthf，n2保护，加入10ml抗坏血酸钠(0.16g)和cuso4·5h2o(0.20g)去离子水溶液，室温反应过夜，加入去离子水，chcl3萃取，饱和食盐水洗涤，无水mgso4干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得到粉色固体。

实施例二

如图2所示，往探针溶液中分别加入5倍当量的k⁺、na⁺、ca²⁺、mg²⁺、zn²⁺、cd²⁺、mn²⁺、fe³⁺、cu²⁺、pb²⁺离子时，探针溶液为无色，在580nm处荧光强度也没有发生变化，可见探针保持原来的结构，能够稳定存在于这些溶液体系中。当探针溶液中加入cr³⁺后，溶液由无色变为红色，在580nm处荧光强度明显增强，出现一个强的发射峰，这是由于cr³⁺与探针反应使得罗丹明的螺环打开，产生荧光发射。

实施例三

如图3所示，以最大发射峰位置的荧光强度为纵坐标，金属离子为横坐标，首先往探针溶液中分别加入5倍当量的干扰离子(k⁺、na⁺、ca²⁺、mg²⁺、zn²⁺、cd²⁺、mn²⁺、fe³⁺、cu²⁺、pb²⁺)，再加入3倍当量的cr³⁺，溶液从无色状态马上变为红色，测试其荧光强度，由图可知，在其他干扰离子的存在下，探针对cr³⁺仍具有很好的识别能力。

实施例四

如图4所示，配制16份5ml的5μm探针溶液，分别加入0-50μm的铬离子，进行荧光检测(λex＝520nm)，计算各体系中荧光强度，通过分析580nm处的荧光强度与cr³⁺浓度的关系，评估探针对cr³⁺的响应性能。图3表明随着cr³⁺浓度的增大，溶液的荧光强度逐渐增强，直到最大发射强度不在变化。

实施例五

如图5所示，固定探针的浓度为10μm，加入2eq的cr³⁺溶液由无色变为红色，580nm处的荧光强度明显增强，显示探针对cr³⁺响应。继续加入5eq的edta溶液，荧光强度明显减弱，这是由于edta与cr³⁺络合，夺走了部分与探针反应的cr³⁺；继续加入2eq的cr³⁺后，体系的荧光强度无明显变化。这说明探针对cr³⁺的响应呈不可逆状态，其原因是探针与cr³⁺的结合属于反应型识别，而不是配位型识别。

上述仅为本发明的优选具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。