本发明涉及一种差异化裂解提取性侵犯案件检材中精细胞dna的方法及试剂盒，属于法医dna鉴定技术领域。
背景技术：
在性侵犯案件中，从受害人阴道采集的精子通常可以作为犯罪嫌疑人施暴的直接证据，但是使用拭子等采样工具从受害人阴道采集精子时，也会同时采集到阴道壁脱落的上皮细胞，因此，在对样本进行dna指纹鉴定之前，需要去除女性阴道上皮细胞来源的dna，使用纯化的精细胞来源dna进行dna指纹鉴定分析。
对性侵犯案件检材的常规样本处理流程一般步骤如下：第一步，样本采集；第二步，提供一种温和的裂解环境，产生上皮细胞dna和未裂解的精子混合物；第三步，离心形成精细胞沉淀和含上皮细胞dna的上清溶液，吸弃上清溶液；第四步，反复多次漂洗沉淀，清除残余上皮细胞dna；第五步，剧烈裂解环境，获得纯化的精子dna；上述流程的缺陷是上皮细胞dna残留在精细胞沉淀间隙的溶液中，较难清除干净。
针对现有方法的缺陷，本发明提供了一种新型的差异化裂解提取性侵犯案件检材中精细胞dna的方法及试剂盒。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提出了差异化裂解提取性侵犯案件检材中精细胞dna的方法及试剂盒，将dna裂解提取及扩增所需的试剂均装于试剂盒内，便于进行dna提取和扩增，提高鉴定效率；并为精细胞dna的提取提供温和的裂解环境，能够有效去除精细胞沉淀溶液中残留的上皮细胞dna，得到纯净的精细胞dna。
本发明的差异化裂解提取性侵犯案件检材中精细胞dna的试剂盒，包括盒体；所述盒体内设置有dna提取仓和dna扩增仓；所述dna提取仓内放置有用于提取目标dna的性侵犯检材裂解管，用于存放温和裂解液的第一存储管，及用于存放蛋白酶k的第二存储管，及用于精细胞裂解液的第三存储管，及用于存放还原剂的第四存储管；所述性侵犯检材裂解管由内管、中管和外管构成；所述内管其底部为镂空结构，且孔径大于或等于20微米；所述中管其底部设有疏水性过滤膜；所述疏水过滤膜其孔径为100纳米至800纳米；所述外管为离心管；所述第一存储管其存放的温和裂解液包括0.1%~20%表面活性剂、1~200mmol/lph缓冲系统、0.1~100mmol/l金属离子螯合剂和0~2mol/l无机盐离子；所述第三存储管其存放的精细胞裂解液包括1~7mol/l离液盐、1~20%非离子型表面活性剂、1~200mmol/lph缓冲系统和0.1-100mmol/l金属离子螯合剂；所述dna扩增仓内放置有dna扩增试剂盒。
进一步地，所述疏水性过滤膜为聚四氟乙烯、聚丙烯、聚醚砜材质或其它具有疏水性能的过滤膜；所述疏水性过滤膜其孔径优选地为220纳米；所述外管为1.5毫升或2毫升规格的离心管。
进一步地，所述第四存储管其存放的还原剂为二硫苏糖醇或巯基乙醇。
进一步地，所述表面活性剂为阴离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂，所述阴离子型表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基肌氨酸钠或其它阴离子表面活性剂，所述非离子型非离子型表面活性为tritonx-100、tween20、np40或其它非离子表面活性剂，所述表面活性剂为上述表面活性剂的一种或多种的组合，所述表面活性剂其浓度优选地为0.5%~10%；所述无机盐离子为氯化钠、氯化锂、氯化钾中的一种或几种的混合，所述无机盐离子其浓度优选地为0~1mol/l。
进一步地，所述离液盐为盐酸胍和/或异硫氰酸胍，所述离液盐其浓度优选地为2~5mol/l；所述非离子型表面活性剂为tritonx-100、tween20、np40和其它非离子表面活性剂中的一种或多种的组合，所述非离子型表面活性剂其浓度优选地为5%~15%。
进一步地，所述ph缓冲系统为三羟甲基氨基甲烷、醋酸钠、柠檬酸钠、磷酸二氢钠或其它弱酸弱碱盐，所述ph缓冲系统其浓度优选地为5mmol/l~50mmol/l；且所述温和裂解液中的ph缓冲系统其ph值为7.0~9.0，所述温和裂解液中的ph缓冲系统其ph值优选地为7.5~8.5；所述精细胞裂解液中的ph缓冲系统其ph值为4.5~9.0，所述精细胞裂解液中的ph缓冲系统其ph值优选地为5.0~8.5。
进一步地，所述金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸或其它具有螯合二价金属离子能力的化学成分，所述金属离子螯合剂的浓度优选地为1-10mmol/l。
作为优选的实施方案，所述dna扩增试剂盒为identifilerplus试剂盒。
本发明的差异化裂解提取性侵犯案件检材中精细胞dna的方法，所述方法包括如下步骤：
第一步，采集性侵犯案件检材，置于性侵犯检材裂解管，加入温和裂解液和蛋白酶k，50~70℃消化裂解10分钟~60分钟；
第二步，离心去除已消化释放至溶液的上皮细胞dna，丢弃内管及内管中的检材，向中管加入水或温和裂解液，离心清洗残留的上皮细胞dna；
第三步，向中管加入精细胞裂解液、蛋白酶k和还原剂，50~70℃消化裂解20分钟~60分钟；
第四步，离心收集外管内液体，纯化回收外管内的精细胞dna。
进一步地，所述第四步中纯化回收外管内的精细胞dna所使用的方法为硅胶膜法、硅珠法、磁珠法、苯酚氯仿法或异丙醇沉淀法。
本发明与现有技术相比较，本发明的差异化裂解提取性侵犯案件检材中精细胞dna的方法及试剂盒，将dna裂解提取及扩增所需的试剂均装于试剂盒内，便于进行dna提取和扩增，使得法医dna鉴定更加方便，提高鉴定效率；并为精细胞dna的提取提供温和的裂解环境，能够有效去除精细胞沉淀溶液中残留的上皮细胞dna，得到纯净的精细胞dna，提高了鉴定准确性。
附图说明
图1是本发明的试剂盒结构示意图。
图2是本发明的性侵犯检材裂解管安装结构示意图。
图3是本发明的实施例1中第一离心管内液体获得的str分型图谱。
图4是本发明的实施例1中第二离心管内液体获得的str分型图谱。
图5是本发明的实施例1中第三离心管内液体获得的str分型图谱。
图6是本发明的实施例1中第四离心管内液体获得的str分型图谱。
附图中各部件标注为：1-盒体，2-dna提取仓，3-dna扩增仓，4-性侵犯检材裂解管，41-内管，42-中管，43-外管，44-第一外螺纹，45-第一内螺纹，46-第二外螺纹，47-第二内螺纹，5-第一存储管，6-第二存储管，7-第三存储管，8-第四存储管，9-疏水过滤膜，10-dna扩增试剂盒，11-镂空结构。
具体实施方式
如图1和图2所示的差异化裂解提取性侵犯案件检材中精细胞dna的试剂盒，包括盒体1；所述盒体1内设置有dna提取仓2和dna扩增仓3；所述dna提取仓2内放置有用于提取目标dna的性侵犯检材裂解管4，用于存放温和裂解液的第一存储管5，及用于存放蛋白酶k的第二存储管6，及用于精细胞裂解液的第三存储管7，及用于存放还原剂的第四存储管8；所述性侵犯检材裂解管4由内管41、中管42和外管43构成；所述内管41其底部为镂空结构11，且孔径大于或等于20微米；所述中管42其底部设有疏水性过滤膜9；所述疏水过滤膜9其孔径为100纳米至800纳米；所述外管43为离心管；所述第一存储管5其存放的温和裂解液包括0.1%~20%表面活性剂、1~200mmol/lph缓冲系统、0.1~100mmol/l金属离子螯合剂和0~2mol/l无机盐离子；所述第三存储管7其存放的精细胞裂解液包括1~7mol/l离液盐、1~20%非离子型表面活性剂、1~200mmol/lph缓冲系统和0.1-100mmol/l金属离子螯合剂；所述dna扩增仓3内放置有dna扩增试剂盒10。
所述内管41、中管42和外管43分别通过螺纹连接；所述内管41其外侧中部设置有第一外螺纹44；所述中管42其外侧中部及其内侧顶部分别设置有第二外螺纹45和第一内螺纹46；所述外管43其内侧顶部设置有第二内螺纹47；所述第一外螺纹44与第一内螺纹46旋接；所述第二外螺纹45与第二内螺纹47旋接；所述疏水性过滤膜9为聚四氟乙烯、聚丙烯、聚醚砜材质或其它具有疏水性能的过滤膜；所述疏水性过滤膜9其孔径优选地为220纳米；所述外管42为1.5毫升或2毫升规格的离心管。
所述第一存储管5其尺寸规格大于第三存储管7其尺寸规格；所述第三存储管7其尺寸规格大于第二存储管6其尺寸规格；所述第二存储管6其尺寸规格大于第四存储管8其尺寸规格；所述第四存储管8其存放的还原剂为二硫苏糖醇或巯基乙醇。
所述表面活性剂为阴离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂，所述阴离子型表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基肌氨酸钠或其它阴离子表面活性剂，所述非离子型非离子型表面活性为tritonx-100、tween20、np40或其它非离子表面活性剂，所述表面活性剂为上述表面活性剂的一种或多种的组合，所述表面活性剂其浓度优选地为0.5%~10%；所述无机盐离子为氯化钠、氯化锂、氯化钾中的一种或几种的混合，所述无机盐离子其浓度优选地为0~1mol/l。
所述离液盐为盐酸胍和/或异硫氰酸胍，所述离液盐其浓度优选地为2~5mol/l；所述非离子型表面活性剂为tritonx-100、tween20、np40和其它非离子表面活性剂中的一种或多种的组合，所述非离子型表面活性剂其浓度优选地为5%~15%。
所述ph缓冲系统为三羟甲基氨基甲烷、醋酸钠、柠檬酸钠、磷酸二氢钠或其它弱酸弱碱盐，所述ph缓冲系统其浓度优选地为5mmol/l~50mmol/l；且所述温和裂解液中的ph缓冲系统其ph值为7.0~9.0，所述温和裂解液中的ph缓冲系统其ph值优选地为7.5~8.5；所述精细胞裂解液中的ph缓冲系统其ph值为4.5~9.0，所述精细胞裂解液中的ph缓冲系统其ph值优选地为5.0~8.5。
所述金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸或其它具有螯合二价金属离子能力的化学成分，所述金属离子螯合剂的浓度优选地为1-10mmol/l。
所述dna扩增试剂盒10为identifilerplus试剂盒。
实施例1：
本发明的差异化裂解提取性侵犯案件检材中精细胞dna的方法，所述方法包括如下步骤：
第一步，采集阴道拭子，放入性侵犯检材裂解管4，加入300ul温和裂解液（0.5%十二烷基硫酸钠、5mmol/l乙二胺四乙酸二钠、1mol/l氯化钠、20mmol/l三羟甲基氨基甲烷、ph值7.5）和20ul蛋白酶k（20mg/ml），56℃裂解30分钟；
第二步，8000rpm离心3分钟，丢弃内管41及内管41内的拭子，外管43内液体转入一个新的第一离心管中备用，往中管加入600ul温和裂解液，8000rpm离心1分钟，外管43内液体转入一个新的第二离心管中备用，再往中管加入600ul温和裂解液；
第三步，8000rpm离心1分钟，外管43内液体转入一个新的第三离心管中备用，往中管加入200ul精细胞裂解液（4.5mol/l异硫氰酸胍，2%十二烷基肌氨酸钠，4%曲拉通x-100，20mmol/l三羟甲基氨基甲烷、ph值8.0）、20ul蛋白酶k（20mg/ml）和20ul二硫苏糖醇（1mol/l），56℃消化裂解1小时；
第四步，12000rpm离心1分钟，外管43内液体转入一个新的第四离心管中备用；
第五步，采用硅胶膜离心柱法分别对离心管1~4中液体进行dna回收，具体方法为，往离心管内加入1倍体积的7mol/l盐酸胍和1倍体积的异丙醇，混匀后转入硅胶膜离心柱中，12000rpm离心1分钟，用75%乙醇漂洗硅胶膜两次，烘干硅胶膜，用纯化水洗脱dna；
用identifilerplus试剂盒扩增29个循环，并用3500xl生物分析仪进行分析获得str分型图谱；如图3至图6所示，第一离心管内液体中的dna为女性dna，第二离心管内液体中的dna为女性dna，第三离心管内液体未检测到dna，第四离心管内液体中的dna为男性dna。
上述实施例，仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。