本发明涉及一种生成细胞的方法，具体涉及一种3d悬浮诱导ips细胞生成自体黑素细胞的方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
黑素细胞是一种唯一能生成黑色素以保护皮肤细胞抵抗紫外线的细胞类型。人类黑素细胞能够直接从表皮分离获得，然而，其在表皮中的数量极其有限，加上在体外增殖能力弱等特点，大大限制了黑素细胞在自体细胞移植治疗、药物筛选等方面的应用。
除表皮之外，黑素细胞还能够通过其他途径分化获得，如黑素干细胞和黑素前体细胞、真皮干细胞、毛囊干细胞、毛囊外毛根鞘干细胞、胚胎神经嵴干细胞以及胚胎干细胞等。然而，这些方法存在各自的缺点，如黑素干细胞、真皮干细胞及毛囊相关的干细胞在皮肤中的数量极少，同时不具有无限增殖的能力，因此获得的黑素细胞数量十分有限。而胚胎来源的干细胞虽然能够无限增殖，但存在伦理争议，而且无法获得用于患者移植的自体黑素细胞。
此外，通过重编程的手段也能够使皮肤成纤维细胞或角质形成细胞直接转分化，获得具有一定功能的黑素细胞。但是目前的转分化系统效率极低，加上获得的细胞功能与正常黑素细胞存在一定差距，因此应用受到限制。
诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells,ips细胞)具有无限增殖和多向分化能力，目前已有多个研究发现，在特定因子的作用下，ips细胞在体外可被诱导分化为具有正常功能的黑素细胞。与其他来源相比，ips细胞具有多方面的优势：1.通过微创甚至无创取材，可建立患者自体ips细胞，通过进一步分化可获得自体黑素细胞；2.无限增殖的特性能够生成患者需要的足够数量的黑素细胞；3.不存在伦理问题；4.保留患者遗传特性，能够应用于研究特定患者的发病机制以及药物筛选，实现个体化治疗。
利用已有报道的ips细胞向黑素细胞分化的方案时发现，在生成黑素细胞的同时会产生大量上皮样细胞。这些上皮样细胞不但比例高，而且增殖速度快，大大影响了黑素细胞的增殖，从而在数次传代后时常不能获得成熟的黑素细胞；导致这一低效率的原因主要有两方面：1.传统多利用机械消化法或胰酶消化法获得拟胚体，其大小和形态高度不均一；2.传统方法中整个分化过程都是在2d平面上进行，这容易导致上皮样细胞的大量且快速地增殖。
技术实现要素：
针对现有黑素细胞的诱导分化方案中拟胚体大小形态不均一，分化效率低下，分化同时伴有大量上皮样细胞生成，在数次传代后时常不能获得成熟的黑素细胞的技术问题，本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种生成自体黑素细胞的新方法，本方法采用一种基于3d悬浮诱导ips细胞生成自体黑素细胞。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
具体步骤包括如下：
a．单细胞法制作拟胚体：
ips细胞克隆生长，加入ips单细胞消化酶进行消化，加入mtesr培养基，吹打成ips单细胞悬液，离心后弃上清液，加入mtesr培养基重悬计数，将ips单细胞接种至三维培养板内，添加rock抑制剂；培养24小时后得到形态大小均一的拟胚体；将拟胚体轻轻吹打吸出，转移至低黏附板中继续维持悬浮培养，每天换液；
步骤a中所述ips单细胞消化酶为accutasetm，所述ips单细胞接种至三维培养板是接种至24孔elplasiatm三维板中，每孔接种密度为5×105个细胞；rock抑制剂为y27632；所述继续维持培养是培养时间5-10天,拟胚体直径达到300-500μm；
b．3d悬浮诱导分化：
（1）3d早期诱导：将步骤a中得到的转移至低黏附板中继续维持培养的拟胚体放入分化培养基中进行早期诱导分化，早期诱导分化时拟胚体在低黏附板中悬浮；
（2）中期诱导贴壁:
将上述步骤b（1）中早期诱导分化后的拟胚体转移至纤维粘连蛋白(fibronectin)包被的培养板中，中期贴壁培养，分化培养基组分不变，拟胚体贴壁生长；
（3）后期诱导:
将上述步骤b（2）中贴壁培养后的拟胚体用消化酶消化成单细胞，接种至纤维粘连蛋白包被过的培养板中，在优化后的分化培养基中进行后期成熟诱导，当细胞密度达90%时，用消化酶消化传代，分化第35-42天时，得到成熟黑素细胞。
步骤b（1）所述的早期诱导分化时间为14天，步骤b（2）所述的中期诱导贴壁培养时间为7天。
步骤b（3）中所述的贴壁培养后的拟胚体为诱导分化21天的拟胚体，所述接种为接种密度是2×104/cm2。
步骤b（3）中所述优化后的分化培养基包括：体积百分比为50%的l-wnt3a细胞上清液、30%的低糖dmem、20%的mcdb201培养基、0.05μm地塞米松（dexamethasone）、1×胰岛素-转铁蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium）、1mg/ml亚油酸-牛血清白蛋白（linoleicacid-bovineserumalbumin）、10-4m抗坏血酸（l-ascorbicacid）、50ng/ml干细胞因子（scf）、100nmedn3、20pm霍乱毒素（choleratoxin）、4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）、0.5%胎牛血清（fbs）。
与现有技术相比较，本发明的有益效果：
传统2d平面诱导分化系统中拟胚体分化成大量上皮样细胞，树突状细胞所占比例极少，在单细胞消化后，扁平、多角形的上皮样细胞比例高且增殖快，而树突状的细胞比例少且增殖速度慢，因此在数次传代后，时常不能获得成熟的黑素细胞。本发明所述方法将早期诱导分化过程从2d平面诱导改为3d悬浮培养，在贴壁后发现拟胚体周边有大量的树突状细胞生成，而上皮样形态的细胞几乎观察不到；使用优化的后期分化培养基，这些树突状细胞保持快速的增殖能力，经过数次传代，可获得大量成熟的黑素细胞。
本发明所述制备方法制备的黑素细胞具有优良的性能优势：本发明获得的黑素细胞在体外特征上与人体正常黑素细胞高度接近；将本发明制备的黑素细胞移植到免疫缺陷型小鼠的皮肤内，发现黑素细胞在体内功能上要显著优于正常黑素细胞，更利于应用在患者自体细胞移植治疗色素缺失性疾病如白癜风中，同时，也利于应用于体外制作3d皮肤模型研究患者发病机制及个体化药物筛选等方面。
附图说明
图1是传统2d平面贴壁法诱导分化黑素细胞的形态图；图中，a为采用传统机械法获得的拟胚体形态图；b为拟胚体转移至纤维粘连蛋白包被的培养板后贴壁分化21天时的形态图；c为分化21天的拟胚体进行单细胞消化后的细胞形态图；d为经过2次传代后的细胞形态图；比例尺：a，500μm；b-d，200μm。
图2是利用3d悬浮诱导ips细胞生成黑素细胞的形态图；图中，a为ips单细胞接种至三维培养板中的形态图；b为添加rock抑制剂24小时后形成的拟胚体的形态图；c为拟胚体形成第7天的形态图；d为在3d悬浮诱导分化第14天的形态图；ea为诱导分化第21天（贴壁第7天）的形态图；eb为图ea的局部放大图；f为诱导分化第28天的细胞形态图；g为诱导分化第35天的黑素样细胞形态图；比例尺：ea,500μm，其余均为200μm。
图3是选择不同培养天数和大小的拟胚体进行3d悬浮诱导分化的对比图；图中，a为培养天数小于3天，直径小于200μm的拟胚体细胞形态图；b为a中的拟胚体在分化第14天细胞形态图；c为a中的拟胚体在分化第21天细胞形态图；d为培养天数大于14天，直径大于700μm的拟胚体细胞形态图；e为d中的拟胚体在分化第15天细胞形态图；f为d中的拟胚体分化第21天细胞形态图；比例尺：200μm。
图4是选择不同时间点对诱导后拟胚体进行单细胞消化，获得的黑素细胞的增殖状态对比图；比例尺：200μm。
图5是诱导后期培养基中添加不同浓度的血清或血清替代物对诱导黑素细胞增殖的影响的同期对比图；比例尺：200μm。
图6是利用3d悬浮法生成ips由来的黑素细胞的体外特征鉴定图；图中，a为黑素细胞特征性基因mrna水平表达图与管家基因gapdh表达量相比计算所得；b为黑素细胞特征性蛋白mitf-m、tyr和tyrp1表达图；c为鉴定酪氨酸酶活性的多巴染色；d为鉴定黑色素生成的masson-fontana染色；e为透射电镜观察黑素小体生成图；比例尺：b，200μm；c-d，50μm；e，0.5μm。
图7是ips细胞体外诱导生成黑素细胞与正常黑素细胞在参与小鼠毛囊重构模型中的移植效果对比图；m-f染色中的比例尺：200μm。
图8是利用3d悬浮诱导法在不同ips细胞株上的诱导分化图；图8a为ipss-2细胞株的诱导分化过程，其中，aa为常规培养的ipss-2细胞，ab为ipss-2细胞株形成的拟胚体，ac为诱导分化第14天，ad为诱导分化第21天，ae为诱导分化第28天，af为诱导分化第35天；图8b为ipss-3细胞株的诱导分化过程，其中，ba为常规培养的ipss-3细胞，bb为ipss-3细胞株形成的拟胚体，bc为诱导分化第14天，bd为诱导分化第21天，be为bd的局部放大图，bf为诱导分化第35天；比例尺：bd,500μm，其余均为200μm。
图9是利用病毒转染法将人皮肤成纤维细胞进行重编程获得的ips细胞的鉴定图。图中，a为人皮肤成纤维细胞；b为建立的ips细胞；c为碱性磷酸酶染色；d为干性基因mrna水平表达图；e为ips细胞形成的畸胎瘤中三个胚层的组织结构图；比例尺：a-c，200μm；e，100μm。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，作出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所述ips细胞、ipscs-2细胞及ipscs-3细胞是利用人体皮肤成纤维细胞通过病毒感染法生成，并对生成的ips细胞的特征进行了鉴定，如图9所示；图中，a为人皮肤成纤维细胞；b为建立的ips细胞；c为碱性磷酸酶染色；d为干性基因mrna水平表达图；（与管家基因gapdh表达量相比计算所得），横坐标中oct4、sox2、nanog、rex1、dnmt3b及gdf3为干性特征性基因，这些基因在ips细胞与胚胎干细胞中的表达水平相当，而在人成纤维细胞中几乎检测不到；e为ips细胞形成的畸胎瘤中三个胚层的组织结构图。
实施例1：
传统方法（2d分化）：
如图1所示，利用传统方法（如机械法）制作的拟胚体大小和形态高度不均一(图1a)；这些拟胚体在2d平面培养时会全面铺展开，生成大量的上皮样细胞，而树突状的细胞所占比例极少(图1b)；在分化21天时进行单细胞消化，同样可观察到贴壁的单细胞中大多数细胞维持多角形的上皮样细胞形态，树突状的细胞比例极少(图1c)；由于黑素细胞比例低且增殖速度慢，而上皮样细胞比例高且增殖快，因此在数次传代后，时常不能获得成熟的黑素细胞(图1d)。
实施例2：
a．单细胞法制作拟胚体
在ips细胞克隆生长到适度大小时，加入ips单细胞消化酶accutasetm(innovativecelltechnologie)，室温放置5-7分钟，加入mtesr(stemcelltechnologies)培养基吹打成ips单细胞悬液，离心后弃上清液，加入mtesr培养基重悬计数，将ips单细胞接种至elplasiatm三维培养板（kuraray）内（图2a）；接种密度以24孔板为例，每孔加入5×105个细胞，添加终浓度为10μm的rock抑制剂y27632(wako)，37度培养，24小时后，培养得到形态大小均一的拟胚体形成（图2b）；将拟胚体轻轻吹打吸出，转移至低黏附板(corning)中继续维持培养，每天换液。
b．3d悬浮诱导分化过程：
(1)3d早期诱导
待拟胚体在低黏附板中培养5-10天后，直径达到300-500μm（图2c），将拟胚体放入分化培养基中开始进行诱导分化；早期诱导分化仍然在低黏附板中进行，分化周期为14天；可观察到拟胚体体积逐渐增大，颜色加深，形态变得不规则（图2d）。
所述分化培养基配方：体积百分比为50%的l-wnt3a细胞上清液、30%的低糖dmem(gibco)、20%的mcdb201(sigma-aldrich)、0.05μmdexamethasone(sigma-aldrich)、1×insulin-transferrin-selenium(sigma-aldrich)、1mg/mllinoleicacid-bovineserumalbumin(sigma-aldrich)、10-4ml-ascorbicacid(sigma-aldrich)、50ng/mlscf(sigma-aldrich)、100nmedn3(americanpeptidecompany)、20pmcholeratoxin(sigma-aldrich)、50nm12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate(tpa)(sigma-aldrich)和4ng/mlbfgf(wako)。
（2）中期诱导贴壁
制备fibronectin(bdbiosciences)包被的培养板：在六孔板的每孔中加入1mldpbs和20μlfibronectin储存液(1mg/ml)，吹打混匀，室温放置一小时，吸走，用dpbs清洗一遍，待用。
将上述步骤（1）中早期诱导分化14天后的拟胚体转移至上述fibronectin包被的培养板中，进行中期贴壁培养，分化培养基组分不变，拟胚体贴壁生长7天；此时，即可观察拟胚体周边有大量的树突状细胞生成，几乎观察不到上皮样形态的细胞（图2ea、2eb）。这些树突状细胞保持快速的增殖能力。
（3）后期诱导
将上述步骤（2）中贴壁培养后的拟胚体（分化第21天）用trypleselect(invitrogen)消化成单细胞，接种至fibronectin包被过的细胞板中，接种密度为2×104/cm2；在优化后的分化培养基中进行后期成熟诱导。当细胞密度达90%时，用trypleselect消化传代，这些细胞树突逐渐变长，且快速增殖(图2f）。分化第35-42天时，得到成熟黑素细胞（图2g）。
优化后的分化培养基包括：体积百分比为50%的l-wnt3a细胞上清液、30%的低糖dmem培养基、20%的mcdb201培养基、0.05μm地塞米松、1×胰岛素-转铁蛋白-硒、1mg/ml亚油酸-牛血清白蛋白、10-4m抗坏血酸、50ng/ml干细胞因子、100nmedn3、20pm霍乱毒素、4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、0.5%胎牛血清。
实施例3：
选择不同培养天数和大小的拟胚体进行3d悬浮诱导分化：
本发明在诱导分化过程中选择不同培养天数和大小的拟胚体进行诱导分化，比较了培养天数和拟胚体大小对诱导分化的影响。如图3所示，培养天数小于3天，直径小于200μm，结构松散的拟胚体（图3a），在分化早期（分化第14天）会出现大量空泡样结构（图3b），贴壁后（分化第21天）这些结构呈现扁平宽大的形态，无增殖能力（图3c）。而使用培养天数大于14天，直径大于700μm的拟胚体（图3d），分化后（分化第15天）中央大部分深色区域的细胞都无法贴壁成为单细胞继续增殖（图3e），拟胚体分化第21天，周边的细胞也呈现上皮样状态（图3f）。
实施例4：
选择不同单细胞消化时间点：
在实施例2进行贴壁培养后的拟胚体消化单细胞过程中，本发明比较了单细胞消化的不同时间点对于诱导黑素细胞增殖状态的影响。在分化第14天、第21天和第28天分别对拟胚体进行单细胞消化传代，如图4所示，在分化第14天、第28天进行消化传代后的细胞无法增殖或增殖速度慢，而在分化第21天进行消化传代的细胞仍然保持高增殖活性，且能够继续分化成熟，形态也更加接近正常黑素细胞。因此最终确定了分化第21天进行单细胞消化为最佳时机，更有利于黑素细胞的生长。
实施例5：
添加不同浓度的血清对改善黑素细胞的增殖的影响：
在实施例2进行单细胞消化后的培养过程中，本发明比较了分化培养基中添加不同浓度的血清fbs（gibco）及血清替代物ksr（gibco）对黑素细胞生长状态的影响；如图5所示，未添加血清（无fbs）的黑素细胞增殖能力很弱，加入过高浓度（1%，5%，10%）的fbs容易导致黑素细胞提前衰老死亡，而加入0.5%的胎牛血清（fbs）能够显著提高其增殖速度，使用0.5%的血清替代物ksr（knockoutserumreplacement）也并不能显著改善其增殖状态；由此确定添加浓度为0.5%的血清对改善黑素细胞的增殖状态为最佳。
实施例6：
利用3d悬浮诱导ips细胞生产自体黑素细胞的体外特征的鉴定：
将本发明所述制备方法制备的诱导黑素细胞与正常黑素细胞进行体外特征比较，如图6；图6a横坐标中mitf-m、pax3、c-kit、sox10、dct、tyr及tyrp1为黑素细胞特征性基因，这些基因的表达水平在诱导黑素细胞与正常黑素细胞中是相当的，而在ips细胞中几乎检测不到诱导黑素细胞表达与正常黑素细胞相当水平的黑素基因和蛋白；图6b所示，黑素细胞特征性蛋白mitf-m、tyr和tyrp1在诱导黑素细胞中的表达接近正常黑素细胞；图6c、6d所示，鉴定酪氨酸酶活性的多巴染色和黑色素生成的masson-fontana染色在两种细胞均呈现阳性结果；图6e所示，透射电镜发现两种细胞均有成熟的黑素小体生成；通过本发明获得的诱导黑素细胞具有与人体正常黑素细胞高度接近的体外特征。
实施例7：
利用3d悬浮诱导法获得的诱导黑素细胞的体内功能的鉴定：
将本发明所述制备方法制备的诱导黑素细胞与正常黑素细胞进行体内功能的比较，如图7所示；将本发明获得的诱导黑素细胞移植到免疫缺陷型小鼠的皮肤内参与毛囊重构后，在体视显微镜下可观察到这些细胞能够与小鼠的毛囊高度整合，生成黑色毛囊和很长的毛干，masson-fontana（m-f）染色也显示黑色素位于毛囊的毛球部和毛干位置，提示这些细胞具有向周围角质形成细胞传递黑素颗粒的能力，而人体正常黑素细胞移植后在体视显微镜下仅观察到短小的黑色毛囊，并未见长长的黑色毛干，m-f染色显示仅有小部分细胞能够整合入毛球部，其余细胞都发生了衰老死亡，在毛囊周边的结缔组织中遗留大量的黑素颗粒团块。
因此，本发明获得的诱导黑素细胞在体内功能上要显著优于正常黑素细胞，更利于将来的移植应用。
实施例8：
利用3d悬浮诱导法在不同ips细胞株上的应用实施：
将ips细胞体外诱导生成自体黑素细胞的方法应用于其他两株ips细胞系ipscs-2细胞、ipscs-3细胞，均可高效获得大量成熟的黑素细胞，提示该方法具有广泛适用性。如图8a、8b所示，应用于细胞株ipscs-2、ipscs-3进行诱导生成均获得大量成熟的黑素细胞。