本发明属于分子生物学
技术领域：
：，具体涉及一种基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qrt-pcr分析中作为内参基因的用途。
背景技术：
：：瓠瓜(lagenariasicerariavar.hispida)，为葫芦科葫芦属一年生蔓性草本，是可消肿结、润肌肤的药用瓜菜。中国自古就有栽培，嫩果是民间夏令常吃的佳肴，口感细嫩柔软，稍有甜味，去皮后全可食用。成熟老果不可食用，中国古时以其老熟干燥果壳作容器，也作药用。瓠瓜在我国南北各地均有栽培，南方栽培普遍，近几年北方也开始引种栽培。近年来，随着西瓜上黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumbergreenmottlemosaicvirus,cgmmv)的发生危害频频报道，作为西瓜砧木的瓠瓜携带cgmmv的病例也有大量报道。cgmmv侵染西瓜导致新叶产生淡绿色或淡黄色的花斑，而后形成绿色的突起，甚至使叶片产生畸形。随着病叶老化，症状逐渐减弱，与正常植株相比，病株生长缓慢，植株矮小，有时还出现萎蔫症状。有时感病西瓜果实的表面出现镶嵌斑驳或是颜色浓绿的圆斑，其中央还会可能产生坏死点。有时感病西瓜果实表面没有症状，但果实内部，靠近种子的果肉呈褐紫色的浑浊而不透明的水浸状，果肉出现纤维化，甚至出现空洞、腐烂。而cgmmv侵染的瓠瓜叶片表现为黄化、花叶或是脉间黄化沿叶脉呈绿带状，有时伴随绿色突起。一般病株顶部叶片表现为黄化、花叶、绿色突起、变小，底部叶片沿叶脉皱缩，叶边缘呈现波浪状，叶片畸形，有时老叶也会出现隐症。幼果感病后，果实表面表现斑驳或是绿色部分突起等症状，待果实成熟后症状消失，病果果梗出现褐色坏死。cgmmv侵染不同寄主叶片表现症状类似，但在果实上则差异较大的现象引起了人们的关注。目前对葫芦科作物的功能基因研究仍比较落后，在瓠瓜功能基因研究中利用qrt-pcr分析基因表达的研究尚未见报道，仅在甜瓜和西瓜等近源物种中针对生物或非生物胁迫、果实发育等阶段有少量应用传统内参基因的相关报道。因此目前对cgmmv侵染后瓠瓜叶片和果实基因进行表达分析时，只能参考其他物种选用表达稳定性缺乏系统验证的传统内参基因，这严重影响了瓠瓜在被病毒侵染后叶片和果实中基因表达分析的准确性。而近年来兴起的转录组测序技术，为我们筛选cgmmv侵染后瓠瓜叶片中稳定表达的内参基因提供了可能。这就需要提供葫芦科植物在作为黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下的专属内参基因，为准确监测、预防该病提供可能。技术实现要素：本申请以cgmmv侵染前后的瓠瓜为试验材料，检测候选持家基因和葫芦科传统内参基因在瓠瓜叶片和果实中基因表达情况，揭示候选基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qrt-pcr分析中作为内参基因的用途。为解决瓠瓜在被黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染后叶片或果实中进行基因表达定量分析时缺乏经系统验证、表达稳定的内参基因的问题。本发明的目的之一在于提供一种lswd基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qrt-pcr分析中作为内参基因的用途。在一些优选的方式中，所述的lswd基因序列如seqidno.2所示。在一些优选的方式中，所述的内参基因的引物为：正向引物序列：tctgtggtactcgagaaggc；反向引物序列：gagaaatctccggtgtgtcgt。另一方面，本发明提供一种黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qrt-pcr分析lsipt或lsddrp的方法，包括如下步骤：步骤1：供试样品处理瓠瓜幼苗种植于温室土壤中，保持温度20-25℃，每3天浇一次水，在两叶一心期将黄瓜绿斑驳花叶病毒病汁液摩擦接种于展开的系统叶片；病汁液是通过将100mg黄瓜绿斑驳花叶病毒感病组织匀浆于20倍体积的pbs缓冲液中所形成；健康植株用pbs缓冲液处理作为对照；随机选取黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染的瓠瓜系统叶片、果实和健康瓠瓜系统叶片、果实于液氮中保存备用；步骤2：rna的提取和cdna的合成将液氮中保存备用的供试样品进行rna提取，每个处理设置3次生物学重复；用变性凝胶电泳和生物分析仪检测rna质量和浓度；对上述每个rna进行反转录得到对应的cdna；步骤3：提供参考基因lsipt或lsddrp的引物；lsipt引物的核苷酸序列如下：正向引物序列为gcactccaatggctcgttta，反向引物序列为ggtcgatggtggatttgtcg；lsddrp引物的核苷酸序列如下：正向引物序列为aaactccctttcagcctcga，反向引物序列为agatgtggccctgttgagaa；提供内参基因lswd的引物，lswd引物的核苷酸序列如下：正向引物序列为tctgtggtactcgagaaggc；反向引物序列为gagaaatctccggtgtgtcgt；步骤4：qrt-pct分析将已合成的cdna溶液稀释5倍作为qrt-pcr的初始浓度；10μlqrt-pcr反应体系包含5μl的2×sybrpremixextaqtm溶液，0.5μl的cdna溶液，上下游检测引物(参考基因：lsipt或lsddrp；内参基因lswd)各0.15μl，3.9μl的rnasefreedh2o。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸15sec，40个循环；每个样品设置3次重复；若参考基因lsipt或lsddrp在待测瓠瓜叶片或果实中的表达模式为上调表达，表达量提高，则表明lswd适合作为cgmmv侵染瓠瓜叶片或果实的内参基因。本发明具有的有益技术效果为：表达稳定性高:本发明利用瓠瓜转录组数据，在全基因组水平上比较了cgmmv侵染后瓠瓜叶片和果实中基因的表达水平和稳定性，并从中筛选出了合适的新的内参基因，而传统的内参基因在转录组分析中表达水平和稳定性不高。因此，本发明获得的内参基因的表达稳定性要优于目前使用的传统内参基因。使用范围广：本发明分析了内参基因在瓠瓜叶片和果实2种不同组织及健康和感染cgmmv瓠瓜中的表达稳定性，获得的内参基因具有较广泛的适用性。附图说明图1是瓠瓜叶片和果实候选内参基因pcr扩增结果电泳图，其中，图a)表示叶片候选内参基因pcr扩增结果图；图b)表示叶片和果实共同候选内参基因pcr扩增结果图以及果实候选内参基因pcr扩增结果图。图2是瓠瓜叶片和果实候选内参基因的溶解曲线分析，其中a)图表示叶片和果实共同候选内参基因溶解曲线；b)图表示叶片候选内参基因溶解曲线；c)图表示果实候选内参基因溶解曲线。图3是瓠瓜叶片和果实候选内参基因在所有样品组中原始ct值分布箱形图，其中，图a)表示瓠瓜叶片候选内参基因原始ct值分布箱形图；图b)表示瓠瓜果实候选内参基因原始ct值分布箱形图；图c)表示瓠瓜叶片和果实共同候选内参基因原始ct值分布箱形图。图4是genorm分析cgmmv侵染瓠瓜叶片和果实共同候选内参基因稳定性m图。图5是genorm分析cgmmv侵染瓠瓜叶片和果实共同候选内参基因稳定性v图。图6是normfinder软件分析瓠瓜叶片和果实共同候选内参基因稳定性。图7是genorm分析cgmmv侵染瓠瓜叶片候选基因稳定性m图。图8是genorm分析cgmmv侵染瓠瓜叶片候选基因稳定性v图。图9是normfinder分析cgmmv侵染瓠瓜叶片中候选基因稳定性。图10是genorm分析cgmmv侵染瓠瓜果实中候选基因稳定性m图。图11是genorm分析cgmmv侵染瓠瓜果实中候选基因稳定性v图。图12是normfinder分析cgmmv侵染瓠瓜果实中候选基因稳定性。图13是qrt-pcr分析ipt和ddrp基因表达验证cgmmv侵染瓠瓜中筛选内参基因稳定性。图14是cgmmv侵染相关瓠瓜叶片和果实共同候选内参基因引物序列。图15是转录组数据中筛选的瓠瓜叶片和果实候选内参基因引物序列具体实施方式以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但不应理解为是对本发明保护范围进行的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1：内参基因的选择一、瓠瓜种植及样品采集瓠瓜品种“杭州长瓜”种植于浙江省农业科学院病毒学与生物技术所温室内富含有机质的土壤中，保持温度在20-25℃，每3天浇一次水，保持土壤湿度。在两叶一心期将cgmmv病汁液摩擦接种于展开的系统叶片，病汁液具体配制方法为：100mgcgmmv感病组织匀浆于20倍体积的pbs缓冲液中(0.1mpbs,ph7.5,0.2％sodiumsulfite和0.01m2-mercaptoethanol)，而对照健康植株仅用pbs缓冲液摩擦接种。其他管理按常规进行。收集cgmmv侵染的瓠瓜系统叶片、果实和健康瓠瓜系统叶片、果实用于rna抽提，每个处理设置3次生物学重复。瓠瓜叶片和果实样品采集后需立即置于液氮中，用于rna的提取或置于-70℃冰箱保存。二、总rna提取、第一链cdna合成利用trizol法(invitrogen,usa)分别提取待测瓠瓜和对照瓠瓜总rna，提取过程参照供应商的说明书进行。rna质量和浓度通过变性凝胶电泳及2100bioanalyzer(agilent,usa)进行检测。以抽提瓠瓜总rna为模板，应用primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)试剂盒，先去除基因组dna后再逆转录合成cdna,步骤参照试剂盒说明书进行。三、cgmmv侵染样品的检测采用takara公司的extaqdna聚合酶体系，以样品的cdna为模板，使用cgmmvmp的特异性检测引物进行pcr扩增检测，验证瓠瓜叶片cgmmv的侵染情况。具体地，正向引物cgmmv-mp-f(+):ctgttgcagagggaactata(seqidno.7)，反向引物cgmmv-mp-r(-):gctgaaataggaactttgtc(seqidno.8)。四、cgmmv侵染瓠瓜转录组数据中稳定表达内参基因筛选及常规内参基因的筛选1、cgmmv侵染前后瓠瓜叶片和果实共同内参筛选参数设置从获得的rnaseq数据中通过设置条件参数筛选出cgmmv侵染前后在叶片和果实中均稳定表达的瓠瓜内参基因。理想的内参基因应该在病毒感染下中度或高度表达，因此将瓠瓜转录组数据中的最小rpkm值设置为40(rpkm>40)，并且根据保守性，将瓠瓜中的变异系数cv设置为小于0.3，p值小于0.05(cv<0.3，p<0.05)，筛选仅有一个转录本的基因。共筛选到2个符合以上标准的候选内参基因，分别是：comp19078_c0，编码一个基因wdrepeat-containingprotein(其核苷酸序列如seqidno.2所示)和comp17031_c0，编码一个组蛋白h3.3基因(histoneh3.3，h3，其核苷酸序列如seqidno.1所示)。同时也筛选了14个常用的传统的葫芦科作物内参基因作为对照，分别为肌动蛋白7(actin-7,act7)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gapdh)、蛋白磷酸酶2a(phosphatasepp2acatalyticsubunit,pp2a)、小gtp水解酶(ran-gtpase，ran)、40s核糖体蛋白质s15-4，(40sribosomalproteins15-4,prs15)、tata结合蛋白(transcriptioninitiationfactortfiidtata-box-bindingprotein,tbp)、微管蛋白(tubulinalpha-3chain-like,tua)、肽基脯氨酰顺反异构酶cyp20-1(peptidyl-prolylcis-transisomerasecyp20-1，cyp20)、肽基脯氨酰顺反异构酶1(peptidyl-prolylcis-transisomerase,pin1)、60s核糖体蛋白l23a(60sribosomalproteinl23a,rpl23a)、泛素60s核糖体蛋白l40(ubiquitin-60sribosomalproteinl40，uba)、60s核糖体蛋白l23(60sribosomalproteinl23，rpl23)、adp-核糖基化因子(adpribosylationfactor，adp)和延伸因子1α(elongationfactor1α，ef1α)(kong,q.,gao,l.,cao,l.,liu,y.,saba,h.,huang,y.,etal.(2016).assessmentofsuitablereferencegenesforquantitativegeneexpressionstudiesinmelonfruits.front.plantsci.7:1178.doi:10.3389/fpls.2016.01178；kong,q.,yuan,j.,niu,p.,xie,j.,jiang,w.,huang,y.,etal.(2014).screeningsuitablereferencegenesfornormalizationinreversetranscriptionquantitativereal-timepcranalysisinmelon.plosone.9:e87197.doi:10.1371/journal.pone.0087197)，具体见表1。2、cgmmv侵染前后瓠瓜叶片转录组中优选的内参基因筛选参照上述的处理方法，叶片中的筛选条件为：将瓠瓜转录组数据中的最小rpkm值设置为40(rpkm>40)，并且根据保守性，将瓠瓜中的变异系数cv设置为小于0.3，p值小于0.05(cv<0.3，p<0.05)，筛选仅有一个转录本的基因，分别为lsarl、lstpt、lsstk、lscnx、lsp4hb、lsshaggy、lsubc、lsgad和lsrbp。3、cgmmv侵染前后瓠瓜果实转录组中优选的内参基因筛选参照上述的处理方法，果实中的筛选条件为：最小rpkm值设置为40(rpkm>40)，变异系数cv设置为小于0.3，p值小于0.05(cv<0.3，p<0.05)，筛选仅有一个转录本的基因，分别为lsbtb/poz、lsp4h、lsxrn1、lsparp、lshd、lseif5al1、lsvamp、lspla、lsiscu、lsclpc和lscbrlk。实施例2：cgmmv侵染瓠瓜内参基因实时荧光定量pcr设计和常规pcr检测一、定量引物的设计使用在线引物设计程序primer3.0设计内参定量引物，主要设计参数包括：扩增片段长度范围为80-250bp，定量引物tm值设置为58℃-64℃，引物gc含量范围为45％-55％。cgmmv侵染相关瓠瓜叶片和果实共同候选内参基因分别为lsh3、lswd、lsact、lsuba52、lsprl23、lsran、lspp2a、lsgapdh、lsef1α、lsadp、lstua、lstbp、lsrps15、lscyp20、lscyp和lsl23a，设计的引物序列见图14所示；转录组数据中筛选的瓠瓜叶片候选内参基因为lsarl、lstpt、lsstk、lscnx、lsp4hb、lsshaggy、lsubc、lsgad和lsrbp，瓠瓜果实候选内参基因为lsbtb/poz、lsp4h、lsxrn1、lsparp、lshd、lseif5al1、lsvamp、lspla、lsiscu、lsclpc和lscbrlk，设计的引物序列见图15所示，设计的引物由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成。二、筛选的内参基因序列片段扩增为确定设计的定量引物的特异性，用上述设计好的定量引物以瓠瓜叶片和果实cdna为模板，采用takara公司的extaqdna聚合酶体系进行常规pcr扩增，具体反应体系和pcr反应流程参照试剂盒说明书进行。同时，为了鉴定rna中的基因组dna是否去除完全，以健康瓠瓜叶片和果实cdna对照为模板，进行常规pcr扩增。将pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示；由图1可知，pcr扩增出的候选内参基因条带明亮，单一，片段大小与预期相符，说明设计的rt-qpcr引物的特异性良好，可继续下游的实时荧光定量pcr引物验证。以瓠瓜叶片和果实的对照cdna为模板未扩增出条带，说明rna中的基因组dna去除完全。进一步将扩增的pcr产物切胶回收，与载体连接检测后送基因检测公司测序，测序结果与转录组数据集中候选内参基因序列相一致，表明这些基因确实在瓠瓜中稳定存在。实施例3实时荧光定量pcr引物验证以瓠瓜叶片和果实cdna为模板，用设计的定量引物在abiprism7900htfast型荧光定量pcr仪进行rt-qpcr扩增，pcr反应的反应体系与反应程序如下：反应体系为：2×sybrgreenmastermix,5μl，上下游检测引物各0.15μl(图14和图15所列的内参基因)，cdna0.5μl，rnasefreedh2o4.2μl。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，共40个循环。根据qrt-pcr分析获得溶解曲线如图2所示，从图2可知，所有候选内参基因的溶解曲线均呈单峰状态，证明定量引物特异性良好。实施例4实时荧光定量pcr分析实时荧光定量pcr反应采用toyobo的sybrgreenrealtimepcrmastermix荧光染料，在abiprism7900htfast型荧光定量pcr仪上进行。rt-qpcr反应采用10μl上样体系，体系如下：2×sybrgreenmastermix,5μl，上下游检测引物各0.15μl(图14和图15所列的内参基因)，cdna0.5μl，rnasefreedh2o4.2μl。荧光定量pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸15sec，40个循环；在72℃延伸结束后采集信号，添加溶解曲线。每个样品有3个技术重复。基于绝对定量的rt-qpcr分析制作标准曲线时，将cdna模板依次稀释6个梯度，分别为1︰1、1︰4、1︰16、1︰64、1︰256、1︰1024，根据荧光定量pcr结果，以初始模板的log值为横坐标，以得到的ct值作为纵坐标绘制标准曲线，并获得曲线的回归方程。基因的扩增效率e根据计算公式：e(％)＝(10-1/slope-1)×100获得。以稀释5倍的cdna为模板进行荧光定量pcr，每个样品需设置3个生物学重复，获得的ct值进行下一步的分析。通过荧光定量pcr分析获得引物扩增效率(e)、解链温度(tm)等参数列于表1和表2。从结果可知，各内参基因扩增效率为90％-120％，各基因的r2≥0.98，说明扩增效率较好。表1：cgmmv侵染相关瓠瓜叶片和果实共同候选内参基因扩增信息表2：转录组数据中筛选的瓠瓜叶片和果实候选内参基因扩增信息实施例5：候选内参基因的表达丰度和表达稳定性分析一、候选内参基因的表达丰度分析对所有候选内参基因的表达丰度进行分析，基因表达的mrna含量越高，获得的ct值越低，反之，mrna含量越低，获得的ct值越高。瓠瓜叶片的ct值范围从16.51到25.63，其中cyp的表达量最高，ct值为16.51，tbp的表达量最低，ct值为25.63。从图3a可知，在瓠瓜叶片中表达量变异最小的基因是ubc基因。瓠瓜果实的ct值范围从20.94到28.88，其中h3的表达量最高，ct值为20.94，tbp的表达量最低，ct值为28.88。从图3b可知，在瓠瓜果实中表达量变异最小的基因是pla。从图3c可知，在瓠瓜果实和叶片中共同表达变异最小的内参基因是act,adp和wd。二、候选内参基因的表达稳定性分析将通过荧光定量rt-qpcr得到的ct值用excel进行整理，采用4种不同的分析软件deltact，genorm，normfinder和reffinder对候选内参基因进行稳定性分析，从而挑选出更适合于瓠瓜叶片和果实荧光定量分析的内参基因。1、瓠瓜叶片和果实共同内参基因稳定性分析(1)deltact分析deltact分析结果表明在cgmmv侵染下，瓠瓜叶片和果实中共有候选内参基因稳定性排序为：wd>tbp>gapdh>h3>ef1α>l23a>cyp20>tua>pp2a>ran>prs15>uba52>prl23>adp>act>cyp,其中wd、tbp、gapdh稳定性相对较好。(2)genorm分析采用genorm软件分析结果表明，在cgmmv侵染下，瓠瓜叶片和果实中共有候选内参基因稳定性排序为：h3＝gapdh>wd>ef1α>cyp20>act7>adp>pp2a>tbp>ran>tua>l23a>prs15>uba52>prl23>cyp(表3)。16个瓠瓜叶片和果实共同内参候选基因的m值均低于1.5(图4)，vn/vn+1都小于默认v值0.15(图5)，符合genorm软件筛选标准，且不需引物新的内参基因。数据结果表明，在16个瓠瓜叶片和果实共同内参候选基因的综合分析中，h3、gadph和wd为候选基因中稳定性较好的内参基因。表3用genorm计算的叶片和果实共同候选内参基因的稳定值及排序(3)normfinder分析normfinder分析备选基因的稳定性排序为：tbp>wd>gapdh>ef1α>h3>l23a>tua>cyp20>ran>pp2a>prs15>uba52>prl23>adp>act>cyp,其中tbp和wd是16个瓠瓜候选内参基因最稳定的(图6)。进一步地，将瓠瓜叶片和果实样品分为健康对照与cgmmv侵染两组进行normfinder分析，数据结果表明：在16个瓠瓜叶片和果实共同内参候选基因中，uba52具有最低的组间变异，tbp具有最低的组内变异；tbp为候选基因中最稳定的内参基因(stabilityvalue值为0.079)；同时，wd和tbp可作为两个最佳的组合参考基因，具有最小的组间和最内组合变化；cyp为最不稳定的参考基因。(4)reffinder分析reffinder软件综合分析备选基因的稳定性：wd>gapdh>h3>tbp>ef1α>act>cyp20>adp>l23a>pp2a>tua>ran>prs15>uba52>prl23>cyp，其中wd、gapdh和h3相对最稳定。综合上述分析结果，上述16个基因中优选的内参基因为wd和h3，其次为常用的内参基因gapdh，可作为瓠瓜叶片和果实共同内参基因。2、cgmmv侵染前后瓠瓜叶片内参基因稳定性分析(1)deltact分析deltact分析结果表明在cgmmv侵染下，瓠瓜叶片候选内参基因稳定性排序为：cyp>h3>pp2a>tbp>p4hb>stk>tpt>wd>arl>rbp>shaggy>adp>cnx>prs15>ubc>gad>ef1α>prl23,其中cyp、h3、pp2a稳定性相对较好。(2)genorm分析采用genorm软件分析结果表明，在cgmmv侵染下，瓠瓜叶片候选内参基因稳定性排序为：cyp＝tbp>h3>wd>arl>pp2a>stk>shaggy>adp>p4hb>tpt>rbp>ubc>gad>cnx>prs15>ef1α>prl23(表4)。18个瓠瓜叶片内参候选基因的m值均低于1.5(图7)，vn/vn+1都小于默认v值0.15(图8)，符合genorm软件筛选标准，且不需引物新的内参基因。数据结果表明，在18个瓠瓜叶片和果实共同内参候选基因的综合分析中，其中tbp、cyp、h3为候选基因中最稳定的内参基因。表4用genorm计算的叶片候选内参基因的稳定值及排序(3)normfinder分析将瓠瓜叶片样品分为健康对照与cgmmv侵染两组进行normfinder分析，数据结果表明normfinder分析备选基因的稳定性排序为：cyp>h3>pp2a>tbp>p4hb>stk>rbp>tpt>arl>wd>shaggy>adp>cnx＝prs15>ef1α>ubc>gad>prl23，在18个瓠瓜叶片内参候选基因中，h3具有最低的组间变异，cyp具有最低的组内变异；cyp为候选基因中最稳定的内参基因(stabilityvalue值为0.106),其中cyp，h3和pp2a是18个瓠瓜叶片候选内参基因最稳定的,rpl23为最不稳定的参考基因(图9)。(4)reffinder分析reffinder软件综合分析cgmmv侵染情况下转录组中筛选叶片备选基因的稳定性排名为：cyp>h3>tbp>pp2a>stk>arl>wd>p4bh>ubc>shaggy>tpt>gad>adp>rbp>cnx>prs15>ef1α>prl23，其中cyp,h3和tbp相对最稳定。综合上述分析结果，cgmmv侵染瓠瓜叶片候选的18个内参基因中最合适的为cyp，其次为h3和tbp。3、全基因组筛选cgmmv侵染前后瓠瓜果实内参基因(1)deltact分析deltact分析结果表明在cgmmv侵染下，瓠瓜果实候选内参基因稳定性排序为：p4h>tbp>xrn1>adp>vamp>h3>iscu>hd>rarp>wd>eif5al1>btb/poz>cbrlk>pp2a>clpc>gapdh>tua>pla,其中p4h、tbp、xrn1稳定性相对较好。(2)genorm分析采用genorm软件分析结果表明，在cgmmv侵染下，瓠瓜果实中共有候选内参基因稳定性排序为：p4h＝vamp>tbp>adp>hd>xrn1>eif5al1>iscu>h3>btb/poz>wd>parp>cbrlk>pp2a>clpc>gapdh>tua>pla(表5)。18个瓠瓜叶片内参候选基因的m值均低于1.5(图10)，vn/vn+1都小于默认v值0.15(图11)，符合genorm软件筛选标准，且不需引物新的内参基因。数据结果表明，在18个瓠瓜叶片和果实共同内参候选基因的综合分析中，其中p4h、vamp、tbp为候选基因中最稳定的内参基因。表5用genorm计算的果实候选内参基因的稳定值及排序稳定性排序基因名称稳定值(m)1lsp4h0.2122lsvamp0.2123lstbp0.2454lsadp0.2665lshd0.2846lsxrn10.3047lseif5al10.3378lsiscu0.3549lsh30.37110lsbtb/poz0.38911lswd0.40212lsparp0.41513lscbrlk0.42714lspp2a0.43915lsclpc0.45416lsgapdh0.47417lstua0.49418lspla0.531(3)normfinder分析normfinder分析备选基因的稳定性排序为：tbp>p4h>xrn1>adp>vamp>h3>iscu>wd＝hd>cbrlk>parp>eif5al1>clpc>btb/poz>pp2a>tua>gapdh>pla，其中tbp，p4h和xrn1是18个瓠瓜果实候选内参基因最稳定的(图12)。(4)reffinder分析reffinder软件综合分析cgmmv侵染前后瓠瓜果实中备选基因的稳定性排名：p4h>adp>tbp>vamp>xrn1>h3>eif5al1>hd>iscu>wd>cbrlk>parp>btb/poz>pla>pp2a>clpc>gapdh>tua，其中p4h、adp和tbp相对最稳定。实施例6黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜叶片或果实qrt-pcr分析参考基因lsipt或lsddrp的表达情况根据上述的分析，我们对叶片和果实中稳定性排名靠前的lstbp,lswd,lsh3,lsgapdh和lscyp基因，以及在果实中表达稳定的lsp4h基因进行评判，验证其在cgmmv侵染前后瓠瓜中的稳定性。分别选取lsipt和lsddrp作为验证内参基因稳定性的参考基因。lsipt基因引物的核苷酸序列如下所示，具体地，正向引物序列为gcactccaatggctcgttta，反向引物序列为ggtcgatggtggatttgtcg；lsddrp基因引物的核苷酸序列如下所示，具体地，正向引物序列为aaactccctttcagcctcga，反向引物序列为agatgtggccctgttgagaa。按照上述实施例1中的方法进行总rna的分离，第一链cdna的合成。qrt-pcr分析按照上述实施例4所述方法进行，反应体系：2×sybrgreenmastermix,5μl，上下游检测引物(参考基因：lsipt或lsddrp；内参基因：lstbp,lswd,lsh3,lsgapdh，lscyp或lsp4h)各0.15μl，cdna0.5μl，rnasefreedh2o3.9μl。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，共40个循环。转录组数据分析表明，相对于健康对照，cgmmv侵染的瓠瓜中lsipt在叶片中表达水平上调了1.78倍，在果实中下调了1.2倍。而lsddrp在叶片中上调了1.4倍，在果实中上调了1.63倍。在叶片中，用lswd作为叶片内参基因时，lsipt相对于对照增加了2.75倍，以lsgapdh,lsh3,lscyp和lstbp为内参基因时，lsipt相对于对照分别增加了2.95,3.82,3.93,4.43倍。在果实中，以lstbp,lswd,lsh3,lsgapdh,lscyp和lsp4h为内参基因，对lsipt的表达量均一化后进行检测，发现其相对于对照下降0.54，0.52，0.60，0.57，0.59，0.56倍(图13)。而在叶片中，分别以lswd,lsgapdh,lsh3,lscyp和lstbp为内参，检测lsddrp的的表达，结果表明，均一化后其相对于对照分别上调了1.78,1.95,2.51,2.57和2.88倍(图13)。在果实中，分别以lswd,lstbp,lsh3,lsgapdh,lsp4h和lscyp为内参，检测lsddrp的的表达，结果表明，均一化后其相对于对照分别上调了1.42,1.53,1.60,1.62,1.80和2.31倍(图13)。qrt-pcr分析的结果表明用这些候选基因定量分析的结果与转录组数据趋势一致。比较均一化的表达水平和转录组数据及荧光定量pcr的结果，分析表明lswd,lsgapdh和lsh3适用于作为cgmmv侵染瓠瓜的叶片和果实的共同内参基因。lscyp,lsh3和lstbp适合作为cgmmv侵染瓠瓜叶片的内参基因，lsp4h,lsadp和lstbp适合作为cgmmv侵染瓠瓜果实的内参基因。序列表<110>浙江省农业科学院<120>lswd在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染下瓠瓜分析中作为内参基因的用途<130>18-100070-00004993<141>2018-05-04<160>80<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>101<212>dna<213>瓠瓜(lagenariasiceraria)<400>1caaactgcccgtaagtccaccggaggaaaggctccaaggaagcagctggccacaaaggct60gctcgtaagtctgccccaaccacaggaggagtgaagaagcc101<210>2<211>95<212>dna<213>瓠瓜(lagenariasiceraria)<400>2tctgtggtactcgagaaggctaccatatgttcgatcccatactccaatgaaaagtgattc60tgtgtctggactaaacgacacaccggagatttctc95<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3caaactgcccgtaagtccac20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggcttcttcactcctcctgt20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tctgtggtactcgagaaggc20<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gagaaatctccggtgtgtcgt21<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ctgttgcagagggaactata20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gctgaaataggaactttgtc20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ggcagtggttgtgaacatgt20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cccatgctatcctccgtctt20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11aagtgtggacacagcaacca20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gggaaagagccaaaaatagg20<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13catgaccatatcaccaacacaa22<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14cgacaatacaggagctaagaa21<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15tctactgttgggataccgct20<210>16<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16cagagatcacgatgccatgtt21<210>17<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17ggcagataactcaagtttatgga23<210>18<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gctgtaagaggtaaataatcaaagagg27<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19cccaggggatatctgcaggg20<210>20<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20catggtgttttcaatggaacca22<210>21<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21ctgcttgctcctgcgtgaaa20<210>22<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22ccacgatgttgatgtgaatcttctc25<210>23<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23atattgccaacaaggcgtaga21<210>24<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24tgcccgtaaacaatggacaaa21<210>25<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25aggactgggacgtaccgaca20<210>26<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26cggctaattttcgcactcgg20<210>27<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27aaactcttcccgcttcctca20<210>28<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28agccttgatctgccattcct20<210>29<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29agtcctcttcttcggcactc20<210>30<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30tccactcgaaaccctagcag20<210>31<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31tttaccctcggcgatggaag20<210>32<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32tgtgaaccatttgtatctgga21<210>33<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33cacaccggccctggtatttt20<210>34<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34catccatgccttcaacgact20<210>35<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35aaggatgccgtgaagaagatgt22<210>36<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36gcatcgtagtcaggagtcaacc22<210>37<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37gcactccaatggctcgttta20<210>38<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38ggtcgatggtggatttgtcg20<210>39<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39aaactccctttcagcctcga20<210>40<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40agatgtggccctgttgagaa20<210>41<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41gctggtcgaaagttgactcc20<210>42<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42gtcaaggccaaagagtaggca21<210>43<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43accacctacgattggcagaag21<210>44<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44gtctgggaaaagtggcggtat21<210>45<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45ttgaccactacccatcttgca21<210>46<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>46gcgagcctcatcctcactaa20<210>47<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>47tcgctctctcatcccaatcc20<210>48<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>48gtgcgcattctcattgatggg21<210>49<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>49aggcccactttgcttcttcaa21<210>50<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>50gagcagtcatgaccctccaat21<210>51<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>51cttgcttcacgtctgcttcaa21<210>52<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>52gttgttagggaggcggacatt21<210>53<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>53cacttggtgcttcgtctcag20<210>54<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>54tcgatcgtgtcagagctctc20<210>55<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>55tgtcatagggcttgccttcag21<210>56<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>56cattgggtgatgctgagacg20<210>57<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>57tacatcttcaagttgcctgcgt22<210>58<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>58ccagaagtgtaccgggttct20<210>59<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>59ctccccaatgcaaaagctgac21<210>60<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>60gaggtgctgttcgacccttaa21<210>61<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>61agagagagagaggccttgga20<210>62<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>62cctgtgtttcgccatggaaac21<210>63<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>63accttccagatcacaccagg20<210>64<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>64aggcctcacagttcctcttc20<210>65<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>65ttggagtcttcagggagctg20<210>66<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>66tcctcttgaacgtggggtac20<210>67<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>67atggcgaaaagagaaacggtg21<210>68<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>68gaaggatcatgtgacgcgtc20<210>69<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>69gcagccaatagtctcagcac20<210>70<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>70gtagttcaaagtggagggcgt21<210>71<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>71aaccttcgatctcaggcacaa21<210>72<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>72cgccgcagacagacaaaatga21<210>73<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>73cgaatgggactctgctttgg20<210>74<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>74tattccgacgaaatccatccg21<210>75<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>75atggcagcttcttcgtcttcc21<210>76<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>76tggcgctgttgaagaagttgt21<210>77<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>77tgtggatgttgattctgatgga22<210>78<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>78acaggttacacaggaatagcatc23<210>79<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>79accgactgtccctttcacttg21<210>80<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>80gtggcggattttggatttgcaa22当前第1页12当前第1页12