本发明涉及兽医生物病毒检测
技术领域：
，具体涉及一种鸽i型副粘病毒的rt-pcr检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：鸽i型副粘病毒病是由鸽副黏病毒引起的一种高度接触性、败血性传染病，俗称“鸽瘟”，具有与新城疫病原类似的特性。各种品种、年龄、性别的鸽都易感，发病没有明显的季节性，一年四季都有发生。鸽被i型副黏病毒感染后，潜伏期1-10天，通常1-5天。病鸽表现扭头、曲颈、转圈，有的不能站立,有的翅下垂，有的蹲伏或侧卧。食欲下降，嗉囊空虚，充满液体或气体，倒提口流黏液。拉黄绿色稀便，鸽的羽毛、趾爪常被粪便污染为黄绿色。目前此病无有效的药品。由于该病的死亡率一般可达20％-80％，对养鸽业危害极大，故建立一种鸽i型副粘病毒的反转录pcr诊断方法和专用试剂盒，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸽i型副粘病毒的rt-pcr检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒能够快速区分鸽i型副粘病毒。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种鸽i型副粘病毒的rt-pcr检测试剂盒，所述的引物组包括引物s1、s2、s3，其中：s1：5’-aaggcttaggctagcttaccat-3’；s2：5’-caaggtagctgagtcgacctgtatg-3’；s3：5’-ataagggctgagtcgactgat-3’。一种所述的引物组在制备用于鸽i型副粘病毒鉴别诊断试剂盒中的应用。一种所述的引物组的鸽i型副粘病毒鉴别诊断试剂盒。所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、反转录试剂、pcr扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。所述的反转录试剂包括10×m-mlv缓冲液、dntp、m-mlv反转录酶、rnase酶抑制剂、s2引物。所述的pcr扩增试剂包括10×pcr扩增缓冲液、dntp、s1引物、s2引物、taqdna聚合酶和双蒸水。所述的pcr扩增试剂所构建的pcr扩增体系为：10×pcr扩增缓冲液5.0μl、2.5mmol/ldntp8.0μl、10mmol/ls1引物1.0μl、10mmol/ls2引物1.0μl、5u/μltaqdna聚合酶1.0μl、模板3.0μl，补加双蒸水至50μl。一种所述的试剂盒的使用方法，包括核酸提取、反转录、pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳。所述的pcr扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。本发明的有益效果：本发明通过比对鸽i型副粘病毒的差异，设计特异性引物s1、s2、s3，能够对鸽i型副粘病毒进行特异性扩增；在此基础上研制了专用试剂盒，先提取病毒rna，再使用s2引物反转录合成cdna，并采用rt-pcr方法鉴别检测鸽i型副粘病毒。与现有技术相比，本发明的专用试剂盒具有很强的敏感性，能够广泛用于临床鸽i型副粘病毒的鉴别诊断。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂所建议的条件与实施步骤。实施例1、鉴别诊断方法的构建1、引物设计设计两条特异性引物，具体如下:s1：5’-aaggcttaggctagcttaccat-3’(seqidno.1)s2：5’-caaggtagctgagtcgacctgtatg-3’(seqidno.2)s3：5’-ataagggctgagtcgactgat-3’(seqidno.3)使用s1、s2和s3进行pcr扩增，疫苗株预期扩增片段大小为836bp，现地分离株预期扩增片段大小为578bp。2、病毒rna的提取取毒株细胞培养液，反复冻融3次后，5000g离心15min，取上清备用。(1)取0.2ml氯仿，加入等体积的上清，剧烈摇晃15s，室温放置3min，然后12，000g，4℃离心5min。离心后分成3层，最下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，上层是无色的水相，rna存在于水相中；(2)将步骤(1)中的上层水相转移到另一只干净的ep管中，加入0.5ml预冷的异丙醇，室温静置10min，然后12,000g，4℃离心10min；(3)倒掉上清，加入1ml体积分数75％乙醇洗涤rna沉淀，混匀后，7500g，4℃离心5min；(4)倒掉上清，室温放置10min，然后加入适量无rnase水溶解rna，即得到总rna。3、反转录以步骤2提取的rna为模板，进行反转录，获得cdna，反转录反应体系为：模板rna4.9μls2引物(10mmol/l)0.3μlrtase酶抑制剂(40u/μl)0.3μlm-mlv反转录酶(200u/μl)0.5μldntp(2.5mmol/l)2.0μl10×m-mlv缓冲液2.0μl反应条件为：42℃保温60min，70℃10min。4、聚合酶链式反应(pcr)4.1pcr反应体系以步骤3获得的cdna为模板，进行pcr扩增，pcr反应体系为：dntp(2.5mmol/l)8.0μl10×pcr扩增缓冲液5μls1引物(10mmol/l)1.0μls2引物(10mmol/l)1.0μls3引物(10mmol/l)1.0μlcdna3.0μltaqdna聚合酶(5u/μl)1.0μlddh2o至50μl4.2pcr反应条件优化对疫苗株的pcr反应条件进行优化，分别以退火温度为54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃进行pcr反应扩增疫苗株，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。发现在57和62℃可以扩增出836bp大小的片段，与预期大小一致。对现地分离株的pcr反应条件进行优化，分别以退火温度为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃进行pcr反应扩增现地分离株，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。发现在57℃出现578bp大小的片段，与预期大小一致。综合上述反应，本发明最终将复合pcr的退火温度设置为57℃，优化后的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物置于-20℃保存。5、电泳对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，电压100v，电泳40min，在dna凝胶成像系统仪下观察结果。本发明的专用试剂盒包括上述检测方法中所用的核酸提取试剂、反转录试剂、pcr扩增试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂。实施例2、灵敏度实验将现地分离株病毒液进行10倍梯度稀释，使病毒浓度为5.4×104-5.4×10-4copies/μl，并按照实施例1的方法进行检测，结果表明，在第8泳道浓度为5.4×10-3copies/μl可扩增出预期片段，本发明的引物和检测方法的最低核酸检测量为5.4×10-3copies/μl，但第9泳道5.4×10-4copies/μl无预期大小的片段，判断其灵敏度为5.4×10-3copies/μl。将疫苗株病毒液进行10倍梯度稀释，使病毒浓度为1.5×104-1.0×10-4copies/μl，并按照实施例1的方法进行检测，结果表明，在第8泳道浓度为1.5×10-3copies/μl可扩增出预期片段，本发明的引物和检测方法的最低核酸检测量为1.5×10-3copies/μl，但第9泳道1.5×10-4copies/μl无预期大小的片段，判断其灵敏度为1.5×10-3copies/μl。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。序列表<110>张朝明、严裕舟、张胜辉、李文得<120>一种鸽i型副粘病毒的rt-pcr检测试剂盒及其检测方法<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aaggcttaggctagcttaccat22<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2caaggtagctgagtcgacctgtatg25<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ataagggctgagtcgactgat21当前第1页12