本发明属于食品领域，特别涉及一种除镉益生菌吸附剂的制备方法及其在蔬菜汁中的应用。
背景技术：
随着工农业的迅速发展，采矿废水、电镀和电池的工业污水未处理或处理不达标的污水灌溉，施用含有镉元素的施肥和含有镉污染的工业废气经雨淋和自然沉降等方式进入土壤。土壤的镉通过植被根部吸收作用进入植物并累积到蔬菜中。镉是联合国粮农组织(fao)和世界卫生组织(who)公布的人体毒性最强的3种重金属(铅、镉、汞)中的1种，在人体内沉积潜伏可长达10～30年。镉慢性中毒最容易导致肾脏和肝等器官发生病变，还可引发骨痛病、高血压、糖尿病、贫血、肿瘤等，长期摄入镉会有一定的致癌症，对儿童健康的危害尤其大。
目前，去除镉的方法主要有：一、物理法。此法应用低频超声波、冷热水交换和吸附等技术，并辅助以抛光去表皮、清洗和漂洗等处理手段清除镉，由于蔬菜种类不同，对镉离子的结合能力不同，物理法的清除能力有限；二、化学法。该法应用树脂、单宁、柠檬酸钠和草酸钠等试剂通过有机捕、等离子交换、形成络合物、螯合作用和微量沉淀等方法除去食品中的镉，但是一些有毒化学试剂的使用可能会在食品中形成残留危害人类健康；三、生物法。该法主要是通过植物及其提取物、真菌和细菌等微生物的吸附或蓄积作用清除食品中的镉，生物法具有安全、无残留、无污染的优势。
研究表明乳酸菌对水、粮食、水果和蔬菜等食品中的镉具有清除作用，其可能的作用机制为依靠细胞表面吸附作用将未经代谢的游离镉离子通过正负电荷结合到细胞壁表面，细胞壁主要由肽聚糖、磷壁酸和中性多糖等组成，磷壁酸和多糖形成的网状结构有利于粘着和吸附镉。乳酸菌细胞表面的蛋白质拥有大量带负电荷的官能团，能够有效结合金属阳离子。乳酸菌代谢产生的乳酸所形成的酸性环境对镉络合物具有增溶作用，乳酸菌代谢形成的多糖、多肽和核酸等大分子物质表面带有coo-、hpo4-和oh-等基团，可与镉离子发生静电吸附作用，如lactobacillusbrevis细胞表面的s-layer蛋白具有结合cd2+的能力。目前发现能去除镉的乳酸菌主要包括lactobacillus、pediococcus、enterococcus和bifidobacterium等属。bhakta等从鱼肠道中筛选出具有良好粘着力菌株l.reutericd70-13，对mrs培养基中的镉清除率为25％。zhai等利用菌株lactobacillusplantarumccfm8610可有效清除初浓度5mg/lcd水溶液中31.34％的镉。halttunen等研究发现菌株bifidobacteriumlongum46能够清除水中干重54.7mg/g的镉。topcu等研究表明菌株e.faeciumef031和e.faeciumm74能有效清除水中镉，清除范围分别为77.3％～98.1％和53.5％～91.0％。halttunen等研究发现菌株l.rhamnosusgg通过细胞表面静电吸附作用清除磷酸盐缓冲液(pbs)中22.1％～49.1％的镉。fu等应用l.plantarum和p.pentosaceus按2:1混合后，以3％接种量，在40.8℃下发酵23.4h可有效除去大米中85.73％的镉。目前采用乳酸菌去除果汁中镉的研究不多，因此筛选能耐受镉和去除果汁中重金属镉的益生菌吸附剂很有必要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种除镉益生菌吸附剂的制备方法及其在蔬菜汁中的应用。
为了实现上述目的，本发明除镉益生菌吸附剂的制备方法如下：
1)复合冻干保护剂的制备
按每20g加入0.5-2g的果胶，3-5g的壳聚糖、0.3-0.8g的沸石和12.2-16.2g的蒸馏水混合得到复合冻干保护剂；
2)益生菌菌粉的制备
将新鲜拐枣经洗净后打浆，并向拐枣浆中加入拐枣质量0.08％的活性为30000u/g的果胶酶、0.15％的活性8000u/g的纤维素酶添和0.75％的活性为10000u/g的半纤维素酶于60℃保温2-3h，然后抽滤获得拐枣汁，再向拐枣汁中按每升拐枣汁加入2～5g/l的酪蛋白胨、1.5-2.0g/l的菊糖后于121℃灭菌20分钟，冷却至38-40℃后加入膜过滤的亮氨酸和小牛血清，使亮氨酸和小牛血清的终浓度分别为10～16mg/l和1-3g/l、后按体积比接入1-5％的已活化的乳杆菌，于37℃恒温培养20-24h，然后冷冻离心收集菌体得益生菌菌粉；
3)向益生菌菌粉中加入1-3倍重量的复合冻干保护剂，用漩涡仪混合均匀，然后采用真空冷冻干燥20-24h，得到活菌数为1.2×1011cfu/g-6.5×1011cfu/g的益生菌吸附剂。
所述的乳杆菌为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的一种或两种。
按本发明制备方法制得的益生菌吸附剂在蔬菜汁中除镉的应用：
首先将新鲜水蔬菜清洗、除梗、榨汁处理后按照1：2质量比加水，然后离心去除沉淀，于高压蒸汽灭菌锅中105℃下灭菌10min，离心除去热凝固物，添加镉盐，使镉浓度为2-5mg/l，再将蔬菜汁ph调至6～7，然后将益生菌吸附剂添加至蔬菜汁中，添加量为1-5g/l，然后于37℃下静置吸附除镉2～4h，镉去除率为95-100％，然后冷冻离心，即得无镉蔬菜汁和含镉的乳杆菌菌泥。
所述的蔬菜汁为芹菜汁、黄瓜汁、西红柿汁、南瓜汁、菠菜汁、胡萝卜汁、圆白菜汁。
所述的含镉的乳杆菌菌泥循环利用，将其悬浮到生理盐水中，然后调节ph为2.5-4.0，室温静置0.5-1h后离心将吸附的镉释放至上清液中，沉淀为益生菌吸附剂。
本发明循环处理后的益生菌吸附剂可再次添加到蔬菜汁中循环利用除镉，循环5次后，将益生菌菌泥用于饲料添加剂。
发明的效果
1)利用公认安全(gras)的微生物—乳杆菌为除镉剂，既解决了蔬菜汁的重金属污染和安全饮用问题，而且实施起来方便，快捷，高效。
2)将乳杆菌添加到蔬菜汁中适度发酵产生的乳酸可增加蔬菜汁的风味物质，增强口感。
3)复合冻干保护剂中添加的果胶、壳聚糖和沸石对镉也具有吸附镉的能力，协同益生菌除镉能力更强。
4)在蔬菜汁中镉浓度为2-5mg/l时，镉去除率超过95％。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明：
实施例1：
1)复合冻干保护剂的制备
按每20g加入2g的果胶，5g的壳聚糖、0.8g的沸石和12.2g的蒸馏水混合得到复合冻干保护剂；
2)益生菌菌粉的制备
将新鲜拐枣经洗净后打浆，并向拐枣浆中加入拐枣质量0.08％的活性为30000u/g的果胶酶、0.15％的活性8000u/g的纤维素酶添和0.75％的活性为10000u/g的半纤维素酶于60℃保温2h，然后抽滤获得拐枣汁，再向拐枣汁中按每升拐枣汁加入2g/l的酪蛋白胨、1.5g/l的菊糖后于121℃灭菌20分钟，冷却至38℃后加入膜过滤的亮氨酸和小牛血清，使亮氨酸和小牛血清的终浓度分别为10mg/l和1g/l、后按体积比接入2％的已活化的嗜酸乳杆菌菌种，于37℃恒温培养20h，然后冷冻离心收集菌体得益生菌菌粉；
3)向益生菌菌粉中加入3倍重量的复合冻干保护剂，用漩涡仪混合均匀，然后采用真空冷冻干燥20h，得到活菌数为1.2×1011cfu/g的益生菌吸附剂。
益生菌吸附剂在蔬菜汁中除镉的应用，：首先将新鲜芹菜清洗、除梗、榨汁处理后按照1：2质量比加水，然后离心去除沉淀，于高压蒸汽灭菌锅中105℃下灭菌10min，离心除去热凝固物，添加镉盐，使镉浓度为5mg/l，再将蔬菜汁ph调至6，然后将益生菌吸附剂添加至果汁中，添加量为1g/l，然后于37℃下静置吸附除镉4h，镉去除率为95％，然后冷冻离心，即得无镉蔬菜汁和含镉的乳杆菌菌泥。
将得到的含镉的乳杆菌菌泥悬浮到生理盐水中，然后调节ph为2.5，室温静置0.5h后离心(8000rpm，10min)将吸附的镉释放至上清液中，沉淀为益生菌吸附剂，将其再次添加到蔬菜汁中循环利用除镉，循环5次后，将益生菌菌泥用于饲料添加剂。
实施例2：
1)复合冻干保护剂的制备
按每20g加入0.5g的果胶，3.5g的壳聚糖、0.5g的沸石和15.5g的蒸馏水混合得到复合冻干保护剂；
2)益生菌菌粉的制备
将新鲜拐枣经洗净后打浆，并向拐枣浆中加入拐枣质量0.08％的活性为30000u/g的果胶酶、0.15％的活性8000u/g的纤维素酶添和0.75％的活性为10000u/g的半纤维素酶于60℃保温2.5h，然后抽滤获得拐枣汁，再向拐枣汁中按每升拐枣汁加入3g/l的酪蛋白胨、1.6g/l的菊糖后于121℃灭菌20分钟，冷却至40℃后加入膜过滤的亮氨酸和小牛血清，使亮氨酸和小牛血清的终浓度分别为12mg/l和1.5g/l、后按体积比接入2.5％的已活化的鼠李糖乳杆菌菌种，于37℃恒温培养22h，然后冷冻离心收集菌体得益生菌菌粉；
3)向益生菌菌粉中加入1倍重量的复合冻干保护剂，用漩涡仪混合均匀，然后采用真空冷冻干燥20h，得到活菌数为1.6×1011cfu/g的益生菌吸附剂。
益生菌吸附剂在蔬菜汁中除镉的应用，：首先将新鲜黄瓜清洗、除梗、榨汁处理后按照1：2质量比加水，然后离心去除沉淀，于高压蒸汽灭菌锅中105℃下灭菌10min，离心除去热凝固物，添加镉盐，使镉浓度为2mg/l，再将蔬菜汁ph调至6.5，然后将益生菌吸附剂添加至蔬菜汁中，添加量为3g/l，然后于37℃下静置吸附除镉3h，镉去除率为100％，然后冷冻离心，即得无镉蔬菜汁和含镉的乳杆菌菌泥。
将得到的含镉的乳杆菌菌泥悬浮到生理盐水中，然后调节ph为3.0，室温静置0.75h后离心(8000rpm，10min)将吸附的镉释放至上清液中，沉淀为益生菌吸附剂，将其再次添加到蔬菜汁中循环利用除镉，循环5次后，将益生菌菌泥用于饲料添加剂。
实施例3：
1)复合冻干保护剂的制备
按每20g加入2g的果胶，4.5g的壳聚糖、0.8g的沸石和12.7g的蒸馏水混合得到复合冻干保护剂；
2)益生菌菌粉的制备
将新鲜拐枣经洗净后打浆，并向拐枣浆中加入拐枣质量0.08％的活性为30000u/g的果胶酶、0.15％的活性8000u/g的纤维素酶添和0.75％的活性为10000u/g的半纤维素酶于60℃保温3h，然后抽滤获得拐枣汁，再向拐枣汁中按每升拐枣汁加入4g/l的酪蛋白胨、2g/l的菊糖后于121℃灭菌20分钟，冷却至39℃后加入膜过滤的亮氨酸和小牛血清，使亮氨酸和小牛血清的终浓度分别为16mg/l和2g/l、后按体积比接入3％的已活化的嗜酸乳杆菌菌种和鼠李糖乳杆菌菌种(菌种比例为2:1)，于37℃恒温培养20h，然后冷冻离心收集菌体得益生菌菌粉；
3)向益生菌菌粉中加入2倍重量的复合冻干保护剂，用漩涡仪混合均匀，然后采用真空冷冻干燥20h，得到活菌数为3.5×1011cfu/g的益生菌吸附剂。
益生菌吸附剂在蔬菜汁中除镉的应用：首先将新鲜西红柿清洗、除梗、榨汁处理后按照1：2质量比加水，然后离心去除沉淀，于高压蒸汽灭菌锅中105℃下灭菌10min，离心除去热凝固物，添加镉盐，使镉浓度为4mg/l，再将蔬菜汁ph调至6，然后将益生菌吸附剂添加至蔬菜汁中，添加量为4g/l，然后于37℃下静置吸附除镉3h，镉去除率为99％，然后冷冻离心，即得无镉蔬菜汁和含镉的乳杆菌菌泥。
将得到的含镉的乳杆菌菌泥悬浮到生理盐水中，然后调节ph为2.8，室温静置0.6h后离心(8000rpm，10min)将吸附的镉释放至上清液中，沉淀为益生菌吸附剂，将其再次添加到蔬菜汁中循环利用除镉，循环5次后，将益生菌菌泥用于饲料添加剂。
实施例4：
1)复合冻干保护剂的制备
按每20g加入1.5g的果胶，3g的壳聚糖、0.3g的沸石和15.2g的蒸馏水混合得到复合冻干保护剂；
2)益生菌菌粉的制备
将新鲜拐枣经洗净后打浆，并向拐枣浆中加入拐枣质量0.08％的活性为30000u/g的果胶酶、0.15％的活性8000u/g的纤维素酶添和0.75％的活性为10000u/g的半纤维素酶于60℃保温3h，然后抽滤获得拐枣汁，再向拐枣汁中按每升拐枣汁加入5g/l的酪蛋白胨、1.8g/l的菊糖后于121℃灭菌20分钟，冷却至39℃后加入膜过滤的亮氨酸和小牛血清，使亮氨酸和小牛血清的终浓度分别为14mg/l和3g/l、后按体积比接入1％的已活化的嗜酸乳杆菌菌种，于37℃恒温培养24h，然后冷冻离心收集菌体得益生菌菌粉；
3)向益生菌菌粉中加入1.5倍重量的复合冻干保护剂，用漩涡仪混合均匀，然后采用真空冷冻干燥22h，得到活菌数为5.2×1011cfu/g的益生菌吸附剂。
益生菌吸附剂在蔬菜汁中除镉的应用，：首先将新鲜南瓜清洗、除梗、榨汁处理后按照1：2质量比加水，然后离心去除沉淀，于高压蒸汽灭菌锅中105℃下灭菌10min，离心除去热凝固物，添加镉盐，使镉浓度为3mg/l，再将蔬菜汁ph调至7，然后将益生菌吸附剂添加至蔬菜汁中，添加量为5g/l，然后于37℃下静置吸附除镉2h，镉去除率为98％，然后冷冻离心，即得无镉蔬菜汁和含镉的乳杆菌菌泥。
将得到的含镉的乳杆菌菌泥悬浮到生理盐水中，然后调节ph为3.5，室温静置1h后离心(8000rpm，10min)将吸附的镉释放至上清液中，沉淀为益生菌吸附剂，将其再次添加到蔬菜汁中循环利用除镉，循环5次后，将益生菌菌泥用于饲料添加剂。
实施例5：
1)复合冻干保护剂的制备
按每20g加入0.5g的果胶，3g的壳聚糖、0.3g的沸石和16.2g的蒸馏水混合得到复合冻干保护剂；
2)益生菌菌粉的制备
将新鲜拐枣经洗净后打浆，并向拐枣浆中加入拐枣质量0.08％的活性为30000u/g的果胶酶、0.15％的活性8000u/g的纤维素酶添和0.75％的活性为10000u/g的半纤维素酶于60℃保温2h，然后抽滤获得拐枣汁，再向拐枣汁中按每升拐枣汁加入3.5g/l的酪蛋白胨、1.9g/l的菊糖后于121℃灭菌20分钟，冷却至40℃后加入膜过滤的亮氨酸和小牛血清，使亮氨酸和小牛血清的终浓度分别为15mg/l和2.5g/l、后按体积比接入5％的已活化的鼠李糖乳杆菌菌种，于37℃恒温培养21h，然后冷冻离心收集菌体得益生菌菌粉；
3)向益生菌菌粉中加入2.5倍重量的复合冻干保护剂，用漩涡仪混合均匀，然后采用真空冷冻干燥24h，得到活菌数为6.5×1011cfu/g的益生菌吸附剂。
益生菌吸附剂在蔬菜汁中除镉的应用，：首先将新鲜菠菜清洗、除梗、榨汁处理后按照1：2质量比加水，然后离心去除沉淀，于高压蒸汽灭菌锅中105℃下灭菌10min，离心除去热凝固物，添加镉盐，使镉浓度为5mg/l，再将蔬菜汁ph调至7，然后将益生菌吸附剂添加至蔬菜汁中，添加量为2g/l，然后于37℃下静置吸附除镉3h，镉去除率为96％，然后冷冻离心，即得无镉蔬菜汁和含镉的乳杆菌菌泥。
将得到的含镉的乳杆菌菌泥悬浮到生理盐水中，然后调节ph为4，室温静置1h后离心(8000rpm，10min)将吸附的镉释放至上清液中，沉淀为益生菌吸附剂，将其再次添加到蔬菜汁中循环利用除镉，循环5次后，将益生菌菌泥用于饲料添加剂。