本发明属于pcr检测
技术领域：
，具体涉及一种同时检测七种水禽易感病毒的七重pcr引物组及其检测方法。
背景技术：
：我国是世界上最大的水禽生产国与消费国，水禽饲养量占世界总量的75％以上。随着近几年来养鸭业的快速发展，养殖规模的扩大、混合养殖模式的增多、人畜的流动性增强、水源污染造成的水质下降等多方面因素为病毒的传播创造了有利条件，地方流行的病毒性疾病明显增多,新的疫情不断发生,给水禽养殖业造成了严重经济损失。目前，鸭源禽流感病毒(aiv)、新城疫病毒(ndv)、禽腺病毒(fadv)、鸭瘟病毒(dev)、a型鸭肝炎病毒(dhav)、鸭坦布苏病毒(dtmuv)、鹅细小病毒(gpv)是严重危害养鸭业的常见易感病毒。这些疾病在临床上常常以混合感染的形式存在，仅靠肉眼观察发病症状、剖检变化和发病特征等，难以作出快速鉴别诊断，因此建立能够普遍适用这些病毒感染的快速高通量鉴别检测方法迫在眉睫。临床上,病毒分离鉴定、血清学检测、elisa、免疫电镜、real-timepcr已被分别应用于这些病毒感染的检测，但是传统方法如病毒分离鉴定耗时长，血清学和elisa检测耗时费力，常受临床病料新鲜度、污染程度或病程等因素的限制，免疫电镜和real-timepcr对设备及病毒的纯化要求较高，均给临床诊断带来了局限性。而临床上这些病又常常是多种混合感染，鉴别诊断就更加困难。因此，如何能够快速、准确、高特异性、高灵敏度、并且对病毒纯化要求不是十分严格，便于操作、节约成本的同时检测上述七种病毒成为本领域有待解决的技术问题。技术实现要素：本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种同时检测七种水禽易感病毒的七重pcr引物组。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种同时检测七种水禽易感病毒的七重pcr引物组，其中：所述引物组序列分别为fadv-f、fadv-r、dhav-f、dhav-r、dev-f、dev-r、aiv-f、aiv-r、dtmuv-f、dtmuv-r、ndv-f、ndv-r、gpv-f、gpv-r。所述引物组从5’端至3’端的序列分别为：fadv-f：caacagcctctcgtacccag、fadv-r：ccgatgtagttgggcctgag、dhav-f：ctttccactccctgctccc、dhav-r：ttggcttccacatcctcttca、dev-f：atcgcatgtagacgttggtt、dev-r：agacagcggtgatggatgg、aiv-f：ggcgactactaccaaccca、aiv-r：ctgctgttcctgccgatat、dtmuv-f：aatcggtagtggctttgg、dtmuv-r：agtctgccgacatggatat、ndv-f:caccggcaaccctattctgt、ndv-r:agtgcgccttcagtctttga、gpv-f:tatgtcctgggctcggctac、gpv-r:agctgacacaggtccaggtt；所述七种水禽易感病毒为鸭源禽流感病毒、新城疫病毒、禽腺病毒、鸭瘟病毒、a型鸭肝炎病毒、鸭坦布苏病毒、鹅细小病毒。作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供七重pcr引物组同时检测七种水禽易感病毒的方法。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：权利要求1所述的七重pcr引物组同时检测七种水禽易感病毒的方法，其包括，利用权利要求1所述的引物进行pcr扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳的特异性扩增条带判定阳性结果。作为本发明所述七重pcr引物组同时检测七种水禽易感病毒的方法的优选方案：所述pcr扩增，反应条件为，95℃预变性5min，95℃变性30s，57～57.5℃退火30s，72℃延伸40s，进行35个循环后，72℃延伸10min。作为本发明所述七重pcr引物组同时检测七种水禽易感病毒的方法的优选方案：所述pcr，其反应体系中，dna聚合酶的浓度为0.05u/μl。作为本发明所述七重pcr引物组同时检测七种水禽易感病毒的方法的优选方案：所述pcr，其反应体系中，dntp的浓度为0.4mm。作为本发明所述七重pcr引物组同时检测七种水禽易感病毒的方法的优选方案：所述pcr，其反应体系中，引物终浓度分别为：fadv-f/r：0.12μm、dhav-f/r：0.12μm、dev-f/r：0.16μm、aiv-f/r：0.24μm、dtmuv-f/r：0.28μm、ndv-f/r：0.24μm、gpv-f/r：0.24μm。作为本发明所述七重pcr引物组同时检测七种水禽易感病毒的方法的优选方案：所述pcr，其反应体系中，镁离子浓度为4mm。作为本发明所述七重pcr引物组同时检测七种水禽易感病毒的方法的优选方案：所述pcr，其反应体系为25μl体系，包括10xtaqbuffer2.5μl、dna聚合酶0.25μl、dntp1μl、25mm的mgcl24μl。作为本发明所述七重pcr引物组同时检测七种水禽易感病毒的方法的优选方案：禽腺病毒的dna检测条带大小为102bp、a型鸭肝炎病毒的dna检测条带大小为140bp、鸭瘟病毒的dna检测条带大小为172bp、鸭源禽流感病毒的dna检测条带大小为435bp、鸭坦布苏病毒的dna检测条带大小为288bp、鹅细小病毒的dna检测条带大小为516bp、新城疫病毒的dna检测条带大小为330bp。本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明提供的m-pcr方法同时检测ndv、aiv、dev、dhav、fadv、dtmuv、gpv七种水禽病毒，能鉴别诊断这七种病毒，检测特异性强、敏感性高、操作简便快速，成本低廉。本研究m-pcr方法能同时检测ndv、aiv、dev、dhav、fadv、dtmuv、gpv七种水禽病毒，能够在实际生产中快速鉴别诊断水禽是否感染上述需检测的病毒，同时能监测水禽的发病情况，为临床上ndv、aiv、dev、dhav、fadv、dtmuv、gpv的大规模病毒监测、流行病学调查以及这些疾病的防控提供了一种有效的检测手段。本发明检测敏感性高、特异性强、重复性好，相对于其他检测方法成本更低，快速简便，省时省力。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为本发明七重pcr电泳图。图2为本发明多重pcr酶的优化电泳图。图3为本发明多重pcrdntp的优化电泳图。图4为本发明多重pcr不同反应体系的对比图。图5为本发明多重pcr镁离子浓度的优化电泳图。图6为本发明多重pcr退火温度的优化电泳图。图7为本发明多重pcr引物的优化电泳图。图8为本发明多重pcr循环数的优化电泳图。图9为本发明七重pcr敏感性的电泳图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。实施例1：引物的设计与筛选：根据genbank中各个病毒的保守基因，如ndv的融合蛋白基因(f基因)，aiv的基质蛋白基因(m基因)，dev的长特异区基因(ul2基因)，dhav的核衣壳蛋白基因(vp1基因)，fadv的六邻体蛋白基因(h基因)，dtmuv的囊膜蛋白基因(e基因)，gpv的核衣壳蛋白基因(vp3基因)，用dnaman软件进行同源性分析，在其保守区域设计特异性引物，每种病毒设计2种或2种以上的引物进行筛选，选出的特异好无交叉反应及扩增效率好的引物。各病毒特异性引物见表一。表一本发明检测七种病毒的七对特异性引物实施例2：质粒标准品制备：第一步：引物合成本发明所设计的7对病毒质粒构建引物见表二，由上海生工生物公司技术服务公司合成。表二七种病毒构建标准质粒引物namesequence(5’-3’)targetedgenelengthfadv-f质粒ttactcccgacctgaccach949bpfadv-r质粒atacccgaacgctccgaatdhav-f质粒ctttccactccctgctcccvp1140bpdhav-r质粒ttggcttccacatcctcttcadev-f质粒acgataggctcccgtctccul2312bpdev-r质粒caacgccacgaccttccagaiv-f质粒ggcgactactaccaacccam435bpaiv-r质粒ctgctgttcctgccgatatdtmuv-f质粒aatcggtagtggctttgge288bpdtmuv-r质粒agtctgccgacatggatatndv-f质粒caccggcaaccctattctgtf330bpndv-r质粒agtgcgccttcagtctttgagpv-f质粒gtgccgatggagtgggtaavp3917bpgpv-r质粒tgatacaggtccgggttgc第二步：病毒总dna/rna提取按照viraldna/rnaextractionkit试剂盒说明书分别提取七种病毒已有毒株基因组，ndv、aiv、dhav及dtmuv的rna按照说明书反转录为cdna，所有cdna/dna置于-80℃保存备用。第三步：反转录反应在无rnase的pcr管中加入ndv、aiv、dhav及dtmuv的rna各1μl，使用thermoscientificrevertaidfirststrandcdnasynthesiskit进行rt-pcr反应，其中5xbuffer4μl，10mmdntp2μl，randomprimers1μl，20u/μlribolockrnase1μl，200u/μlreveraidm-mulvrtase1μl，depc水10μl，总体系20μl，反应结束后得cdna。第四步：pcr扩增50μl的pcr反应体系：10xtaqbuffer5μl，5u/uldnapolymerase0.5μl，10mmdntpmix2μl，25mmmgcl28μl，以第一步中合成的各个病毒的引物1μl，第三步得到的cdna/dna为模板，加去离子水补足至50μl，分别进行pcr扩增。pcr仪的反应参数为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，74℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。第五步：质粒标准品制备将第四步获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照dnagelextractionkit操作方法回收目的片段，将回收产物连接到pmd18-t载体上，通过dh5α大肠杆菌感受态转化，划平板过夜培养后挑取其中白色单菌落进行鉴定，重组质粒序列委托上海生工生物公司进行序列测定。利用plasmidminiprepkit提取测序正确的重组质粒，利用nanodrop2000定量重组质粒浓度，以无菌双蒸水将重组质粒按照1x108-1x10-1copies/μl10倍梯度稀释制备质粒标准品。实施例3：引物特异性验证：分别以七种病毒构建的标准质粒为模板，扩增相应的目的片段，每个反应体系总体积为50μl，包括单一病毒模板1μl、各自上下游引物1μl、10xtaqbuffer5μl，5u/μldnapolymerase0.5μl，10mmdntpmix2μl，25mmmgcl28μl、水补足至50μl。反应程序为95℃预变性5min、95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸。反应结束后取8μl产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，送25μl产物送往上海生工生物公司进行序列测定。实施例4：酶用量优化：本发明七重pcr电泳图如图1所示，泳道1的7个条带分别是fadv(102bp)、dhav(140bp)、dev(172bp)、dtmuv(288bp)、ndv(330bp)、aiv(435bp)、gpv(516bp)。pcr反应中taqdnapolymerase是很关键的因素，不同的酶有不同的扩增效率和保真性，对于酶的选择在实施例2中已经优化，现在对酶的用量进行优化。因为酶是价格相对较贵的，所以要用最少的量得到最优的结果是我们优化的目的，为此我们摸索了最佳的酶的用量，见图2。如图2所示，泳道1-5酶的工作浓度为0.01u/μl,0.02u/μl,0.03u/μl,0.05u/μl,0.07u/μl。由图2可知，当酶浓度为0.05u/μl时，反应结果最好。实施例5：dntp用量优化：pcr反应中dntp是包括datp,dgtp,dttp,dctp等在内的统称，主要作用在于pcr在第三步延伸的过程中，需要这几种核苷酸,以碱基互补原则,在酶的作用下与需要扩增的模板链进行连接，从而达到复制模板链的目的。在pcr反应中，使用低dntp浓度，可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入，为此我们摸索了最佳的dntp浓度，见图3。图3为本发明多重pcrdntp的优化，泳道1-4dntp的工作浓度为0.1mm，0.25mm，0.4mm，0.55mm。由图3可知，当dntp的浓度为0.4mm时，反应结果最好。实施例6：反应试剂优化：图4为本发明多重pcr不同反应体系的对比，从图4可知，当做五重pcr时，普通的pcrmix不再适合多重的反应体系；图4中，泳道1为采用普通的pcrmix检测五种病毒；泳道2为表四所示配的体系检测五种病毒；泳道3、4分别为泳道1、2的阴性对照。证明我们摸索的反应试剂的配比要优于市售的pcrmix。所以我们自己摸索出了较为合适的镁离子浓度，酶和dntp的用量，见表四。表四本发明多重pcr反应体系实施例7：镁离子浓度优化：镁离子的作用主要是dntp-mg2+与核酸骨架相互作用并能影响polymerase的活性，镁离子浓度高，扩增效率就高，但是特异性会下降；镁离子浓度低，扩增效率会下降，但是特异性会提高。为此我们摸索了最佳的镁离子浓度，见图5。图5中，泳道1-6的镁离子浓度分别是1mm，2mm，3mm，4mm，5mm，6mm。其中4mm的镁离子浓度为最佳。实施例8：退火温度优化：退火温度决定pcr特异性与产量：温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，dna扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。七重pcr反应中有7对引物，各自的合适的退火温度也是不一样的，为此我们摸索了七重pcr反应最佳的退火温度，见图6，图6中泳道1-6的退火温度分别是51.0℃，53.1℃，55.4℃，57.5℃，58.9℃，61.0℃。由图6可知，退火温度为57.5℃时反应结果最好，为最佳的退火温度。实施例9：引物优化：同时在一个反应孔中检测七种病毒是十分困难的，七对引物之间经常相互干扰导致检测失败，七对引物间容易形成发夹结构、引物二聚体，并且引物与dna之间容易发生错配，例如，如图7a所示，做五重pcr检测fadv、dev、aiv、ndv、gpv五种病毒时，gpv的引物能够正常工作，见图7a泳道2439bp条带(优化前的条带大小)处，而直接增加两对引物做七重pcr时，同样的一对gpv的引物则无法正常工作，不能检测出gpv病毒，见图7b泳道8，泳道7为泳道8的阳性对照，因此，需要重新设计七对引物，如图7c泳道1和泳道2所示，优化后的七对引物做七重pcr，能够同时检测出七种病毒(优化后gpv条带大小516bp)，但是aiv的条带(优化前的条带大小为237bp)很弱，可见aiv的检测灵敏度显著下降。经过发明人不断的重复设计和大量的实验验证，最终确定了能够高灵敏度、高特异性的同时检测七种病毒七重pcr引物对，如图7d泳道2所示(优化后aiv条带435bp)。本发明七对引物之间彼此不会相互干扰，pcr条带明亮、清晰、无杂带。图7a泳道2是fadv、dev、aiv、ndv、gpv的五重pcr；图7b泳道1-7分别是fadv、dhav、dev、aiv、dtmuv、ndv、gpv的阳性对照，泳道8没能检测出gpv病毒；图7c泳道1和2是优化了gpv引物的七重pcr，但aiv的条带很弱；图7d泳道1和2分别使用了aiv的新设计的两对引物，泳道2的效果好，七重条带分别是fadv(102bp)、dhav(140bp)、dev(172bp)、dtmuv(288bp)、ndv(330bp)、aiv(435bp)、gpv(516bp)，泳道3和4分别是泳道1和2的阳性对照。本发明七重pcr7对引物加样量见表三。表三本发明七重pcr7对引物加样量病毒引物引物加样量终浓度模板加样量fadv-h-f/r(10μm)0.3μl0.12μm1μldhv-vp1-f/r(10μm)0.3μl0.12μm1μldev-ul2-f/r(10μm)0.4μl0.16μm1μlaiv-m-f/r(10μm)0.6μl0.24μm1μldtmuv-e-f/r(10μm)0.7μl0.28μm1μlndv-f-f/r(10μm)0.6μl0.24μm1μlgpv-vp3-f/r(10μm)0.6μl0.24μm1μl实施例10：循环数优化：pcr反应中循环数也是一个的影响因素。循环数过少则扩增不完全，循环数过多扩增反应到达平台期，产物量也不会增加反而浪费时间。为此我们摸索了最佳的循环数，见图8。图8中，泳道1-3的循环数分别是25c、30c、35c。由图可知，35个循环数为最佳。实施例11：多重pcr体系建立：经过以上优化最终建立了多重pcr反应体系，反应体系为25μl，七种毒株病毒质粒为模板，分别加入七种病毒的特异性引物，终浓度控制在0.1μm-0.4μm之间；dnapolymerase0.25μl；退火温度设置57℃；经优化后的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，进行35个循环后，72℃延伸10min。pcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，与预期的目的片段大小进行比较，同时设置去离子水的空白对照组。实施例12：多重pcr特异性检测：根据已建立的多重pcr方法，分别以各病毒的质粒作为模板，进行pcr扩增，每个反应体系为25μl，包括单一病毒模板1μl，7对病毒引物混合物共7μl，10xtaqbuffer(无mg2+)2.5μl，taqdnapolymerase(5u/ul)0.25μl，dntpmix(10mmeach)1μl，mgcl2(25mm)4μl，去离子水补足25μl；反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，进行35个循环后，72℃延伸10min。pcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，与预期的目的片段大小进行比较，同时设置去离子水的空白对照组。实施例13：多重pcr敏感性评价：利用plasmidminiprepkit提取测序正确的重组质粒,利用nanodrop2000定量重组质粒浓度,以无菌双蒸水将重组质粒按照1x108copies/μl-1x100copies/μl10倍梯度稀释制备质粒标准品。将7个单一模板等浓度混合为多重模板，从1x108copies/tube-1x100copies/tube做8个梯度的多重pcr，测定多重pcr方法的敏感性。结果通过1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，见图9，结果显示七重pcr的敏感性能达到103copies/μl，该敏感性已达到多重pcr检测要求。实施例14：临床样品检测：临床样品检测和病毒分离。初步应用建立的方法检测临床样品66份：对2017年4月到2018年3月采自江苏南京周边地区的样品，利用多重pcr方法检测分析携带该病毒的状况。将66份病料研磨液分别提取病毒dna/rna，按照实施例5的方法进行检测。多重pcr检测结果显示，在66份病料中，鉴定到aiv阳性病毒5株，ndv病毒8株，dev10株，dhav病毒6株，fadv病毒3株，dtmuv病毒5株，gpv病毒2株；dhav+dev共感染4株，dhav+dtmuv共感染2株，aiv+ndv共感染3株，aiv+dev共感染1株，ndv+dev+dhav共感染1株，aiv+dtmuv+ndv共感染1株。从上述结果可以看出，病毒的多重pcr检测方法与病毒分离方法比较具有用时短、敏感性高的特点，病毒分离的阳性结果在多重pcr检测均为阳性。通过本实验初步证实了该方法在病毒的检测方面具有可行性。由以上实施例可知，本发明设计得到的ndv、aiv、dev、dhav、fadv、dtmuv、gpv病毒特异性引物具有较强的特异性，对检测除ndv、aiv、dev、dhav、fadv、dtmuv、gpv病毒以外的病毒都为阴性；批间批内实验表明构建的多重pcr检测方法具有良好的稳定性。综上，与现有技术相比，本发明提供的m-pcr方法同时检测ndv、aiv、dev、dhav、fadv、dtmuv、gpv七种水禽病毒，能鉴别诊断这七种病毒，检测特异性强、敏感性高、操作简便快速，成本低廉。本研究m-pcr方法能同时检测ndv、aiv、dev、dhav、fadv、dtmuv、gpv七种水禽病毒，能够在实际生产中快速鉴别诊断水禽是否感染上述需检测的病毒，同时能监测水禽的发病情况，为临床上ndv、aiv、dev、dhav、fadv、dtmuv、gpv的大规模病毒监测、流行病学调查以及这些疾病的防控提供了一种有效的检测手段。本发明检测敏感性高、特异性强、重复性好，相对于其他检测方法成本更低，快速简便，省时省力。应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。序列表<110>南京农业大学<120>一种同时检测七种水禽易感病毒的七重pcr引物组及其检测方法<160>14<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1caacagcctctcgtacccag20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ccgatgtagttgggcctgag20<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ctttccactccctgctccc19<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ttggcttccacatcctcttca21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5atcgcatgtagacgttggtt20<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7agacagcggtgatggatgg19<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9aatcggtagtggctttgg18<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10agtctgccgacatggatat19<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tatgtcctgggctcggctac20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12agctgacacaggtccaggtt20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11caccggcaaccctattctgt20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12agtgcgccttcagtctttga20<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ggcgactactaccaaccca19<210>14<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14ctgctgttcctgccgatat19当前第1页12