本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以联合5种非编码rna标志物mir-125b、mir-205、spry4-it1、gas5-as1和circsmarca5用于检测人血清afp阴性肝细胞癌。
背景技术：
肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，死亡率在恶性肿瘤中位居第二位。原发性肝癌中85％-90％为肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)。在中国，每年因hcc死亡的人数达695,900，可见hcc是威胁人类健康的主要疾病之一。肝硬化是hcc形成的最主要的危险因素，发生率为80％-90％，而导致肝硬化的主要因素是嗜肝的乙肝dna病毒(hepatitisbvirus，hbv)和丙型rna病毒(hepatitiscvirus，hcv)的感染。hcc的死亡率在过去20年中明显增多，流行病学研究表明，在接下来的十年中hcc所带来的药物和经济方面的负担仍会显著加重。尽管现今治疗hcc的方法有极大发展，目前有手术切除，肝脏移植，辅助治疗，介入治疗等多种治疗手段，但是很多hcc在相关症状出现后才能被诊断，已经到达晚期，患者的5年生存率仅有7％。hcc术后复发和发生转移是导致生存率低的主要原因，而被早期诊断且受到合适治疗干预的hcc患者，5年生存率超过50％。
hcc的传统血清学诊断以甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,afp)为主，但在早期hcc中单独测定afp，漏诊率高达40％，即便在晚期患者中仍有15％-30％的血清afp值处于正常。afp是目前临床上最主要、应用最广泛的hcc早期筛查血清标志物，但因其在转录水平上受多种因素调控，使部分hcc患者血清afp水平正常(<20μg/l)，即所谓的afp阴性hcc，在小hcc(瘤体≤3cm)中尤为常见。afp阴性hcc通常临床症状较轻且缺乏特异性，目前临床上对afp阴性hcc的诊断主要依赖于影像学检查和其他肿瘤标志物的检测。然而afp阴性hcc的肿瘤体积通常较小，影像学检查容易出现漏诊。并且，一些肝结节性病灶如肝硬化再生结节，肝局灶性结节增生和肝腺瘤也能出现类似hcc的影像学表现，afp阴性hcc患者易被误诊为肝脏良性疾病，导致患者失去早期治疗的宝贵机会。有研究报道afp阴性hcc患者ct、mri和b超检查诊断率分别仅有50.9％、50％和10.4％。异常凝血酶原(pivka-ⅱ)是hcc的新型敏感标志物，可作为afp阴性hcc的诊断指标。目前，pivka-ⅱ已在部分地区应用到hcc早期诊断检测项目中，然而只有约50％的afp阴性hcc患者血清pivka-ⅱ呈阳性结果。
鉴于目前对于afp阴性hcc患者的诊断尚缺乏有效的检查方法，同时在慢性乙型肝炎和肝硬化患者中afp也会出现升高的现象，无论是afp单独或者联合pivak-ⅱ检测都会出现一定比例的漏检，因此，有必要寻找建立更有效的诊断指标体系，以提高对afp阴性hcc的检出率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种灵敏度、特异性高，可以实现血清afp阴性hcc的诊断的非编码rna检测试剂盒,以及提供mir-125b、mir-205、spry4-it1、gas5-as1和circsmarca5联合使用在制备检测血清afp阴性hcc的试剂中的应用。
本发明为了解决上述问题提出的技术方案如下：
第一方面，提供mir-125b、mir-205、spry4-it1、gas5-as1和circsmarca5联合使用在制备检测血清afp阴性hcc的试剂中的应用。
第二方面，提供一种血清afp阴性hcc非编码rna检测试剂盒，其检测体系包括反转录反应体系、pcr反应体系和内参体系，所述pcr反应体系中包括分别针对mir-125b、mir-205、spry4-it1、gas5-as1和circsmarca5的正向引物和反向引物；所述内参体系中包括mir-125b和mir-205的内参u6的正向引物和反向引物，spry4-it1的内参18s的正向引物和反向引物，gas5-as1和circsmarca5的内参gapdh的正向引物和反向引物；针对所述mir-125b的正向引物的核苷酸序列如seqidno.6所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno.7所示；针对所述mir-205的正向引物的核苷酸序列如seqidno.10所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno.11所示；针对所述spry4-it1的正向引物的核苷酸序列如seqidno.12所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno.13所示；针对所述gas5-as1的正向引物的核苷酸序列如seqidno.16所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno.17所示；针对所述circsmarca5的正向引物的核苷酸序列如seqidno.20所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno.21所示；mir-125b和mir-205的内参u6的正向引物的核苷酸序列如seqidno.8所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno.9所示；spry4-it1的内参18s的正向引物的核苷酸序列如seqidno.14所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno.15所示；gas5-as1和circsmarca5的内参gapdh的正向引物的核苷酸序列如seqidno.18所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno.19所示。
优选地，用于配制所述pcr反应体系的试剂包括sybrgreen混合液、正向引物液、反向引物液和纯水；用于配制所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。
进一步地，上述pcr反应体系的总体积为20μl；其中，所述sybrgreen混合液的体积是10μl，所述正向引物液的体积是0.8μl，所述反向引物液的体积是0.8μl，所述cdna模板1μl,其余是纯水；所述正向引物液的使用浓度为10μm，所述反向引物液的使用浓度为10μm；所述dna模板是所述反转录反应体系反应后的产物稀释10倍获得的。
本发明提供的一组用于人血清afp阴性的hcc诊断的标志物，包括mir-125b(seqidno.1)、mir-205(seqidno.2)、spry4-it1(seqidno.3)、gas5-as1(seqidno.4)和circsmarca5(seqidno.5)。
本发明具有积极的效果：
(1)mir-125b、mir-205、spry4-it1、gas5-as1和circsmarca5联合使用作为组合分子标记物，经过大数据临床验证实验，在hcc的辅助诊断指标方面具有突出优势。这五个分子标记物首次应用于hcc非编码rna检测试剂盒的开发，该hcc非编码rna检测试剂盒运用实时荧光定量pcr方法，可以实现早期hcc的辅助诊断，提高患者的生存率。
(2)本发明的血清afp阴性hcc非编码rna检测试剂盒选择了mir-125b、mir-205、spry4-it1、gas5-as1和circsmarca5这五个非编码rna标记物进行组合，用于区分血清afp阴性hcc和正常人，其诊断效能auc可达到0.985，敏感度和特异度分别为92.8％和96.6％。相比较于目前基于大样本，多中心的研究发现的异常凝血酶原(pivka-ⅱ)鉴别afp阴性hcc与正常人的诊断效能auc为0.856，灵敏度和特异度分别为76.3％和89.1％，5种非编码rna更具有优势。
(3)通过诊断软件medcalc分析还发现，联合上述5种非编码rna的诊断效能显著高于上述单一标志物(p<0.001)。
(4)本发明mir-125b、mir-205、spry4-it1、gas5-as1和circsmarca5联合使用作为组合分子标记物，还可用于区分血清afp阴性hcc和健康对照血浆，其诊断效能auc可达到0.985，敏感度和特异度分别为92.8％和96.6％。
附图说明
图1为roc分析mir-125b对血清afp阴性的hcc病人的诊断价值。
图2为roc分析mir-205b对血清afp阴性的hcc病人的诊断价值。
图3为roc分析spry4-it1对血清afp阴性的hcc病人的诊断价值。
图4为roc分析gas5-as1对血清afp阴性的hcc病人的诊断价值。
图5为roc分析circsmarca5对血清afp阴性的hcc病人的诊断价值。
图6为roc分析本发明的五种rna(mir-125b、mir-205、spry4-it1、gas5-as1和circsmarca5)联合诊断血清afp阴性的hcc。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】血浆rna的提取
收集hcc(hcc)病人及健康对照组血浆，其中hcc59例(年龄：55±9；性别：55男，4女)，其血清afp均低于20ng/ml，健康对照72例(年龄：52±10；性别：65男，7女)。提取血浆中的总rna。采用北京百泰克生物技术有限公司的rna提取试剂盒(rp4002)，按照试剂盒说明书进行操作。简述如下：①将edta的抗凝全血置于低温离心机中，4℃，2000×g离心5min。分离血浆和血细胞。②小心吸取上层血浆，转移到1.5ml的rnase-freeep管中。注意此步骤要避免吸到中间白膜层，其中含有白细胞和血小板，会造成血浆外来源的rna的污染。③将rnase-free离心管中的血浆重新置入低温离心机中，4℃，12000×g离心5min。此操作为了尽可能去除细胞碎片。④离心结束后，再次小心吸取上层血浆上清转移到新的1.5ml的rnase-freeep管中。通常2ml的全血可以通过离心收集到0.9ml左右的血浆。分离得到的血浆可立即用于总rna的提取，也可以保存于-80冰箱中备用。⑤在第一次使用此rna提取试剂盒时，首先在70％乙醇和漂洗液rw瓶中加入指定量的无水乙醇。接着，每0.25ml液体样本中加入0.75ml的裂解液rls，加样枪反复吹打混匀。⑥将上述混合物涡旋混匀，在室温条件放置5min。然后放入低温离心机中，4℃条件下，12000rpm离心10min。小心吸取上层上清，转移到一个新的rnase-free的ep管中。⑦按照裂解液和氯仿5:1的比例加入氯仿。涡旋剧烈震荡15s，由于氯仿易挥发，并具有毒性，因此实验中要注意将ep管盖盖紧。然后将混合物置于室温中孵育3min。接着，将混合物置于低温离心机中，4℃条件下，12000rpm离心10min。此时可以观察到样品可以分为上中下三层。小心将上层水相转移到一个新的ep管中(约500μl)。然后将一倍体积的乙醇加入上层水相中，反复颠倒混匀。此时混合物一般可以观察到变浑浊出现沉淀。然后将该混合物加入吸附柱中。室温12000rpm离心1min。弃去废液后，将吸附柱重新置于收集管中。将500μl的去蛋白液re加入吸附柱中，室温12000rpm离心1min。弃掉废液。⑧将500μl的漂洗液rw加入吸附柱中，室温12000rpm离心1min。弃去废液。注意此操作中要确认漂洗液rw已加入无水乙醇。将漂洗液rw重新加入吸附柱中。室温12000rpm离心1min。弃去废液。⑨将吸附柱ra转移到一个新的收集管中，根据血浆总rna的在吸附膜中央部位加入30-50μlrnasefree水，此步骤注意小心操作，避免枪头将吸附膜刺破。此外，尽量将无rna酶水提前放入65℃水浴锅中预热。然后室温放置2min，室温12000rpm离心1min。如果收集到的血浆总rna较多，可将洗脱液重新加入吸附膜上，再洗脱一次。可以提高rna的回收率。
【实施例2】逆转录
取1μg总rna进行逆转录，采用takara(大连宝生物技术有限公司)primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒进行，按试剂商推荐的步骤进行，简述如下：①在冰盒中配制反应试剂，反应体系如表1：
表1逆转录第一步体系
混匀后将反应组分离心至管底。②42℃孵育2min后，重新将ep管置于冰上，加入以下反应组分：
表2逆转录第二步体系
混匀后，将反应组分点离至管底。③将反应液置于pcr仪中，首先37℃反应15min，然后85℃反应5s。逆转录实验完成。④本实验逆转录的第一链cdna可立即用于荧光定量pcr扩增实验，也可置于-20℃冰箱中保存。如需长期保存，需将样本置于-80℃冰箱中。
【实施例3】实时荧光定量pcr
1、用实施例3获取的cdna样品稀释10倍分别配置实时荧光定量pcr体系。体系配置如表3：
表3荧光定量pcr反应体系
2、上表中的检测目的非编码rna及对应的内参引物序列分别如表4：
表4正向引物和反向引物特征表
3、将配置好的qrt-pcr溶液加入实时荧光定量pcr仪(bio-red)中进行反应，上表中的检测目标rna的反应条件分别为表5所示：
表5荧光定量pcr条件
4、数据统计：本发明通过ibmspssstatistics21进行数据统计分析，通过roc曲线评价标志物的诊断价值，通过logistic回归分析本发明试剂盒涉及的5种血浆rna对血清afp阴性的hcc病人的联合诊断的价值。
5、结果分析：按照本发明的上述方法统计分析发现：
①mir-125b对血清afp阴性的肝细胞癌病人的具有一定的诊断价值(图1)，即当△ct值≤-1.17时判为阳性(即为肝细胞癌患者)，反之为阴性。具体灵敏度和特异度如表6。
②mir-205对血清afp阴性的hcc病人的诊断价值如图2，即当△ct值≤-1.19时判为阳性(即为肝细胞癌患者)，反之为阴性。具体灵敏度和特异度如下表6。
③spry4-it1对血清afp阴性的hcc病人的诊断价即当△ct值≥4.125时判为阳性(即为肝细胞癌患者)，反之为阴性。值如图3，具体灵敏度和特异度如下表6。
④gas5-as1对血清afp阴性的hcc病人的诊断价值如图4，即当△ct值≤-0.295时判为阳性(即为肝细胞癌患者)，反之为阴性。具体灵敏度和特异度如下表6。
⑤circsmarca5对血清afp阴性的hcc病人的诊断价值如图5，即当△ct值≤0.095时判为阳性(即为肝细胞癌患者)，反之为阴性。具体灵敏度和特异度如下表6。
⑥当联合本发明研究的5种非编码rna作为hcc的诊断指标时,其logistics回归模型为预测概率值y＝156.03-137.21×amir-125b+245.49×bmir-205+46.358×cspry4-it1+650.02×dgas5-as1-41.35×ecircsmarca5，其中amir-125b是mir-125b的表达量(2-△△ct值)，bmir-205是mir-205的表达量(2-△△ct值)，cspry4-it1是spry4-it1的表达量(2-△△ct值)，dgas5-as1是gas5-as1的表达量(2-△△ct值)，ecircsmarca5是circsmarca5的表达量(2-△△ct值)，提示当y值≥0.481时，即预测概率值大于或者等于0.481时判为阳性(即为肝细胞癌患者)，反之为阴性。相对于使用单个的检测指标，其诊断价值显著提高(图6)，具体灵敏度和特异度如下表6。
表6roc曲线下的面积及灵敏度和特异度
序列表
<110>武汉大学
<120>一种人血清afp阴性肝细胞癌检测试剂盒
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caaaaauuuauuaaaauuggagacacuguuuuaaaaaaaaaa702
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