本发明属于生物
技术领域：
，涉及分泌抗cst1单克隆抗体杂交瘤细胞株，还涉及由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和应用。
背景技术：
半胱氨酸蛋白酶抑制剂sn(cst1)是人类半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，由cst1基因编码的含141个氨基酸的蛋白质，分子量为16.4kda。cst1分子中含有两个二硫键，为典型的分泌蛋白，分布于体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。随着对肿瘤发病机理研究的不断深入，发现cst1作为组织蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的内源性抑制剂家族成员之一，在肿瘤的发生、发展、浸润和转移过程中起着非常重要的作用。研究结果显示，半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员在不同肿瘤中的表达水平有所上升，例如cystatinc在卵巢癌和头颈部癌症中的表达有不同水平的上升，cystatina在非小细胞肺癌中的表达水平有所增加。据报道cst1能够用于食管癌、肺癌、乳腺癌中均有异常表达。cst1的定量检测具有重要的临床意义。现有cst1检测体系中多采用多克隆抗体；抗体特异性差，不能区分cst1高度同源家族蛋白，由于其抗体本身效价或特异性的原因，也使得其对cst1检测的临床效用受到局限，降低了样本检测的特异性，同时也对灵敏度产生一定的影响。因此急需获得特异性识别cst1蛋白单克隆抗体，满足临床样本检测要求，提高检测的灵敏度和特异性。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种分泌抗cst1单克隆抗体杂交瘤细胞株；本发明的目的之二在于提供分泌抗cst1单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体；本发明的目的之三在于提供含有所述单克隆抗体的试剂盒；本发明的目的之四在于提供所述单克隆抗体在制备检测cst1蛋白试剂中的应用。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：1、分泌抗cst1单克隆抗体杂交瘤细胞株，包括杂交瘤细胞株4g2和4e7，保藏于北京中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号分别为cgmccno.15199和cgmccno.15198。2、所述分泌抗cst1单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。优选的，所述单克隆抗体的抗原表位处于cst1蛋白的c端或cst1蛋白的m段，处于cst1蛋白的c端的氨基酸序列如seqidno.5所示；处于cst1蛋白的m段的氨基酸序列如seqidno.4所示。3、含有所述单克隆抗体的试剂盒。优选的，所述试剂盒包括有所述单克隆抗体的酶标板、校准品cst1蛋白、辣根过氧化物酶标记的检测抗体、显色底物和终止液。更优选的，所述显色底物为tmb，所述终止液为2m的硫酸，所述包被抗体为杂交瘤细胞株为4g2分泌的单克隆抗体，所述检测抗体为杂交瘤细胞株4e7分泌的单克隆抗体。4、所述单克隆抗体在制备检测cst1蛋白试剂中的应用。优选的，所述检测cst1蛋白试剂为检测cst1蛋白过量表达或诊断以cst1蛋白异常表达的试剂。优选的，所述检测cst1蛋白试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株为4g2分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株4e7分泌的单克隆抗体。本发明的有益效果在于：本发明通过获得分泌抗cst1单克隆抗体杂交瘤细胞株，获得针对cst1不同抗原表位的单克隆抗体2种，特异性强且灵敏度高，可通过配对检测体液、组织中人半胱氨酸蛋白酶抑制剂sncst1含量，应用于检测cst1蛋白过量表达或诊断以cst1蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：图1为重组cst1蛋白sds-page电泳图。图2为4g2和4e7抗体sds-page电泳图。图3为cst1截断蛋白免疫印迹wb检测结果。图4为cst1检测试剂盒校准曲线，其中y轴代表od值，x轴代表cst1校准品的浓度。生物保藏本发明中杂交瘤细胞株4g2和4e7，于2017年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，杂交瘤细胞株4g2保藏号为cgmccno.15199，杂交瘤细胞株4e7保藏号为cgmccno.15198，分类命名为杂交瘤细胞株4g2和杂交瘤细胞株4e7。具体实施方式下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、cst1的重组蛋白表达和纯化从食管癌癌组织提取rna后经随机引物rt-pcr得到的cdna为模板，设计引物进行cst1基因的克隆，引物具体为：cst1-f：5’-cccaagcttgccaccatggcccagtatctgagtacc-3’(seqidno.1)；cst1-r：5’-ggattcttgacacctggatttcac-3’)(seqidno.2)。扩增的cst1基因插入到含有6×his标签的pcdna3.1载体上，得cst1-pcdna3.1。然后将cst1-pcdna3.1转化至dh5α，挑取阳性克隆并大量培养后，用高纯度质粒提取试剂盒提取重组质粒cst1-pcdna3.1。重组质粒转入293t细胞中，并同时转染pcdna3.1空载体作为阴性对照，分别在含10％胎牛血清的dmem培养基在37℃、5％co2条件下培养72h，收集上清，利用0.22μm滤膜过滤上清液。将所得500ml滤液进行非变性条件下的ni-nta亲和层析，平衡缓冲液为50mmpbs、10mm咪唑、150mmnacl，ph7.6。上样完毕后，清洗10ml；用50mmpbs250mm咪唑、150mmnacl，ph7.6洗脱，收集洗脱液。利用3kd超滤管浓缩蛋白溶液，将蛋白保存于ph7.450mmpbs缓冲液中，-80℃保存。纯化的蛋白进行sds-page电泳纯度鉴定，分子量大小在15kd左右，灰度分析表明蛋白纯度达到95％以上，见图1。实施例2、cst1单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备小鼠免疫：用cst1蛋白免疫3批balb/c小鼠，每次3只。每只小鼠每次免疫50μg抗原。首次免疫cst1抗原与弗氏完全佐剂1:1混合，随后cst1与弗氏不完全完全佐剂1:1混合，每隔两周免疫一次，共免疫3次，第三次免疫十天后断尾采血，检测血清效价。杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:100000后用cst1抗原(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在50ml离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，，然后加入1ml预热50％peg-1450作用1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清dmem培养基15ml，37℃水浴5min，然后补加无血清dmem培养基至40ml，1000rpm/mim离心10min弃上清，加40ml预热的hat培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μl，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞4株，分别为4g2、4e7和4f7。实施例3、cst1单克隆抗体制备、纯化、效价检测及特异性分析单抗腹水制备：将筛选的4种杂交瘤细胞株分别在培养基中培养至90％密度，收集细胞，将细胞稀释至3×106个/ml。10-12周balb/c小鼠适应性饲养一周后，腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5ml/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的杂交瘤细胞，约(1-2)-106/只，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，合并收集腹水上清。抗体纯化：收集小鼠腹水，用0.45μm的滤器过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mmpbs溶液重溶沉淀。将得到的粗纯化抗体以1ml/min流速上样到proteina-sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mmpbs，ph7.0)清洗，然后用0.1m甘氨酸-盐酸溶液ph2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1mph9.0tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mmpbs溶液透析3次。将透析后的抗体进行10％sds-page电泳，结果显示，3种抗体在55kd与25kd处有条带，灰度分析纯度均大于90％，4g2和4e7抗体sds-page见图2所示。单克隆抗体效价检测：以1μg/ml的重组cst1蛋白的碳酸盐缓冲液(ph9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体(1：1000，1：2000，1：4000，1：64000、1:128000)，加入羊抗鼠igg-hrp(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(s/n>2.1)，4g2、4e7和4f7单克隆抗体效价均为1：128000。单克隆抗体特异性分析：分别以1μg/ml的cst1、cst4和cst3蛋白的cbs缓冲液100μl体积4℃过夜包被微孔板，将各个抗体倍比稀释(500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml和0ng/ml)后加入到微孔反应板，然后加入羊抗鼠igg-hrp(50ng/ml)，结果如表1所示。结果确定4g2特异性识别cst1蛋白，4e7和4f7与cst1和cst4蛋白均可反应，故4g2可作为试剂盒的捕获抗体用于特异性识别cst1。表1、单克隆抗体特异性分析实施例4、cst1单克隆抗体配对验证以3μg/ml4g2抗体包被微孔反应板，加入100μl不同浓度(6.25-1600u/ml)的cst1校准品，37℃孵育60min，洗涤后分别加入100μl浓度为100ng/ml的hpr标记的4e7抗体和4f7抗体，并于37℃孵育60min，洗涤后加入底物于酶标仪测定其吸光度，结果如表2所示。从结果上看，4g2与4e7配对更佳，灵敏度和吸光度更高。表2.cst1单克隆抗体配对结果校准品u/ml4e74f700.0540.059500.1550.0571000.2570.0622000.4570.1244000.8020.2338001.3050.45316001.9630.819实施例5、cst1单克隆抗体表位鉴定重组截断cst1蛋白构建表达：根据cst1蛋白序列，设计了n、m、c端的序列以及cst1全长蛋白(记为cst1-f)，连接表达载体pet30a，并转入表达菌株bl21(de3)中。在lb培养基中，iptg0.1mmol/l25℃条件下过夜诱导cst1截断重组蛋白可溶性表达。原核重组表达经6×his标签亲和纯化，纯化后的蛋白进行sds-page电泳，纯度均在90％以上。cst-n片段(21-47)：wspkeedriipggiynadlndewvqra(seqidno.3)；cst-m片段(48-93)：lhfaiseynkatkddyyrrplrvlrarqqtvggvnyffdvevgrti(seqidno.4)；cst-c片段(112-141)：lqkkqlcsfeiyevpwenrrslvksrcqes(seqidno.5)cst-f片段(21-141)：wspkeedriipggiynadlndewvqralhfaiseynkatkddyyrrplrvlrarqqtvggvnyffdvevgrtictksqpnldtcafheqpelqkkqlcsfeiyevpwenrrslvksrcqes(seqidno.6)蛋白免疫印迹法wb确认抗体识别表位：重组蛋白cst1-n/m/c、cst1全长4种蛋白取5μg上样，进行15％sds-page电泳。电泳完成后，150v恒压条件下，蛋白转入0.45pgmpvdf。转膜完成后利用含5％bsa的pbst溶液37℃封闭两小时。分别用5μg/ml的抗体(4g2/4e7)溶液37℃孵育1小时。孵育完成后，加入50ng/ml的兔抗鼠igg-hrp孵育1小时。清洗完成后，加入dab显色液进行显色。cst1全长蛋白作为阳性对照，cst1-n/m/c片段位置棕色沉淀物质，则表明抗体识别该目的片段。结果显示，4g2抗体识别cst1蛋白的c段，4e7抗体识别cst1蛋白m段，见图3。实施例6、cst1检测试剂盒校准曲线绘制：首先在酶标板上4℃过夜包被捕获抗体4g2，浓度为2.5μg/ml，将重组人cst1校准品蛋白用20％fbs溶液稀释为0u/ml、20u/ml、40u/ml、80u/ml、160u/ml、320u/ml、640u/ml，每孔100μl，再加入辣根过氧化物标记的4e7抗体，浓度20ng/ml，每孔100μl，37℃孵育1小时。用pbst清洗3次，tmb显色底物15min后加入2m的硫酸溶液终止反应，od450读数。从校准曲线计算出被测样品的cst1含量。校准曲线线性范围20～640u/ml，图4为cst1检测试剂盒校准曲线，其中，y轴代表od值对数值，x轴代表cst1校准品的浓度对数值。cst1检测试剂盒用于食管癌诊断:从医院收集100例食管癌患者术前血清；同时从血站收集245例健康献血人员血清。使用cst1检测试剂盒食管癌、正常人血清中cst1浓度。roc曲线统计结果显示，曲线下面积为0.87以101u/ml作为检测参考值，cst1检测试剂盒特异性为86％，灵敏度为79％。综上所述，本发明提供的2种单克隆抗体均可用于样品中cst1蛋白的检测，且特异性强、灵敏度高。2种单克隆抗体特异识别cst1的不同区段，可通过配对检测体液、组织中人半胱氨酸蛋白酶抑制剂sncst1含量，应用于检测cst1蛋白过量表达或诊断以cst1蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海良润生物医药科技有限公司<120>分泌抗cst1单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体和应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>36<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cccaagcttgccaccatggcccagtatctgagtacc36<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggattcttgacacctggatttcac24<210>3<211>27<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3trpserprolysglugluaspargileileproglyglyiletyrasn151015alaaspleuasnaspglutrpvalglnargala2025<210>4<211>46<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4leuhisphealaileserglutyrasnlysalathrlysaspasptyr151015tyrargargproleuargvalleuargalaargglnglnthrvalgly202530glyvalasntyrphepheaspvalgluvalglyargthrile354045<210>5<211>30<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5leuglnlyslysglnleucysserphegluiletyrgluvalprotrp151015gluasnargargserleuvallysserargcysglngluser202530<210>6<211>121<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6trpserprolysglugluaspargileileproglyglyiletyrasn151015alaaspleuasnaspglutrpvalglnargalaleuhisphealaile202530serglutyrasnlysalathrlysaspasptyrtyrargargproleu354045argvalleuargalaargglnglnthrvalglyglyvalasntyrphe505560pheaspvalgluvalglyargthrilecysthrlysserglnproasn65707580leuaspthrcysalaphehisgluglnprogluleuglnlyslysgln859095leucysserphegluiletyrgluvalprotrpgluasnargargser100105110leuvallysserargcysglngluser115120当前第1页12