本发明涉及一种魔芋葡甘聚糖基脂肪酸酯的制备方法，具体涉及一种超声-微波辅助作用下快速、高效制备魔芋葡甘聚糖基脂肪酸酯的方法，属于天然产物分子修饰领域。
背景技术：
魔芋葡甘聚糖(konjacglucomannan,简称kgm)是一种从魔芋中提取出来的水溶性天然高分子多糖，具有乳化、抗氧化、降脂降糖、减肥等很多独特的功能特性。1994年，欧美国家就相继立法批准kgm为健康食品及食品添加剂。由于kgm分子上含有很多活泼羟基(-oh)，导致其亲水性强，稳定性差，限制了应用范围。研究发现，对kgm上的-oh进行酯化修饰后不仅能提高kgm衍生物的稳定性，而且可以改善其生物活性，如抑菌、抗凝血等。脂肪酸来源于天然油脂资源，具有强疏水性。采用酯化法将脂肪酸与kgm糖苷上的-oh进行酯化得到kgm糖基脂肪酸酯，不仅能改善产品的稳定性和亲水亲油性，而且有望发展成一类具有营养保健功效的食品乳化剂。
kgm糖基脂肪酸酯的合成法主要有生物合成法和化学合成法，其中化学合成法具有反应速度快、转化率高等优点，但存在反应温度高、副反应多、能耗高以及污染环境等问题；生物合成法具有反应条件温和、绿色安全以及副反应少等优点，但存在反应时间长、反应效率低等问题，制约了kgm糖基酯规模化制备的发展。目前，国内外有一些关于kgm糖基脂肪酸酯的合成报道，中国专利200410052499.7公开了有机介质中生物催化制备魔芋葡甘聚糖酯的方法，该方法反应时间较长，为12-48h；中国专利200410052498.2公开了一种无溶剂体系中生物催化制备魔芋葡甘聚糖酯的方法，反应时间长达6-24h；中国专利200610035615.3公开了混合溶剂中生物催化制备魔芋葡甘聚糖酯的方法，反应时间为6-48h；上述方法普遍存在反应时间长，酶和反应溶剂的用量大等问题。
超声波的空穴效应所产生的强烈冲击波和微射流可促进反应体系中各反应物间充分接触，提高传质速率，从而避免采用高温高压等剧烈反应条件，缩短反应时间，提高反应效率。微波辐射加热是内加热模式，其加热均匀、速度快、无加热滞后性及温度梯度，研究发现，适宜强度的微波辐射在协同酶进行催化时能直接作用于酶的官能团，使反应体系可以迅速达到酶的最适反应温度，增强酶的催化活性，从而提高反应速度与转化率或产率。目前，涉及微波或超声波辅助催化酯化制备kgm糖基酯的报道很少。f.b.meng等(f.b.meng,l.j.zheng,y.h.wang,y.x.liang,g.zhong,preparationandpropertiesofkonjacglucomannanoctenylsuccinatemodifiedbymicrowavemethod.foodhydrocolloids,38：205-210(2014))以无机物na2co3为催化剂，微波辅助催化酯化辛基琥珀酸与kgm，得到kgm辛基琥珀酸酯。尚未见以超声波-微波联合强化进行kgm糖基酯酶促合成的研究报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种超声-微波辅助酶促合成魔芋葡甘聚糖基脂肪酸酯的方法，本方法具有条件温和、反应速度快、辅料用料少、制备的产品魔芋葡甘聚糖基酯纯度和产率高的特点。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：一种超声-微波辅助酶促合成魔芋葡甘聚糖基脂肪酸酯的方法，其特征在于它包括如下步骤：
1)反应原辅料的投放：将魔芋葡甘聚糖、脂肪酸、酶、反应溶剂加入反应器中，得到混合物；其中魔芋葡甘聚糖与脂肪酸的摩尔比为1:1-1:5，酶与魔芋葡甘聚糖的添加量之比为100-2000u/g，反应溶剂的体积与魔芋葡甘聚糖的质量比为5-50ml/g；
2)超声波-微波辅助酶催化酯化反应：将混合物采用超声-微波交替作用于常压搅拌反应3-6h，反应温度控制在30℃-70℃，反应结束后停止超声、微波和搅拌，自然冷却至室温，得到反应混合物；
3)产物后处理：反应混合物过滤除去酶，正己烷萃取除去残留的脂肪酸，反应混合物(余下的反应混合物)加入等体积水混合，然后加入体积比1:1的环己烷-正丁醇提取糖酯，并旋转蒸发除去环己烷-正丁醇(即有机相溶剂)，所得产物用无水乙醇洗涤2-3次，真空干燥，即得到魔芋葡甘聚糖基脂肪酸酯。
按上述方案，步骤1)中，反应溶剂的初始水分活度0.3-0.8。
按上述方案，步骤1)所述的魔芋葡甘聚糖的相对分子量在3000-100000，纯度95wt％以上。
按上述方案，所述脂肪酸为c6-c22不同碳链长度的脂肪酸(如：油酸、亚油酸、辛酸、月桂酸中的一种)。
按上述方案，所述反应溶剂为离子液体[moemim][br]、[c2mim][bf4]、[c4mim][bf4]、[c8mim][bf4]、[c4mim][pf6]中的一种或任意二中以上按任意配比的混合物。
按上述方案，所述酶的种类包括南极假丝酵母脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、金黄色葡萄球菌脂肪酶、细毛嗜热霉脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、al-89碱性蛋白酶中的一种。
按上述方案，步骤2)中所述的超声-微波交替作用为：超声与微波交替进行，先超声后微波，超声与微波之间歇时间为2-5min；其中，每次超声波处理时间为5-10min，每次微波处理时间为1-5min；超声功率为50-300w，超声频率为10-50khz，微波功率为10-100w。
按上述方案，步骤2)中所述的常压搅拌速率为100-300r/min。
本发明通过在整个反应过程中将超声和微波间歇性地交替作用于反应体系，避免了微波连续性作用会导致反应体系过热而使酶失活的问题，充分利用了超声(传质)和微波(传热)对反应体系的强化优势，同时极大地提高了魔芋葡甘聚糖基脂肪酸酯的酶促转化效率。本方法具有反应条件温和，反应速度快，产品得率高，绿色环保等特点，解决了现有魔芋葡甘聚糖酯制备方法存在的速率和产率低、反应时间长、辅料用量大、污染环境等问题。
本发明的有益结果是：
1.相比现有的魔芋葡甘聚糖酯的制备方法，本发明中超声-微波辅助反应具有常压进行(反应条件温和、能耗低)，反应时间短、反应速度快，效率高等优点，3-6h酯化率可达到80％以上，产率高；
2.相比于现有的魔芋葡甘聚糖酯的制备方法，本发明中酶的用量和反应溶剂的用量减少一半以上，可明显提高原辅料利用率。
3.本发明充分利用了超声和微波各自对反应体系的强化优势，避免了微波连续性作用会导致反应体系过热而使酶失活的问题，与目前普遍采用的超声和微波贯穿整个反应过程相比，不仅提高了反应效率，而且能耗更低。
4.本发明制备的产品魔芋葡甘聚糖基酯纯度高(纯度90wt％以上)。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1：
一种超声-微波辅助酶促合成魔芋葡甘聚糖基脂肪酸酯的方法，它包括如下步骤：
(1)反应原辅料的投放：将5g纯度98wt％、相对分子量3000的魔芋葡甘聚糖、1g油酸、500u脂肪酶novozym435(源于南极假丝酵母脂肪酶)、50ml反应溶剂[moemim][br]加入反应器中，调节反应溶剂初始水分活度为0.38；其中魔芋葡甘聚糖与脂肪酸的摩尔比为1:2.2；
(2)超声波-微波辅助酶催化酯化反应：将混合物采用超声-微波交替作用于常压搅拌反应，搅拌速率100r/min，超声与微波交替进行，先超声后微波，超声与微波之间歇时间为2min；超声功率200w，超声频率35khz，微波功率50w，总处理时间约为300min；其中，每次超声波处理时间为8min，每次微波处理时间为2min，反应温度控制在50℃。
(3)产物后处理：反应混合物冷却过滤除去酶，正己烷萃取除去残留的油酸，余下的反应混合物加入等体积水混合，然后加入体积比1:1的环己烷-正丁醇提取糖酯，并旋转蒸发除去有机相溶剂(即环己烷-正丁醇)，所得产物用无水乙醇洗涤2次，真空干燥，即得到酯化率85％，纯度94wt％的魔芋葡甘聚糖基油酸酯。
实施例2：
一种超声-微波辅助酶促合成魔芋葡甘聚糖基脂肪酸酯的方法，它包括如下步骤：
(1)反应原辅料的投放：将5g纯度98wt％、相对分子量30000的魔芋葡甘聚糖、0.19g亚油酸、1000ulipasea12(黑曲霉脂肪酶)、50ml反应溶剂[c2mim][bf4]加入反应器中，调节反应溶剂初始水分活度为0.43；其中魔芋葡甘聚糖与脂肪酸的摩尔比为1:4。
(2)超声波-微波辅助酶催化酯化反应：将混合物采用超声-微波交替作用于常压搅拌反应，搅拌速率200r/min，超声与微波交替进行，先超声后微波，超声与微波之间歇时间为4min；超声功率150w，超声频率30khz，微波功率70w，总处理时间约为360min，其中，每次超声波处理时间为10min，每次微波处理时间为1min，反应温度控制在55℃。
(3)产物后处理：反应混合物冷却过滤除去酶，正己烷萃取除去残留的亚油酸，余下的反应混合物加入等体积水混合，然后加入体积比1:1的环己烷-正丁醇提取糖酯，并旋转蒸发除去有机相溶剂(即环己烷-正丁醇)，所得产物用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，即得到酯化率83％，纯度92wt％的魔芋葡甘聚糖基亚油酸酯。
实施例3：
一种超声-微波辅助酶促合成魔芋葡甘聚糖基脂肪酸酯的方法，它包括如下步骤：
(1)反应原辅料的投放：将5g纯度98wt％、相对分子量50000的魔芋葡甘聚糖、0.07g辛酸、3000u脂肪酶novozym435(来源于南极假丝酵母脂肪酶)、100ml反应溶剂[c4mim][bf4]加入反应器中，调节反应溶剂初始水分活度为0.55；其中魔芋葡甘聚糖与脂肪酸的摩尔比为1:5。
(2)超声波-微波辅助酶催化酯化反应：将混合物采用超声-微波交替作用于常压搅拌反应，搅拌速率150r/min，超声与微波交替进行，先超声后微波，超声与微波之间歇时间为3min；超声功率250w，超声频率35khz，微波功率70w，总处理时间约为350min，其中，每次超声波处理时间为10min，每次微波处理时间为1min，反应温度控制在55℃。
(3)产物后处理：反应混合物冷却过滤除去酶，正己烷萃取除去残留的辛酸，余下的反应混合物加入等体积水混合，然后加入体积比1:1的环己烷-正丁醇提取糖酯，并旋转蒸发除去有机相溶剂(即环己烷-正丁醇)，所得产物用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，即得到酯化率82％以上，纯度95wt％以上的魔芋葡甘聚糖基辛酸酯。
实施例4：
一种超声-微波辅助酶促合成魔芋葡甘聚糖基脂肪酸酯的方法，它包括如下步骤：
(1)反应原辅料的投放：将5g纯度98wt％、相对分子量5000的魔芋葡甘聚糖、0.2g月桂酸、5000u嗜热菌蛋白酶、250ml反应溶剂[c8mim][bf4]加入反应器中，调节反应溶剂初始水分活度为0.8；其中魔芋葡甘聚糖与脂肪酸的摩尔比为1:1。
(2)超声波-微波辅助酶催化酯化反应：将混合物采用超声-微波交替作用于常压搅拌反应，搅拌速率300r/min，超声与微波交替进行，先超声后微波，超声与微波之间歇时间为2min；超声功率50w，超声频率10khz，微波功率100w，总处理时间为240min，其中，每次超声波处理时间为5min，每次微波处理时间为5min，反应温度控制在70℃。
(3)产物后处理：反应混合物冷却过滤除去酶，正己烷萃取除去残留的月桂酸，余下的反应混合物加入等体积水混合，然后加入体积比1:1的环己烷-正丁醇提取糖酯，并旋转蒸发除去有机相溶剂(即环己烷-正丁醇)，所得产物用无水乙醇洗涤2次，真空干燥，即得到酯化率88％，纯度95wt％的魔芋葡甘聚糖基月桂酸酯。
实施例5：
一种超声-微波辅助酶促合成魔芋葡甘聚糖基脂肪酸酯的方法，它包括如下步骤：
(1)反应原辅料的投放：将5g纯度98wt％、相对分子量3000的魔芋葡甘聚糖、1.2g辛酸、10000uproteasetypeviii(来自枯草杆菌蛋白酶)、25ml反应溶剂[c4mim][pf6]加入反应器中，调节反应溶剂初始水分活度为0.6；其中魔芋葡甘聚糖与脂肪酸的摩尔比为1:5。
(2)超声波-微波辅助酶催化酯化反应：将混合物采用超声-微波交替作用于常压搅拌反应，搅拌速率200r/min，超声与微波交替进行，先超声后微波，超声与微波之间歇时间为5min；超声功率300w，超声频率50khz，微波功率10w，总处理时间为360min，其中，每次超声波处理时间为6min，每次微波处理时间为1min，反应温度控制在30℃。
(3)产物后处理：反应混合物除去酶，正己烷萃取除去残留的辛酸，余下的反应混合物加入等体积水混合，然后加入体积比1:1的环己烷-正丁醇提取糖酯，并旋转蒸发除去有机相溶剂(即环己烷-正丁醇)，所得产物用无水乙醇洗涤2次，真空干燥，即得到酯化率80％，纯度90wt％的魔芋葡甘聚糖基辛酸酯。
本发明中所有原料上下限值都能实现本发明；本发明所列举的各原料都能实现本发明；及工艺参数(如温度、时间等)的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。