本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种检测环状rnaman1a2和长链非编码rnaloc284454的试剂在制备肿瘤辅助诊断制剂上的应用和相应的试剂盒。
背景技术
恶性肿瘤严重危害着人类的健康，近年来中国恶性肿瘤发病率呈现上升的趋势。据中国癌症统计中心统计，恶性肿瘤新发病数约为380.4万例，其中男性患者211.4万例，女性患者169.0万例，大约每一天超过1万人次能被确诊为癌症，大约每分就有7人次被确诊为癌症。恶性肿瘤发病率为278.07/10万，其中男性恶性肿瘤的发病率为301.67/10万，女性恶性肿瘤发病率为253.29/10万。恶性肿瘤发病率的中标率为190.63/10万(人口标准率按2000年中国的标准人口结构),恶性肿瘤发病率世标率为186.53/10万(人口标准率按segi's世界标准人口结构)，0-74岁的累积发病率大约为21.58％。恶性肿瘤死亡率大约为167.89/10万，其中中标率约106.98/10万，世标率约106.09/10万，0-74岁的累积死亡率约为12.00％。
据美国癌症协会(acs)统计，美国恶性肿瘤预计新发病数约173.5万例，日均新发4700例。美国恶性肿瘤的发病率稳步下降，同时恶性肿瘤死亡率每年以1.5％的速度下降。美国恶性肿瘤发病率的明显下降，可能归因于控制吸烟、推广多层次癌症筛查及癌症新型疗法的广泛应用。
由此可见，减少恶性肿瘤的发病因素、有效的早期诊断及新型癌症治疗方法的探索对癌症的控制有着重大的作用。所以我国的医学研究中正致力于寻找新型的肿瘤标志物，以期为恶性肿瘤的早期诊断，以及尽早方便准确的确诊病情从而有利于治疗提供新的途径。
环状rna(circualrna,circrna)是一类新的rna分子，其构型与传统的线性rna(含5’和3’末端)不同，环状rna分子呈封闭环状结构(即5’和3’端首尾相连)，由于没有游离的5’和3’末端，因此环状rna比线性rna更加稳定。起初circrna被认为是一种拼接错误的副产物，并未受到广泛的关注，近年来，基于新一代测序技术的rna-sequencing广泛应用推动了rna许多领域的飞速发展，大量新的circrna被发现，从而把circrna推向了恶性肿瘤基因组学研究的舞台中央。
circrna作为一种新兴的rna，其行成以及功能机制吸引着越来越多的研究。随着越来越多的circrna被鉴别，发现一些circrna的表达水平远远高于其相关线性基因的表达。circrna以共价键形成环状结构，多数circrna是反向拼接的产物，在机体广泛的表达，有时其表达水平是线性rna的10倍，大多定位于胞质。circrna可以作为mirna的分子海绵吸附mirna、结合蛋白质、或作为基因转录和蛋白翻译的调控因子等发挥重要的生物学功能，很有可能成为恶性肿瘤新的生物标志物和临床治疗靶标，为肿瘤的诊断及预后提供新思路。
长链非编码rnas(longnon-codingrnas,lncrnas)是一类长度超过200nt、缺少特异完整的开放阅读框、无或很少有蛋白编码功能的rnas分子。最近的研究表明，lncrnas通过在表观遗传、转录和转录后水平广泛调节基因的表达，它们参与了生物体生长、发育、衰老及死亡等重要生命活动的调控。越来越多的研究表明lncrnas的异常表达或功能缺失与肿瘤的发生发展密切相关。一些lncrnas分子在肿瘤的诊断和治疗方面具有重要的意义，且可以作为肿瘤预后判断新的分子标记。
因此，需要筛选和验证更多的新型非编码rna作为癌症诊断和预后的生物标志物及其应用，并能尽早在专利领域得到好的保护，能显著提升我国在该技术领域的国际竞争力。
技术实现要素：
本发明从rnaseq数据中筛选出高表达的circrna和incrna，并分别在多种类型的癌症中先后验证它们的表达情况，寻找到新兴的circrna和incrna能够作为诊断恶性肿瘤的血清分子标志物。
因此，本发明的第一个目的是提供一种检测检测circman1a2和loc284454试剂的应用，所述的试剂用于制备肿瘤辅助诊断制剂，环状rnacircman1a2，其序列如seqno.1所示，长链非编码rnaloc284454，其序列如seqno.2所示。为肿瘤辅助诊断提供了一种新的准确可靠的，简便的检测途径。
血清作为检测样本，相比于组织检测，样本获取方式以及操作方便，成本低，准确性高，用于肿瘤的诊断非常理想。因此，申请人在研究过程中采用血清作为样本，通过大量试验寻找和验证血清中与肿瘤诊断相关的分子，以及他们与肿瘤之间存在的关系。申请人首次发现在血清中存在的环状rnacircman1a2和长链非编码rnaloc284454与多种类型的肿瘤存在正相关的关系，通过检测其在血清中的含量，可以方便的用于辅助或者初步诊断患有肿瘤的可能性。
本发明采用sybr-qpcr或者taqmanprobeq-pcr的实验方法分别在鼻咽癌、口腔癌、甲状腺癌中先后验证circman1a2和loc284454的表达情况。
由于本发明用于验证circman1a2和loc284454的表达情况所收集的样本数充足，具有统计学意义，而且样本来源合理，筛选标准严格，试验过程严谨，结果真实可靠。
本发明试验结果显示circman1a2和loc284454在鼻咽癌、口腔癌、甲状腺癌患者血清中表达均明显上调，呈现出在多种类型肿瘤中表达趋势的一致性，预示着circman1a2和loc284454分子可以分别单独作为肿瘤诊断的分子标记物，但经过统计学分析发现，两种非编码rna联合起来共同判断，其准确性更高。
上述应用中，所述的检测circman1a2和loc284454的试剂包括实时荧光定量检测试剂。
为了确保引物的特异性和qpcr的精确性，申请人严格遵循rna引物设计原则，设计出能准确扩增用于实时荧光定量检测环状rnaman1a2表达的引物：
上游引物：5’-agatgggcaaagatggattga-3’
下游引物：5’-gccttctcatgatcagctcg-3’；
以及用于实时荧光定量检测长链非编码rnaloc284454表达的引物：
上游引物：5’-attacaggtggctcaggtgt-3’
下游引物：5’-cttcagtgtgcctcctcagt-3’
本发明的第二个目的是提供一种用于肿瘤辅助诊断的试剂盒；为肿瘤辅助诊断提供了一种新的准确可靠的检测产品。
所述的试剂盒含有能检测血清中环状rnacircman1a2和长链非编码rnaloc284454的试剂；所述的环状rnacircman1a2的序列如seqno.1所示，所述的长链非编码rnaloc284454的序列如seqno.2所示。
进一步的，所述的能扩增环状rnacircman1a2的引物优选以下引物：
上游引物：5’-agatgggcaaagatggattga-3’
下游引物：5’-gccttctcatgatcagctcg-3’。
能扩增长链非编码rnaloc284454的引物：
上游引物：5’-attacaggtggctcaggtgt-3’
下游引物：5’-cttcagtgtgcctcctcagt-3’
但本发明所述的能扩增环状rnacircman1a2和长链非编码rnaloc284454的引物不限于上述提供的引物。
由于人类血清中无内参基因，我们优选加入了pgl3质粒作为参照，来减少rna抽提过程中的误差，例如rna吸附效率、洗脱效率的差异，同时也为研究提供更加可靠的实验数据。因为定量加入的pgl3质粒，就可以依据q-pcr反应所得的ct值计算出目标基因相对应的拷贝数，从而可以达到绝对定量。外参基因的加入，减少了实验中存在的系统误差，从而为研究提供可信度更高的数据信息。
因此，
进一步的，本发明所述的试剂盒还包括：内参pgl3引物：
上游引物：5’-tccatcttgctccaacaccc-3’
下游引物：5’-tcgtctttccgtgctccaaa-3’。
但本发明的内参引物不仅仅限于上述提供的内参pgl3引物。
taqman探针具有高度的特异性，灵敏度高且特异性较好。sybr法需要在不同ep管中进行pcr反应，而taqman探针法可以实现在一个ep管中同时检测多个基因，从而又减少了实验误差。taqmanprobe-qpcr的实验方法较严谨，信度与可重复性较高，并且可以多种样本同时检测，实验的可重复性好，实验所获得的数据更为可靠，为临床应用价值的评判提供扎实的基础。
因此，
进一步的，本发明所述的试剂盒优选还包括：用于实时荧光定量检测环状rnacircman1a2表达的引物配套的taqman探针：5’-rox-caaagatggattgaagacaaccttgatttcagtgtg-bhq2-3’。
用于实时荧光定量检测长链非编码rnaloc284454表达的引物配套的taqman探针：
5’-fam–cgtgcctggcttttctccactatcttg-bhq1-3’
进一步的，本发明所述的试剂盒优选还包括：内参pgl3引物配套的taqman探针：5’-hex-acgcaggtgtcgcaggtcttcc-bhq1-3’。
但本发明所使用的taqman探针不仅仅限于上述提供的配套探针。
进一步的，本发明试剂盒中还含有：血清总rna提取试剂、rna逆转录pcr反应试剂和实时荧光定量检测试剂。
本发明从多种肿瘤患者血清和正常人血清样本中抽提rna后逆转录，实时荧光定量法检测了circman1a2和loc284454的表达，结果显示circman1a2和loc284454在多种类型的肿瘤患者血清中均表达上调。首次发现在血清中存在环状rna分子circman1a2和长链非编码loc284454与多种类型的肿瘤存在统一的正向相关关系，从而提示circman1a2和loc284454可作为肿瘤辅助诊断的分子标志，尤其是两者联合起来，准确率更高。本发明为肿瘤的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
附图说明
图1为circman1a2图谱；
图2为内参质粒pgl3q-pcr标准曲线。
图3为sybr-qpcr检测loc284454和circman1a2在鼻咽癌患者血清中的表达；
图中a,b分别为sybr-qpcr检测loc284454、circman1a2在鼻咽癌患者血清中的表达水平，其中与正常对照组相比，loc284454、circman1a2在鼻咽癌患者血清中表达上调，p＜0.001；n代表正常对照组，t代表鼻咽癌组，n代表样本数。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图4为taqman-qpcr检测loc284454和circman1a2在鼻咽癌患者血清中的表达；
图中a,b分别为taqman-qpcr检测loc284454和circman1a2在鼻咽癌患者血清中的表达水平，其中与正常对照组相比，loc284454和circman1a2在鼻咽癌患者血清中表达上调，p＜0.001；n代表正常对照组，t代表鼻咽癌组，n代表样本数。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图5为鼻咽癌组roc曲线；
图中a,b,c分别为loc284454、circman1a2、loc284454联合circman1a2的roc曲线。
图6为taqman-qpcr检测loc284454和circman1a2在口腔癌患者血清中的表达；
图中a,b分别为taqman-qpcr检测loc284454和circman1a2在口腔癌患者血清中的表达水平，其中与正常对照组相比，loc284454和circman1a2在口腔癌患者血清中表达上调，p＜0.001；n代表正常对照组，t代表口腔癌组，n代表样本数。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图7为口腔癌组roc曲线；
图中a,b,c分别为loc284454、circman1a2、loc284454联合circman1a2的roc曲线。
图8为taqman-qpcr检测loc284454和circman1a2在甲状腺癌患者血清中的表达；
图中a,b,c分别为taqman-qpcr检测loc284454和circman1a2在甲状腺癌患者血清中的表达水平，其中与正常对照组相比，loc284454和circman1a2在甲状腺癌患者血清中表达上调，p＜0.001；n代表正常对照组，t代表甲状腺癌组，n代表样本数；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图9为甲状腺癌组roc曲线；
图中a,b,c分别为loc284454、circman1a2、loc284454联合circman1a2的roc曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非形成对本发明的限制。
本发明中采用的正常对照组与肿瘤组血清样本，分别来自于中南大学湘雅二医院体检中心与湖南省肿瘤医院检验中心。正常对照组共收集121例，已排除肿瘤性疾病、无传染病、严重免疫性疾病及其他重大疾病；肿瘤组血清样本包括：鼻咽癌患者血清样本100例，口腔癌患者血清样本55例，甲状腺癌患者血清样本57例，血样收集时间区间：2017年3月至2018年1月。收集的血样逐步完整临床资料，包括患者姓名、性别、年龄、住院编号、病理类型、病理分期、身份证号、接受治疗情况等。所有血清样本均征得被采集者或患者的同意，逐步建立临床资料较完整的血样库。
1、realtimepcr引物
本发明所用的引物和探针均通过专用的引物设计网站primer3.0进行设计。引物合成工作委托擎科生物工程公司合成。为了确保引物的特异性和qpcr的精确性，我们严格遵循以下引物设计原则：
探针设计原则：
本发明所使用引物及taqman探针序列如下：
(1)pgl3引物
上游引物：5’-tccatcttgctccaacaccc-3’；
下游引物：5’-tcgtctttccgtgctccaaa-3’；
taqman探针：5’-hex-acgcaggtgtcgcaggtcttcc-bhq1-3’；
(2)loc284454引物
上游引物：5’-attacaggtggctcaggtgt-3’
下游引物：5’-cttcagtgtgcctcctcagt-3’；
taqman探针
5’-fam–cgtgcctggcttttctccactatcttg-bhq1-3’
(3)circman1a2引物
上游引物：5’-agatgggcaaagatggattga-3’；
下游引物：5’-gccttctcatgatcagctcg-3’；
taqman探针：5’-rox-
caaagatggattgaagacaaccttgatttcagtgtg-bhq2-3’；
circman1a2，见图1。
2方法
2.1癌症患者外周血样本采集
样本采集流程如下：
(1)采用edta抗凝采血管收集外周血标本，采集空腹静脉血1～2ml，上下颠倒采血管轻柔混匀，避免溶血；
(2)将全血标本4℃，1600g离心10min，提取500-1000μl血浆置于预冷的ep管内，管上注明患者姓名和病案号或者正常人的姓名；
(3)血浆标本提取后立即放置-80℃冰箱保存，全部流程于血液离体后4小时内处理完毕；
(4)填写《样本信息记录表》，收集患者和正常人姓名、性别、年龄等信息，及患者住院编号、病理类型、病理分期、身份证号、接受治疗等临床资料。
2.2血清总rna抽提
采用mirneasyserum/plasmakit试剂盒，具体步骤如下：
(1)将200ul血浆置于2mlep管；
(2)向ep管加入5倍体积的裂解液(即1000ul)，涡旋或用移液枪充分混匀；
(3)将ep管中溶解产物室温(15-25℃)放置5min；
(4)加入外参pgl3充分混匀(1.6*108copies/ul)；
(5)加入等样本体积的氯仿(即200ul)，涡旋或用力摇动15s；
(6)室温(15-25℃)放置2-3min；
(7)离心12000g，4℃，15min，用完调试离心机至室温，上层无色水相为rna；中层白色为dna；下层红色有机相为蛋白；
(8)吸取上层水相到新的2mlep管中(600ul)，加入1.5倍体积100％的酒精900ul，用移液枪充分混匀，加入酒精可能形成沉淀但无影响；
(9)将柱子放入2mltube管中，吸取700ul至柱子，关紧盖子离心≥8000g(10000rpm)，15s，室温(15-25℃)，弃收集管中废液；
(10)重复(9)，将剩余样本过柱子，弃收集管中废液；
(11)加入700ulbufferrwt至柱子，关紧盖子离心，≥8000g(10000rpm)，15s，弃收集管中废液；
(12)加入500ulbufferrpe至柱子，关紧盖子离心，≥8000g(10000rpm)，15s，弃收集管中废液；
(13)加入500ul80％酒精于柱子，轻关紧盖子离心，≥8000g(10000rpm),2min，洗柱子，弃收集管(小心移动柱子，避免沾上收集管的废液)；
(14)将柱子放入新的2mltube管中，打开盖子，全速离心5min，干燥，弃收集管(为避免损毁盖子，间隔放置，使盖子朝上与转子转向相反)；
(15)将柱子放于新的1.5mltube管中，加入14ul无酶水至柱子薄膜中央，轻关柱子，全速离心1min，洗脱rna至1.5mltube管中约12ul。
我们加入了pgl3质粒作为参照，为本发明提供更加可靠的实验数据。
加入的参照质粒浓度为每ml血清加pgl3约2×108拷贝根据计算，约为每ml血清加1ng质粒；
realtimepcr采用的10μl反应体系如下：
pgl3质粒标准曲线绘制过程如下：取1ng质粒加无酶水定容到500μl，再从中取2μl加无酶水定容到1ml，作为第1管；随后逐步对半稀释，亦即：从第2管中取500ul质粒溶液放入第2管，加无酶水500ul，混匀；从第2管中再去500ul质粒溶液放入第三管，加无酶水500ul，混匀；以此类推。最后每管中各取1ul作为荧光定量pcr的模版。
q-pcr结果如下：
绘制的标准曲线图见图2。
2.3rna逆转录pcr反应
对提取的总rna进行浓度测定，然后将rna定量，按照设定的逆转录程序从3’端开始合成，得到cdna。
1.将以下试剂依次添加至无菌无酶管中：
2.温和的混匀并瞬时离心，65℃孵育5min；
3.将以下试剂增添至以上混合液中，终体积为20ul；
4.轻柔的混匀并瞬时离心，按以下程序操作：
反应完成所得cdna(complementarydna)保存于-20℃。
2.4实时荧光定量pcr
sybr法实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr,q-pcr)反应体系：itaqtmuniversal
sybr法实时荧光定量pcr反应步骤：
反应结束后确认实时荧光定量pcr的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据ct值(thresholdcyclevalues)、内参基因(pgl3)标化后，采用unpairedt-test检验计算p值。
taqmanprobe法实时荧光定量pcr反应体系：
itaqtmuniversalprobessupermix：
taqmanprobe实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr,q-pcr)反应体系：
taqmanprobe实时荧光定量pcr反应步骤：
反应结束后确认各基因的表达强度根据ct值(thresholdcyclevalues)、外参基因(pgl3)标化后，采用unpairedt-test检验计算p值。
2.5统计学分析
统计分析采用spss13.0和graphpad5.0软件进行。
3结果
3.1loc284454和circman1a2在鼻咽癌患者血清中高表达
实验采用了100例鼻咽癌患者血清与51例正常对照者血清，实验结果显示：与正常对照组相比，loc284454和circman1a2在鼻咽癌患者血清中表达上调，见图3。
为保证实验数据真实性与可靠性，减少实验过程中的误差，我们随后设计了loc284454和circman1a2的taqman探针，采取taqmanprobeq-pcr的实验方法检测loc284454和circman1a2在鼻咽癌患者血清中的表达情况，并将正常对照增加到了121例，如图4。结果显示：与正常对照组血清相比，loc284454和circman1a2在鼻咽癌患者血清中的表达水平明显升高，具有统计学意义(p＜0.001)。
3.2鼻咽癌roc曲线评估临床应用价值
本发明验证出loc284454和circman1a2在鼻咽癌中表达上调，采用roc曲线评估loc284454和circman1a2的临床应用价值。
当auc值在0.5和1.0之间，auc>0.5时，auc越接近于1，表明特异性与灵敏性越好，临床应用价值越大。
我们依据loc284454和circman1a2在鼻咽癌中的表达水平，进行roc曲线分析，如图5。roc曲线分析loc284454的auc数值为0.931；circman1a2的auc数值为0.911；联合两种分子的roc曲线分析的auc数值为0.968，说明联合两种分子在肿瘤诊断上的准确性更高。
loc284454单一分子roc曲线分析
曲线下方面积(auc)
所分析的参数:loc284454
a.基于非参数假定
b.零假设:真实面积＝0.5
circman1a2单一分子roc曲线分析
曲线下方面积(auc)
所分析的参数:circman1a2
a.基于非参数假定
b.零假设:真实面积＝0.5
loc284454联合circman1a2roc曲线分析
曲线下方面积(auc)
所分析的参数:loc284454和circman1a2
a.基于非参数假定
b.零假设:真实面积＝0.5
3.3loc284454和circman1a2在口腔癌患者血清中高表达
实验采用了55例口腔癌患者血清与121例正常对照者血清，设计了
loc284454和circman1a2的taqman探针，采取taqmanprobeq-pcr的实验方法检测loc284454和circman1a2在口腔癌患者血清中的表达情况，如图6所示。结果显示：与正常对照组血清相比，loc284454和circman1a2在口腔癌患者血清中的表达水平明显升高，具有统计学意义(p＜0.001)。
3.4口腔癌roc曲线评估临床应用价值
本发明验证出loc284454和circman1a2在口腔癌中表达上调，采用roc曲线评估loc284454和circman1a2的临床应用价值。
我们依据loc284454和circman1a2在口腔癌中的表达水平，进行roc曲线分析，如图7。roc曲线分析loc284454的auc数值为0.698；circman1a2的auc数值为0.779，联合两种分子的roc曲线分析的auc数值为0.832，说明联合两种分子在肿瘤诊断上的准确性更高。
loc284454单一分子roc曲线分析
曲线下方面积(auc)
所分析的参数:loc284454
a.基于非参数假定
b.零假设:真实面积＝0.5
circman1a2单一分子roc曲线分析
曲线下方面积(auc)
所分析的参数:circman1a2
a.基于非参数假定
b.零假设:真实面积＝0.5
loc284454联合circman1a2roc曲线分析
曲线下方面积(auc)
所分析的参数:loc284454和circman1a2
a.基于非参数假定
b.零假设:真实面积＝0.5
3.5loc284454和circman1a2在甲状腺癌患者血清中高表达
在57例甲状腺癌患者血清和121例正常对照者血清中我们采取taqmanprobeq-pcr的实验方法检测loc284454和circman1a2在甲状腺癌患者血清中表达水平，结果显示：与正常对照组相比，loc284454和circman1a2在甲状腺癌患者血清中表达水平明显升高，具有统计学意义(p＜0.001)，如图8。
3.6甲状腺癌roc曲线评估临床应用价值
本发明验证出loc284454和circman1a2在甲状腺癌中表达上调，采用roc曲线评估loc284454和circman1a2的临床应用价值。
我们依据loc284454和circman1a2在甲状腺癌中的表达水平，进行roc曲线分析，如图9。roc曲线分析loc284454的auc数值为0.834；circman1a2的auc数值为0.734；联合两种分子的roc曲线分析的auc数值为0.844，说明联合两种分子在肿瘤诊断上的准确性更高。
loc284454单一分子roc曲线分析
曲线下方面积(auc)
所分析的参数:loc284454
a.基于非参数假定
b.零假设:真实面积＝0.5
circman1a2单一分子roc曲线分析
曲线下方面积(auc)
所分析的参数:circman1a2
a.基于非参数假定
b.零假设:真实面积＝0.5
loc284454联合circman1a2roc曲线分析
曲线下方面积(auc)
所分析的参数:loc284454和circman1a2
a.基于非参数假定
b.零假设:真实面积＝0.5。
序列表
<110>中南大学
<120>检测circman1a2和loc284454试剂的应用及试剂盒
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>553
<212>dna
<213>未知(unknown)
<400>1
ggaagaggaagaacgtctgagaaataaaattcgagctgatcatgagaaggccttggaaga60
agcaaaagaaaaattaagaaagtcaagagaggaaattcgagcagaaattcagacagagaa120
aaataaggtagtccaagaaatgaagataaaagagaacaagccactgccaccagtccctat180
tcccaaccttgtaggaatacgtggtggagacccagaagataatgacataagagagaaaag240
ggaaaaaattaaagagatgatgaaacatgcttgggataactataggacatatgggtgggg300
acataatgaactcagacctattgcaaggaaaggacactcccctaacatatttggaagttc360
acaaatgggtgctaccatagtagatgctttggataccctttatatcatgggacttcatga420
tgaattcctagatgggcaaagatggattgaagacaaccttgatttcagtgtgaattcaga480
ggtgtctgtgtttgaagtcaacattcgatttattggaggcctacttgcagcatattacct540
atcaggagaggag553
<210>2
<211>1774
<212>rna
<213>未知(unknown)
<400>2
ggggucaagcccccuuggagccugcagccccugccuucccugggugggcugaugcuugga60
gcagagaugaggacucagaaucagaccugugucuggaggagggauguggugggugggguu120
ggcugggcccaaaugugugcugcaggcccugauccccaacucugcaacuggggaccccug180
cauggccacagcucaggcugggcuguggugccagcauagauaggugggugaguggguggc240
ccuuccauuaaaagggaagccagcuguguccuuuccgggccuggaggcuuggccccuccu300
cucccaagccuggcaggggcacuggcccggcccgcaccuuccuagcagccaguuacccaa360
gaggaagcugccuugggccuccagaccguuaaaugccaacuccuggcuuccgguaucagg420
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