本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及到转氨酶序列荧光假单胞杆菌(pseudomonasfluorescenszjb09-108)的基因，表达载体、基因工程菌及其在制备不对称手性胺化合物中的应用。(二)
背景技术：
：转氨酶(aminetransaminase,ata,ec2.6.1.x)属于转移酶类，是催化氨基供体上的氨基转移到潜手性的酮类化合物上，得到手性胺和副产物酮或者α-酮酸的一类酶，反应过程需要磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate,plp)的参与，其催化的反应是可逆的。转氨酶广泛存在于自然界中并在细胞的氮代谢过程中发挥着重要的氨基转移作用。在一般情况下，所有的转氨酶都可根据在其可逆反应中所利用的氨基酸底物进行分类，根据其催化活力最大的氨基酸来命名，比如天冬氨酸转氨酶和苯丙氨酸转氨酶的氨基供体最适底物分别为天冬氨酸和苯丙氨酸；而根据氨基被转移到不同位置的氨基受体上，转氨酶又可以被分为α-转氨酶和ω-转氨酶。α-转氨酶需要一个α位置的羰基受体来发挥其催化功能，但转氨酶在原则上可以催化转化任何结构的酮和胺，因而具有更高的应用价值。ω-转氨酶反应过程可分为两步，第一步反应是在ω-转氨酶的作用下将氨基供体上的氨基转移到plp的羰基上，从而形成5-磷酸吡哆胺(pmp)和与氨基供体对应的酮；第二步反应同样在ω-转氨酶的作用下将pmp上的氨基转移到氨基受体上，pmp又转变为plp实现循环。随着社会经济的不断发展，手性胺类化合物是非常重要的药物和药物中间体，在制药行业和农业、化工等方面发挥着越来越重要的作用，大量高纯度的手性化合物应用到其中。目前，手性胺类化合物的制备方法主要是化学合成和生物合成的方法。化学合成手性胺化合物虽然工艺和技术比较成熟，但其反应操作复杂，反应条件苛刻，产物收率和产物对映过量体ee值不高，而且容易造成环境的严重污染。相比较于化学合成方法，生物合成方法的显著优点在于它的理论产率可以达到100％，而且反应条件温和，成本较低，对环境污染小，可以制得大量的光学纯度较高的手性胺类化合物。随着重组dna技术和基因合成等新兴技术的不断发展，一些用于生物催化的酶能够迅速的被识别和生产，并且可以得到更加稳定和有效的生物催化剂，正因这些先进技术的发展，为利用生物催化剂工业化合成手性胺类化合物的研究开辟了新的角度。特别是重组dna技术促进了生物催化工艺学的发展。目前，利用酶催化不对称合成手性胺类化合物主要应用的是氨基脱氢酶和ω-转氨酶。ω-转氨酶不仅可应用于对外消旋体的拆分，还可以催化前体酮底物不对称合成手性胺类化合物，产物的光学纯度较高，制备手性胺类化合物范围较广，因此更具有应用价值。现在已经在多个种属的野生菌中发现了ω-转氨酶，其中包括弧菌(vibriofluvialis)、节杆菌(arthrobactersp.)、色杆菌(chromobacteriumviolaceum)等。koszeiewski等在利用ata-117转化4-苯基-2-丁酮合成r-4-苯基丁-2-胺的过程中，综合运用有机溶剂dmso萃取和调整ph的方法使反应物的转化率达到92％，ee值高达99％。yun等利用能共同表达产生ω-转氨酶和乙酰乳酸合酶的基因重组菌escherichiacoli，以整细胞的形式催化苯乙酮不对称合成苯乙胺，通过在反应体系中加入乳酸脱氢酶，除去丙酮酸的方法改变反应的热力学平衡，同时又降低了产物抑制。在转氨酶和乳酸脱氢酶的共同作用下，4-苯基-2-丁酮转化成-4-苯基-2-丁胺，转化率达到99％，ee值大于99％。草铵膦是一种高效、广谱、低毒的非选择性除草剂，是目前转基因抗性作物理想的除草剂，应用前景非常广阔。草铵膦有d、l两种对映异构体，但只有l-构型具有植物毒性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性小，对环境的破坏力小。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以l-构型的光学纯异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于提高原子经济性、降低成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。目前报道的l-草铵膦的方法主要有化学合成法，包括消旋草铵膦的拆分、手性原料法、手性辅基法和不对称催化法，但存在d-草铵膦不易消旋再利用、合成步骤冗长，反应需要超低温，产物ee值较低，收率低，且手性拆分试剂价格昂贵等问题。相比之下，生物合成法具有立体选择性严格、反应条件温和及产物易分离纯化的优点，因此探索生物法生产l-草铵膦的可行性具有十分重要的产业价值和显著的社会效益。natchevivana以l-3氨基-2环戊酰胺为原料，利用michaelis-becker反应，制备了l-3-乙酰氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺。l-3-乙酰氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺在酸催化水解脱去乙酸的过程发生消旋化，产物为消旋草铵膦。经磷酸二酯ι、酰化酶ι和谷氨酰胺酶3个酶分步作用后，可得到l-草铵膦(totalsynthesisandenzyme-substrateinteractionofd-,dl-,andl-phosphinotricine,‘bialaphos’(sf-1293)anditscyclicanalogues[j].journalofthechemicalsociety,perkintransactions1,1989(1):125-131.)，产率可达到75.7％。该方法需要3个酶的协同作用，工艺路线较长，而且必须从手性原料出发，增加了实验成本，难以工业化。美国专利us6686182报道了脱乙酰基酶的筛选、纯化过程。在37℃，ph8.0条件下，脱乙酰基酶催化48h，当底物浓度小于100mmol/l，可获得ee值为100％的草铵膦，随着底物浓度增大，ee值降低。将脱乙酰基酶固定化后应用于塔式反应器，采用流加底物的方法反应10h，底物浓度累计达500mmol/l，l-草铵膦的转化率为83％。美国专利us5618728报道了利用酰胺酶制备l-草铵膦的方法。他们利用从土壤中筛选到的enterobacteraerogenes9164l-酰胺酶水解酶水解(r,s)-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺制备得到l-草铵膦，同时释放nh3，合成的l-草铵膦的ee值能达到95.7％，酰胺酶拆分法的理论产率为50％，因此，未反应的d型底物必须回收。在诸多草铵膦的酶法合成路线中，酮酸中间体的酮羰基是潜手性官能团，能够通过酶法合成途径构建手性中心，酮酸路线也因原料价廉易得且可以避免使用剧毒氰化物，而成为适宜l-草铵膦工业化开发生产的路线。schulza等利用从e.colik-12中分离到的转氨酶，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰胺)-丁酸为底物，l-谷氨酸作为氨基供氢体，利用转氨作用生产l-草铵膦(stereospecificproductionoftheherbicidephosphinothricin(glufosinate)bytransamination:isolationandcharacterizationofaphosphinothricin-specifictransaminasefromescherichiacoli[j].appliedandenvironmentalmicrobiology,1990,56(1):1-6.)，产物最高浓度可达76.1g/l。转氨酶经固定化后安装至生物反应器，反应器的最高产物生成速率为50g/(l.h)，草铵膦ee值超过99.9％。中国专利cn105603015报道了利用来源于枯草芽孢杆菌168(bacillussubtis168)的转氨酶，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰胺)-丁酸为底物，当底物浓度为100mm时，l-丙氨酸作为氨基供氢体，利用转氨作用生产l-草铵膦，转化率可达100％。该反应原料易得，成本低廉，以水相作为反应体系，绿色环保。但氨基供体用量较多，需优化其用量，这样更为经济。中国专利cn201710178759.2报道了在转氨反应中引入乙烯合成酶，构建了转氨酶、乙烯合成酶两酶级联反应，目前底物浓度100mm时，转化率可高达92.9％。由于转氨体系中引入乙烯合成酶，使得副产物酮(α-酮戊二酸)转化成乙烯和二氧化碳，移除副产物使得反应向正反应方向进行。该工艺简化了后续精制工艺，提高了总收率，但同时也引入了精氨酸和辅酶，使得体系更为复杂，不利于工业化放大。虽然转氨酶在制备l-草铵膦中具有重要的应用价值，但是转氨酶酶基因的稀少大大限制了其在手性胺制备中的应用。因此，开发研究新型的转氨酶具有重要的理论研究意义和应用价值。提高l-草铵膦的收率和降低成本进而将转氨酶法合成l-草铵膦工业化生产是我们的最终目标。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种转氨酶、突变体、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及在合成手性胺l-草铵膦中的应用。针对已报道的不对称合成l-草铵膦的立体选择性不高、催化剂价格高、溶剂难以回收等问题，本发明提供了一种催化活性高和立体选择性强的转氨酶用于催化合成l-草铵膦。本发明采用的技术方案是：第一方面，本发明提供一种来源于荧光假单胞杆菌(pseudomonasfluorescenscctccno:m2012539)的转氨酶，所述转氨酶的氨基酸序列为seqidno:2所示。任何对seqidno:2所示氨基酸序列中氨基酸进行插入、缺失或替换的处理获得的多肽片段或其突变体，只要其与seqidno:2所示氨基酸序列具有95％以上同源性，均属于本发明的保护范围。本发明所述转氨酶编码基因的核苷酸序列为seqidno：1所示，所述转氨酶基因由如下方法得到：利用pcr技术，在引物1(5’-atgtctaaaaacgaatctctgctgcagc-3’)、引物2(5’-ttaagccagttcgtcgaagcattc-3’)的作用下以来源于假单胞杆菌zjb09-108菌株中的总基因组dna为模板克隆转氨酶基因序列，命名为ata3，核苷酸序列为seqidno：1所示。将该片段连接到pgem-t载体上，获得克隆载体pgem-t-ata3，将载体转化大肠杆菌获得含载体pgem-t-ata3的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长1275bp的开放阅读框。本发明表达引物3(5’-ccgcatatgtctaaaaacgaatctc-3’)和引物4(5’-ttgctcgagttaagccagttcgtcg-3’)，酶切位点分别为ndeⅰ和xhoⅰ(下划线)，以克隆载体pgem-t-ata3为模板，通过pcr扩增得到了用于表达的转氨酶基因。任何对seqidno:1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、插入或缺失处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。本发明涉及含所述转氨酶基因的重组载体及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌，具体为：将转氨酶基因同表达载体pet28a连接，构建了含有转氨酶基因的异源表达重组质粒pet28a-ata3。将表达重组质粒pet28a-ata3转化至大肠杆菌e.colibl21(de3)中，获得含有重组质粒pet28a-ata3的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28a-ata3。本发明还涉及转氨酶基因在制备重组转氨酶中的应用，具体为：构建含有所述转氨酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌(优选大肠杆菌e.colibl21(de3))中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组转氨酶的菌体细胞，破碎后获得的转氨酶粗酶液进行纯化，获得转氨酶纯酶。本发明还涉及所述转氨酶在催化2-羰基-4-(甲基羟基膦酰胺)-丁酸(ppo)不对称合成l-草铵膦中的应用，具体所述应用为：以含转氨酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以ppo为底物，以磷酸吡哆醛(plp)为辅酶，加入氨基供体，于ph值为6～9(优选8.0)的缓冲液中构成转化体系，在30～50℃、600rpm条件下反应(优选35℃、600r/min下反应24h)，反应完全，将反应液分离纯化，获得l-草铵膦；所述氨基供体为l-谷氨酸、l-天冬氨酸或l-丙氨酸中的一种或两种任意比例的混合，优选l-丙氨酸；所述转化体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为20～100g/l(优选50g/l)，所述底物的初始浓度为10～100mm(优选20mm)，所述辅酶的用量为0.1～2mm(优选1mm)，所述氨基供体用量为10～80mm(优选20mml-丙氨酸)。进一步，本发明所述含转氨酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体按如下方法制备：将含有转氨酶基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基，37℃、200rpm下培养9h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基中，于37℃、150rpm下培养至菌体od600达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mm的iptg，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。第二方面，本发明还提供一种转氨酶突变体，所述突变体是将seqidno：2所示氨基酸第62位的异亮氨酸取代为缬氨酸、第74位的丝氨酸取代为苏氨酸、第93位的甲硫氨酸取代为异亮氨酸、第167位的酪氨酸取代为苯丙氨酸、第220位的丙氨酸取代为脯氨酸、第282位的精氨酸取代为赖氨酸、第353位的丙氨酸取代为丝氨酸、第355的异亮氨酸取代为缬氨酸。本发明所述转氨酶突变体编码基因的核苷酸序列为seqidno：3所示。本发明还提供一种所述转氨酶突变体在催化ppo合成l-草铵膦中的应用，所述的应用以含转氨酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以ppo为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，加入氨基供体，于ph值为6～9的缓冲液(优选硼砂-硼酸缓冲体系或氢氧化钠-l-丙氨酸缓冲体系，ph8～9)中构成转化体系，在30～50℃、600rpm条件下反应(优选35℃、600r/min下反应24h)，反应完全，将反应液分离纯化，获得l-草铵膦；所述氨基供体为l-谷氨酸、l-天冬氨酸或l-丙氨酸中的一种或两种任意比例的混合；所述转化体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为20～100g/l(优选20～60g/l，更优选50g/l)，所述底物的初始浓度为10～500mmol/l(优选20～100mmol/l，更优选20mmol/l)，所述辅酶的用量为0.02～25mmol/l(优选0.2～2mmol/l，更优选1mmol/l)，所述氨基供体用量为10～1750mmol/l(优选70～350mmol/l，更优选80mmol/ll-丙氨酸)。本发明所述含转氨酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体按如下方法制备：将含有转氨酶突变体基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基，37℃、200rpm下培养9h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基中，于37℃、150rpm下培养至菌体od600达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mm的iptg，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种来源于假单胞杆菌的转氨酶基因、转氨酶突变体基因，分别将转氨酶基因与表达载体连接构建得到含该基因的表达重组质粒pet28a-ata3和pet28a-ata3-mut1，再转化至大肠杆菌e.colibl21(de3)中，获得重组大肠杆菌，可以利用重组大肠杆菌作为生物催化剂进行生物催化反应，为l-草铵膦的生物催化合成提供了可供选择的新酶源。本重组转氨酶作为生物催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸为底物制备l-草铵膦，产物ee>99.9％，100mm底物反应24h时，转化率最大为56.31％。本重组转氨酶突变体1作为生物催化剂，以4-(甲基羟基磷酰基)-2-羰基-丁酸为底物制备l-草铵膦，产物ee>99.9％，100mm底物反应4h，底物转化率为95.42％；500mm底物反应24h，底物转化率为79.71％；相比于原始酶，转化率提高了1.7倍以上。(四)附图说明图1为克隆载体pgem-t-ata3物理图谱；图2为pet28a-ata3重组质粒物理图谱；图3为转氨酶基因pcr扩增低熔点琼脂糖凝胶(argrose)电泳图；其中，泳道1为dl2000dnamarker；泳道2为转氨酶ata3的基因片段。图4为转氨酶纯化后的sds-page图：泳道1为蛋白质分子量marker，泳道2为纯化后的转氨酶。图5为l-草铵膦合成方程式。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：转氨酶基因ata3的扩增假单胞杆菌(pseudomonasfluorescenszjb09-108)是从土壤中分离得到的，保存在中国典型培养物保藏中心(保藏编号cctccno:m2012539，已在专利申请中公开，申请号cn201210593105.3，公开(公告)号cn103131649a)。根据genbank收录的来自假单胞杆菌(wp_076423369.1)的转氨酶基因测序信息为依据，用核酸快速提取仪提取假单胞杆菌cctccno:m2012539的总基因组dna，以该基因组dna为模板，在引物1(5’-atgtctaaaaacgaatctctgctgcagc-3’)、引物2(5’-ttaagccagttcgtcgaagcattc-3’)的作用下进行pcr扩增。pcr反应体系(总体积50μl)：10×pfudnapolymerasebuffer5μl，10mmdntpmixture(datp、dctp、dgtp和dttp各2.5mm)1μl，浓度均为50μm的克隆引物1、引物2各1μl，基因组dna1μl，pfudnapolymerase1μl，无核酸水40μl。采用biorad的pcr仪，pcr反应条件：预变性95℃5min，95℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。pcr反应液用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，利用taqdna聚合酶向片段5’端引入碱基a。在t4dna连接酶作用下将该片段同pmd18-t载体进行连接，得到克隆重组质粒pmd18-t-ata3见图1。将该重组质粒转化至大肠杆菌jm109中，利用篮白斑筛选系统进行筛选，随机挑取白色克隆测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为1275bp(ata3基因，其核苷酸序列如seqidno：1所示，编码蛋白的氨基酸序列为seqidno：2所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框。实施例2：重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28b-ata3的构建根据实施例1ata3基因序列设计引物3(5’-ccgcatatgtctaaaaacgaatctc-3’)、引物4(5’-ttgctcgagttaagccagttcgtcg-3’)，并分别在引物3和引物4中引入了ndei和xhoi限制性酶切位点(下划线标记)。在引物3和引物4的引发下，利用高保真pfudna聚合酶进行扩增，以重组质粒pmd18-t-ata3为模板(实施例1中获得)，获ata3基因序列，测序后利用ndei和xhoi限制性内切酶(takara)对扩增片段进行处理，并利用t4dna连接酶(takara)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pet28b(invitrogen)进行连接，构建表达载体pet28b-ata3(图2)。将构建的表达载体pet28b-ata3转化至大肠杆菌bl21(de3)(invitrogen)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒pet28b-ata3的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28b-ata3。实施例3：转氨酶(ata3)的诱导表达将实施例2获得的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pet28b-ata3接种至含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体od600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mm的iptg，25℃下诱导培养18h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，即获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌e.colibl21/pet28b-ata3湿菌体。该菌体可直接作为生物催化剂。实施例4：转氨酶(ata3)全细胞催化ppo制备l-草铵膦转化体系1：10mlph为8.0的tris-hcl缓冲体系中，加入e.colibl21/pet28b-ata3湿菌体50g/l，20mmppo，1mmplp，氨基供体：l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-天冬氨酸(20mm)，在35℃、600rpm条件下反应24h，产物ee>99.9％，底物转化率如表1所示。表1不同氨基供体对转化率的影响氨基供体转化率％l-天冬氨酸与l-谷氨酸51.54l-天冬氨酸58.00l-谷氨酸54.00l-丙氨酸84.00转化体系2：10mlph为6.0的缓冲体系中，加入e.colibl21/pet28b-ata3湿菌体20g/l，20mmppo，0.02mmplp，氨基供体：l-丙氨酸10mm，在30℃、600rpm条件下反应24h，产物ee>99.9％，底物转化率为45％。转化体系3：10mlph为8.0的tris-hcl缓冲体系中，加入e.colibl21/pet28b-ata3湿菌体20g/l，20mmppo，1mmplp，氨基供体：l-谷氨酸80mm，在35℃、600rpm条件下反应24h，产物ee>99.9％，底物转化率为79％。转化体系4：10mlph为8.0的tris-hcl缓冲体系中，加入e.colibl21/pet28b-ata3湿菌体30g/l，50mmppo，1mmplp，氨基供体：l-丙氨酸70mm，在35℃、600rpm条件下反应24h，产物ee>99.9％，底物转化率为74％。转化体系5：10mlph为9.0的tris-hcl缓冲体系中，加入e.colibl21/pet28b-ata3湿菌体40g/l，60mmppo，1mmplp，氨基供体：l-丙氨酸40mm，在35℃、600rpm条件下反应24h，产物ee>99.9％，底物转化率为63.2％。转化体系6：10mlph为9.0的tris-hcl缓冲体系中，加入e.colibl21/pet28b-ata3湿菌体60g/l，100mmppo，2mmplp，氨基供体：l-丙氨酸40mm，在50℃、600rpm条件下反应24h，产物ee>99.9％，底物转化率为52％。实施例5：ata3基因突变文库的建立以实施例2中构建质粒pet28b-ata3为模板，进行易错pcr。在引物1(5’-atgtctaaaaacgaatctc-3’)、引物2(5’-ttaagccagttcgtcgaag-3’)的作用下进行易错pcr。pcr反应体系(总体积50μl)：10×pfudnapolymerasebuffer5μl，10mmdntpmixture(datp、dctp、dgtp和dttp各2.5mm)1μl，浓度均为50μm的克隆引物1、引物2各0.5μm，质粒模板0.8ng/μl，taqdnapolymerase2.5u，mncl20.2mm，去离子水补足50μl。采用biorad的pcr仪，pcr反应条件：预变性95℃5min，95℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。纯化易错pcr产物后，以该产物作为引物、实施例2中构建质粒pet28b-ata3为模板进行大引物pcr，获得大引物pcr产物(即突变体文库1)。pcr体系：大引物10ng/μl，质粒模板1ng/μl，pfudnapolymerase2.5u。pcr反应条件：去a尾72℃5min，预变性96℃2min，96℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸4min，共25个循环，最后72℃延伸10min。实施例6：基因突变文库筛选获得突变体ata3-mut1将实施例5突变体文库1转入大肠杆菌e.colibl21(de3)的感受态细胞中，转化条件42℃，热击90秒，在含有50μg/ml卡那霉素的lb抗性平板上挑取单克隆8017个，分别接种于含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中进行诱导表达，诱导条件如实施例3，获得8017个含有突变体基因的重组大肠杆菌湿菌体，即突变体湿菌体。得到含有突变蛋白的大肠杆菌后，对0.36g草胺磷前体酮ppo进行生物转化，催化体系(10ml)终浓度组成及催化条件如下：突变体e.colibl21(de3)/pet28b-ata3湿菌体0.075g，tris-hcl缓冲液(ph8.0)，磷酸吡哆醛0.2mm，l-丙氨酸70mm，20mm2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间24h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以含空载体的大肠杆菌bl21/pet28b湿菌体代替上述突变体湿菌体作为阴性对照。反应结束后，取样进行hplc检测(50:50乙腈：水，10mm乙酸铵，0.8ml/min流速，268nm检测波长)，从8017个突变蛋白中，有6198个突变蛋白的活力低于原始蛋白，1778个突变蛋白的活力与原始蛋白相当，仅41个突变蛋白的活力显著高于原始蛋白(增加20％)，其中底物的转化率最高的一个突变体pet28b-ata3-mut1，转化率为96％，ee>99％。突变体pet28b-ata3-mut1的核苷酸序列与氨基酸序列如序列表中的seqidno:3和seqidno:4所示。突变体1是将seqidno：2所示氨基酸第62位的异亮氨酸取代为缬氨酸、第74位的丝氨酸取代为苏氨酸、第93位的甲硫氨酸取代为异亮氨酸、第167位的酪氨酸取代为苯丙氨酸、第220位的丙氨酸取代为脯氨酸、第282位的精氨酸取代为赖氨酸、第353位的丙氨酸取代为丝氨酸、第355的异亮氨酸取代为缬氨酸。实施例7：转氨酶突变体ata3-mut1在转氨过程中的条件优化以实施例6方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌bl21/pet28b-ata3-mut1湿菌体(简称ata3-mut1湿菌体)作为生物催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸为底物。(1)氨基供体的选择分别以l-天冬氨酸与l-谷氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-丙氨酸为氨基供体构成转化体系100ml：配ph8.0tris-hcl缓冲液90ml，加入20mmppo，24mml-天冬氨酸，4mml-谷氨酸，加1mmplp，ata3-mut1湿菌体量为50g/l，用tris-hcl缓冲液定容至100ml。在35℃、600rpm下反应24h，分别取样，用超纯水稀释10倍，采用实施例6方法进行hplc检测底物转化率。同样条件下，将氨基供体分别换成24mml-天冬氨酸、80mml-谷氨酸、70mml-丙氨酸，结果见表2所示，l-丙氨酸作为氨基供体为最优选择。表2不同氨基供体对转化率的影响氨基供体转化率％l-天冬氨酸与l-谷氨酸63.48l-天冬氨酸28.16l-谷氨酸87.34l-丙氨酸87.21(2)缓冲体系的选择分别以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、tris-hcl缓冲液、氨水、硼砂-硼酸缓冲液、氢氧化钠作为缓冲体系。转化体系1(10ml)：20mmppo，70mml-丙氨酸，1mmplp，湿菌体量50g/l，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲体系(ph6.0-8.0)，35℃、600rpm反应4h，转化率结果见表3所示。表3磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲体系不同ph对转化率的影响转化体系2(10ml)：20mmppo，70mml-丙氨酸，1mmplp，湿菌体量50g/l，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系(ph6.0-8.0)，35℃、600rpm反应4h，转化率结果见表4所示。表4磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系不同ph对转化率的影响转化体系3(10ml)：20mmppo，70mml-丙氨酸，1mmplp，湿菌体量50g/l，tris-hcl缓冲体系(ph7.0-9.0)，35℃、600rpm反应4h，转化率结果见表5所示。表5tris-hcl缓冲体系不同ph对转化率的影响转化体系4(10ml)：20mmppo，70mml-丙氨酸，1mmplp，湿菌体量50g/l，氨水缓冲体系(ph7.0-9.0)，35℃、600rpm反应4h，转化率结果见表6所示。表6氨水缓冲体系不同ph对转化率的影响转化体系5(10ml)：20mmppo，70mml-丙氨酸，1mmplp，湿菌体量50g/l，硼砂-硼酸缓冲体系(ph7.5-9.0)，35℃、600rpm反应4h，转化率结果见表7所示。表7硼砂-硼酸缓冲体系不同ph对转化率的影响转化体系6(10ml)：20mmppo，70mml-丙氨酸，1mmlplp，湿菌体量50g/l，氢氧化钠-l-丙氨酸缓冲体系(ph7.0-10.0)，35℃、600rpm反应4h，转化率结果见表8所示。表8氢氧化钠-l-丙氨酸缓冲体系不同ph对转化率的影响(3)温度优化转化体系(10ml)：20mmppo，70mml-丙氨酸，1mmplp，湿菌体量50g/l，硼砂-硼酸缓冲体系，ph8.5，分别在不同的温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、600rpm下反应4h，转化率结果见表9所示。表9不同温度对转化率的影响(4)菌体量优化转化体系(10ml)：20mmppo，70mml-丙氨酸，1mmplp，硼砂-硼酸缓冲体系，ph8.5，分别添加不同的湿菌体量10g/l，20g/l，30g/l，40g/l，50g/l，60g/l，在40℃、600rpm下反应4h，转化率结果见表10所示。表10不同菌体量对转化率的影响实施例7：辅酶plp用量的优化转化体系(10ml)：20mmppo，70mml-丙氨酸，湿菌体量20g/l，氢氧化钠-l-丙氨酸缓冲体系，ph8.5，分别添加不同plp量(0.02mm-2mm)，在40℃、600rpm下反应4h，转化率结果见表11所示。表11辅酶plp不同用量对转化率的影响实施例8：氨基供体-l丙氨酸用量的优化转化体系(10ml)：20mmppo，加入1mmplp，氢氧化钠-l-丙氨酸缓冲体系，ph8.5，l-丙氨酸浓度梯度(10～80mm)，湿菌体量为20g/l，在35℃、600rpm下反应4h，转化率结果如表12所示。表12不同l-丙氨酸用量对转化率的影响实施例9：转氨酶ata3-mut1合成l-草铵膦反应进程转化体系(10ml)：20mmppo，70mml-丙氨酸，加入1mmplp，氢氧化钠-l-丙氨酸缓冲体系，ph8.5，湿菌体量为20g/l，在35℃、600rpm下反应不同时间(1～26h)，定时取样分析，转化率结果如表13所示。表13不同反应时间对转化率的影响实施例10：反应体系(10ml)：氢氧化钠-l-丙氨酸缓冲体系，ph8.5，100mmppo，350mml-丙氨酸，加入5mmplp，ata3-mut1湿菌体量为20g/l，35℃、600rpm下反应24h，转化率为88.62％。实施例11：反应体系(10ml)：氢氧化钠-l-丙氨酸缓冲体系，ph8.5，200mmppo，700mml-丙氨酸，10mmplp，ata3-mut1湿菌体量为40g/l，35℃、600rpm下反应24h，转化率为74.9％。实施例12：反应体系(10ml)：氢氧化钠-l-丙氨酸缓冲体系，ph8.5，300mmppo，1050mml-丙氨酸，15mmplp，ata3-mut1湿菌体量为60g/l，35℃、600rpm下反应24h，转化率为85.04％。实施例13：反应体系(10ml)：氢氧化钠-l-丙氨酸缓冲体系，ph8.5，400mmppo，1400mml-丙氨酸，20mmplp，ata3-mut1湿菌体量为80g/l，35℃、600rpm下反应24h，转化率为80.05％。实施例14：反应体系(10ml)：氢氧化钠-l-丙氨酸缓冲体系，ph8.5，500mmppo，1750mml-丙氨酸，25mmplp，ata3-mut1湿菌体量为100g/l，35℃、600rpm下反应24h，转化率为79.71％。由以上实验结果可知，本发明得到的含有转氨酶基因的重组大肠杆菌具有较强的转氨能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化或者转化反应，可以利用2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸为底物，进行生物转化反应制备高光学纯的农药——l-草铵膦。序列表<110>浙江工业大学<120>一种转氨酶、突变体及其生产l-草铵膦的应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1275<212>dna<213>荧光假单胞杆菌(pseudomonasfluorescens)<400>1atgtctaaaaacgaatctctgctgcagcgtcgtcaggctgctgttgctcgtggtgtttct60cagatccacccgatcgttgctgaacgtgctgaaaacgctaccgtttgggacgttgacggt120cgtgaatacatcgacttcgctggtggtatcgctgttctgaacaccggtcacctgcacccg180aaaattatcgctgctgttcaggaacagctgaccaaactgagccacacctgcttccaggtt240ctggcttacgaaccgtacatcgctctgtgcgaagaaatggctaaacgtgttccgggtgac300ttcgctaaaaaaaccctgctggttacctctggttctgaagctgttgaaaacgctgttaaa360atcgctcgtgctgctaccggtcgtgctggtgttatcgctttcaccggtgcttaccacggt420cgtaccatgatgaccctgtctctgaccggtaaagttgttccgtactctgctggtatgggt480ctgatgccgggtggtgtttaccgtgctctggctccgtgcccgctgcacggtatctctgaa540gacgaatctatcgcttctatcgaacgtatcttcaaaaacgacgctcagccgcaggacatc600gctgctatcatcatcgaaccggttcagggtgaaggtggtttctacgttaactctaaagcg660ttcatgcagcgtctgcgtgctctgtgcgaccagcacggtatcctgctgatcgctgacgaa720gttcagaccggtgctggtcgtaccggtaccttcttcgctaccgaacagctgggtatcgtt780ccggacctgaccaccttcgctaaatctgttggtggtggtttcccgatctctggtgtttgc840ggtagagctgaaatcatggactctatcgctccgggtggtctgggtggtacctacgctggt900tctccgatcgcttgcgctgctgctctggctgttatgaaagttttcgacgaagaaaaactg960ctggaacgttctcaggctgttggtgaaaaactgaaagctggtctgaacgctatcgctgct1020aaacacaaagttatcggtgacgttcgtggtctgggtgctatgattgctatcgaactgttc1080gaaggtggtgaccacaacaaaccggctgctgaactggttggtaaaatcgttgctcgtgct1140cgtgaaaaaggtctgatcctgctgtcttgcggtacctactacaacgttatccgtttcctg1200atgccggttaccatcccggacgctcagctggaaaaaggtatcgctatcgttgctgaatgc1260ttcgacgaactggct1275<210>2<211>425<212>prt<213>荧光假单胞杆菌(pseudomonasfluorescens)<400>2metserlysasngluserleuleuglnargargglnalaalavalala151015argglyvalserglnilehisproilevalalagluargalagluasn202530alathrvaltrpaspvalaspglyargglutyrileaspphealagly354045glyilealavalleuasnthrglyhisleuhisprolysileileala505560alavalglngluglnleuthrlysleuserhisthrcyspheglnval65707580leualatyrgluprotyrilealaleucysgluglumetalalysarg859095valproglyaspphealalyslysthrleuleuvalthrserglyser100105110glualavalgluasnalavallysilealaargalaalathrglyarg115120125alaglyvalilealaphethrglyalatyrhisglyargthrmetmet130135140thrleuserleuthrglylysvalvalprotyrseralaglymetgly145150155160leumetproglyglyvaltyrargalaleualaprocysproleuhis165170175glyilesergluaspgluserilealaserilegluargilephelys180185190asnaspalaglnproglnaspilealaalaileileilegluproval195200205glnglygluglyglyphetyrvalasnserlysalaphemetglnarg210215220leuargalaleucysaspglnhisglyileleuleuilealaaspglu225230235240valglnthrglyalaglyargthrglythrphephealathrglugln245250255leuglyilevalproaspleuthrthrphealalysservalglygly260265270glypheproileserglyvalcysglyargalagluilemetaspser275280285ilealaproglyglyleuglyglythrtyralaglyserproileala290295300cysalaalaalaleualavalmetlysvalpheaspgluglulysleu305310315320leugluargserglnalavalglyglulysleulysalaglyleuasn325330335alailealaalalyshislysvalileglyaspvalargglyleugly340345350alametilealailegluleuphegluglyglyasphisasnlyspro355360365alaalagluleuvalglylysilevalalaargalaargglulysgly370375380leuileleuleusercysglythrtyrtyrasnvalileargpheleu385390395400metprovalthrileproaspalaglnleuglulysglyilealaile405410415valalaglucyspheaspgluleuala420425<210>3<211>1275<212>dna<213>荧光假单胞杆菌(pseudomonasfluorescens)<400>3atgtctaaaaacgaatctctgctgcagcgtcgtcaggctgctgttgctcgtggtgtttct60cagatccacccgatcgttgctgaacgtgctgaaaacgctaccgtttgggacgttgacggt120cgtgaatacatcgacttcgctggtggtatcgctgttctgaacaccggtcacctgcacccg180aaagttatcgctgctgttcaggaacagctgaccaaactgacccacacctgcttccaggtt240ctggcttacgaaccgtacatcgctctgtgcgaagaaatcgctaaacgtgttccgggtgac300ttcgctaaaaaaaccctgctggttacctctggttctgaagctgttgaaaacgctgttaaa360atcgctcgtgctgctaccggtcgtgctggtgttatcgctttcaccggtgcttaccacggt420cgtaccatgatgaccctgtctctgaccggtaaagttgttccgtactctgctggtatgggt480ctgatgccgggtggtgttttccgtgctctggctccgtgcccgctgcacggtatctctgaa540gacgaatctatcgcttctatcgaacgtatcttcaaaaacgacgctcagccgcaggacatc600gctgctatcatcatcgaaccggttcagggtgaaggtggtttctacgttaactctaaaccg660ttcatgcagcgtctgcgtgctctgtgcgaccagcacggtatcctgctgatcgctgacgaa720gttcagaccggtgctggtcgtaccggtaccttcttcgctaccgaacagctgggtatcgtt780ccggacctgaccaccttcgctaaatctgttggtggtggtttcccgatctctggtgtttgc840ggtaaagctgaaatcatggactctatcgctccgggtggtctgggtggtacctacgctggt900tctccgatcgcttgcgctgctgctctggctgttatgaaagttttcgacgaagaaaaactg960ctggaacgttctcaggctgttggtgaaaaactgaaagctggtctgaacgctatcgctgct1020aaacacaaagttatcggtgacgttcgtggtctgggttctatggttgctatcgaactgttc1080gaaggtggtgaccacaacaaaccggctgctgaactggttggtaaaatcgttgctcgtgct1140cgtgaaaaaggtctgatcctgctgtcttgcggtacctactacaacgttatccgtttcctg1200atgccggttaccatcccggacgctcagctggaaaaaggtatcgctatcgttgctgaatgc1260ttcgacgaactggct1275<210>4<211>425<212>prt<213>荧光假单胞杆菌(pseudomonasfluorescens)<400>4metserlysasngluserleuleuglnargargglnalaalavalala151015argglyvalserglnilehisproilevalalagluargalagluasn202530alathrvaltrpaspvalaspglyargglutyrileaspphealagly354045glyilealavalleuasnthrglyhisleuhisprolysvalileala505560alavalglngluglnleuthrlysleuthrhisthrcyspheglnval65707580leualatyrgluprotyrilealaleucysglugluilealalysarg859095valproglyaspphealalyslysthrleuleuvalthrserglyser100105110glualavalgluasnalavallysilealaargalaalathrglyarg115120125alaglyvalilealaphethrglyalatyrhisglyargthrmetmet130135140thrleuserleuthrglylysvalvalprotyrseralaglymetgly145150155160leumetproglyglyvalpheargalaleualaprocysproleuhis165170175glyilesergluaspgluserilealaserilegluargilephelys180185190asnaspalaglnproglnaspilealaalaileileilegluproval195200205glnglygluglyglyphetyrvalasnserlysprophemetglnarg210215220leuargalaleucysaspglnhisglyileleuleuilealaaspglu225230235240valglnthrglyalaglyargthrglythrphephealathrglugln245250255leuglyilevalproaspleuthrthrphealalysservalglygly260265270glypheproileserglyvalcysglylysalagluilemetaspser275280285ilealaproglyglyleuglyglythrtyralaglyserproileala290295300cysalaalaalaleualavalmetlysvalpheaspgluglulysleu305310315320leugluargserglnalavalglyglulysleulysalaglyleuasn325330335alailealaalalyshislysvalileglyaspvalargglyleugly340345350sermetvalalailegluleuphegluglyglyasphisasnlyspro355360365alaalagluleuvalglylysilevalalaargalaargglulysgly370375380leuileleuleusercysglythrtyrtyrasnvalileargpheleu385390395400metprovalthrileproaspalaglnleuglulysglyilealaile405410415valalaglucyspheaspgluleuala420425当前第1页12