本发明涉及7-羟基-3-乙酰香豆素类化合物作为汞离子荧光探针的制备方法，所述探针能够对汞离子高选择性灵敏识别，或者其可测定样品中汞离子的浓度。
背景技术：
汞是一种具有严重生理毒性的金属元素,由于其具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性,使其成为目前最引人关注的环境污染物之一。环境中的无机汞离子可在一定条件下由生物体转化为剧毒的甲基汞。无机汞主要影响肾脏,而甲基汞进入人体后主要侵害神经系统,尤其是中枢神经系统。两者均可通过食物链在生物组织里高度富集,从而对人和自然界造成巨大的危害。汞中毒会对整个社会产生极其恶劣的影响,现在汞被优先列在全球环境监控系统清单上,因此,对汞离子的选择性识别,尤其是汞离子的原位、实时、在线监测对于医学、生物学和环境科学都具有重要意义。
鉴于此，发展能够有效检测特别是能够在生理水平条件下检测汞离子的分析方法是极其重要和有意义的。现如今已报导的检测汞离子的分析方法包括原子吸收-发射光谱法、高效液相色谱法、电感耦合等离子体质谱、核磁共振、比色法(如传统的双硫腙法)、电化学方法(如阳极溶出伏安法、氧化还原电位法等)，在这些众多的检测方法中比色荧光探针由于其特有的优点而成为研究人员关注的焦点。然而，目前报道的比色和荧光探针仍存在一些问题，包括选择性不够好、响应速度不够快、合成复杂。由于生命体内的其他离子如碳酸氢根离子，硫酸根离子，溴离子，氯离子，硝酸根离子，亚硝酸根离子和磷酸根离子等其他金属离子，它会对汞离子的检测构成潜在干扰，因此，发展能够高灵敏性检测生命体内汞离子的分析方法是必要的。总之，发展快速，高选择性、高灵敏度、合成简单的汞离子比色荧光双通道探针是本领域技术人员急需解决的。
技术实现要素：
本领域急需一种制备简单的高灵敏度高选择性的汞离子荧光探针，从而能够有效检测汞离子。为此，本发明合成了一类新颖的检测汞离子的双光子荧光探针，其合成简单、选择性好、灵敏度高。具体而言，本发明提供了一种汞离子荧光探针，其为7-羟基-3-乙酰香豆素类化合物，其结构如下：
优选的，本发明的荧光探针是：
本发明还提供了汞离子荧光探针的制备方法，其是通过将对应于本发明的探针的相应的试7-羟基-3-乙酰香豆素类化合物与硫代氯甲酸苯酯在二氯甲烷溶液中dipea催化条件下常温搅拌4小时而合成制得。
本发明还提供了用于检测样本中汞离子浓度的检测制剂或试剂盒，其包含本发明的探针。优选地，本发明的检测制剂或试剂盒还包含产品的使用说明书。还优选地，本发明的试剂盒还包含用于测定样本中的汞离子浓度的缓冲剂。
本发明还提供了检测样本中汞离子浓度的方法，其包括将本发明的探针与待测样本接触的步骤。
本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本中汞离子浓度的制剂中的用途。
本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本(例如水样样本)中汞离子浓度的试剂盒中的用途。
本发明的汞离子荧光探针可与汞离子进行作用，产生荧光光谱和紫外吸收光谱的变化，从而实现对汞离子的定量检测。
具体而言，本发明的汞离子荧光探针分别与钾离子、钠离子、钙离子、镁离子、锌离子、铝离子、镍离子、铅离子、镉离子、铜离子、氟离子、氯离子、溴离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子和亚硝酸根离子等进行作用均不能导致荧光光谱和紫外吸收光谱的明显改变，从而实现对汞离子的选择性识别，进而可任选地用于排除这些离子以及生命体内其他离子的存在对汞离子的定量测定的干扰。
可选择地，本发明的汞离子荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。
进一步的，本发明的汞离子荧光探针是灵敏度极高的双光子荧光探针，且合成简单，有利于商业化的推广应用。
附图说明
图1a是不同浓度hg2+(0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，1，1.5，2μm)对探针(5μm)荧光光谱的影响；图1b是不同浓度hg2+(0-2μm)对探针(5μm)荧光强度和浓度之间的线性关系图。
图2a是汞离子(5μm)和其它不同离子分析物(25μm)分别对探针(5μm)的荧光光谱的影响。图2b是其它不同离子分析物(25μm)分别对汞离子(5μm)和探针(5μm)在455nm波长处的荧光强度的影响。1.汞离子、2.钾离子、3.钠离子、4.钙离子、5.镁离子、6.锌离子、7.铝离子、8.镍离子、9.铅离子、10.镉离子、11.铜离子、12.氟离子、13.氯离子、14.溴离子、15.碳酸根离子、16.硫酸根离子、17.硝酸根离子、18.亚硝酸根离子
图3是hg2+(5μm)对探针(5μm)的紫外光谱的影响。
具体实施方式：
本发明提供了上述高选择性汞离子荧光探针的合成路线、方法及其光谱性能。
本发明的汞离子荧光探针是一类7-羟基-3-乙酰香豆素类化合物，其具有以下结构通式
上式中：r1，r2，r3和r4为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；r1，r2，r3和r4可以相同或不同。
该类汞离子荧光荧光探针的合成路线和方法如下：
具体地，本发明的比色荧光探针可以通过如下方法制备，将一定摩尔比(例1:1.5-1:3)的7-羟基-3-乙酰香豆素与硫代氯甲酸苯酯溶于二氯甲烷中，二者的摩尔比为(1:2)然后常温搅拌一段时间(例如4h)，然后利用旋蒸仪进行旋蒸，旋干后加入少量二氯甲烷将其溶解，过柱后得到产物，如果要得到较纯的产品，可以将其用二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v,1:10)进行重结晶得到纯品。
因此，本发明还提供了硫代氯甲酸苯酯在制备用于检测汞离子的荧光探针中的用途。
本发明还提供了7-羟基-3-乙酰香豆素在制备用于检测汞离子的荧光探针中的用途。
本发明的高选择性高灵敏识别汞离子比色荧光探针的显著特征是能够快速高选择性灵敏识别汞离子以及在其他离子的存在下能够准确对汞离子进行定量分析。
下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。
实施例1
(方案1)将300mg(1.47mmol)7-羟基-3-乙酰香豆素溶于15ml二氯甲烷中，再加入508mg(3mmol)硫代氯甲酸苯酯常温搅拌4h，然后利用旋蒸仪进行旋蒸过柱，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以将其过柱然后在二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v,1:10)中进行重结晶得到纯品。得到白色纯净产品210mg，产率为42％。
(方案2)将300mg(1.47mmol)7-羟基-3-乙酰香豆素溶于15ml二氯甲烷中，再加入381mg(2.21mmol)硫代氯甲酸苯酯常温搅拌4h，然后利用旋蒸仪进行旋蒸，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以将其过柱然后在二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v,1:10)中进行重结晶得到纯品。得到白色纯净产品184mg，产率为37％。
(方案3)将300mg(1.47mmol)7-羟基-3-乙酰香豆素溶于15ml二氯甲烷中，再加入635mg(3.68mmol)硫代氯甲酸苯酯常温搅拌4h，然后利用旋蒸仪进行旋蒸，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以将其过柱然后在二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v,1:10)中进行重结晶得到纯品。得到白色纯净产品231mg，产率为46％。
(方案4)将300mg(1.47mmol)7-羟基-3-乙酰香豆素溶于20ml二氯甲烷中，再加入763mg(4.41mmol)硫代氯甲酸苯酯常温搅拌4h，然后利用旋蒸仪进行旋蒸，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以将其过柱然后在二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v,1:10)中进行重结晶得到纯品。得到白色纯净产品262mg，产率为52％。
(方案5)将300mg(1.47mmol)7-羟基-3-乙酰香豆素溶于15ml二氯甲烷中，再加入381mg(2.21mmol)硫代氯甲酸苯酯常温搅拌6h，然后利用旋蒸仪进行旋蒸，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以将其过柱然后在二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v,1:10)中进行重结晶得到纯品。得到白色纯净产品207mg，产率为41％。
1hnmr验证了产物结构的正确性。
实施例2
图1a是不同浓度hg2+(0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，1，1.5，2μm)对探针(5μm)荧光光谱的影响；图1b是不同浓度hg2+(0-2μm)对探针(5μm)荧光强度和浓度之间的线性关系图。
可以看到加入汞离子前后荧光变化非常明显。伴随着探针溶液中hg2+浓度的增加，荧光强度逐渐增强，且在(0-2μm)hg2+浓度范围内，hg2+的浓度与荧光强度成很好的线性关系。说明探针对汞离子有很好的响应，该探针能实现对汞离子的灵敏识别。我国饮用水标准中汞离子的标准限值为0.001mg/l因此,本发明的探针能较精确地确定待测样本中汞离子的含量。
实施例3
图2a是汞离子(5μm)和其它不同离子分析物(25μm)分别对探针(5μm)的荧光光谱的影响。图2b是其它不同离子分析物(25μm)分别对汞离子(5μm)和探针(5μm)在455nm波长处的荧光强度的影响。
分析物包括：1.汞离子、2.钾离子、3.钠离子、4.钙离子、5.镁离子、6.锌离子、7.铝离子、8.镍离子、9.铅离子、10.镉离子、11.铜离子、12.氟离子、13.氯离子、14.溴离子、15.碳酸根离子、16.硫酸根离子、17.硝酸根离子、18.亚硝酸根离子，除汞离子浓度为5μm外，其它分析离子浓度均为25μm。所有测试条件是在纯水中完成，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱都是在25℃下分析物加入60分钟后测得的。具体地，移取50μl的1mm探针储备液放进10ml比色管中，然后加入5ml纯水和0.5ml的ph7.4的hepes缓冲溶液,用纯水定容至10ml，再移取不同体积上述10mm分析物储备液加入比色管内，摇匀，60min后测定。结果如图2所示。
从图2a可以看出，生物体内存在的其它常见离子不会对探针有明显的响应；从图2b可以看出，生物体内存在的其它常见离子不会明显干扰探针对汞离子的荧光强度，因此探针具有良好的选择性。
实施例4
图3是hg2+(5μm)对探针(5μm)的紫外光谱的影响。具体的，移取50μl的1mm探针储备液放进10ml比色管中，加入缓冲后定溶至10ml，然后等量一分为二，移取到两个比色管内，其中一个加入5μm的汞离子，响应60min后分别测定两者的吸收光谱。
可以看出加入汞离子后在415nm处出现明显的吸收峰，这说明该探针有作为比色探针来实现对汞离子的定量分析的潜力。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。