本发明属于基因工程技术领域，涉及一种黏多糖贮积症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，尤其涉及一种应用改良后的慢病毒载体优化表达mpsii基因用于制备治疗戈谢病的药物。
背景技术
黏多糖贮积症ii型也称汉特(hunter)综合征，最早由hunter(1917)描述。mekusick(1965)将其分类为黏多糖贮积症ⅱ型，属于伴性隐性遗传，由于艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduornate-2-sulphatesulphatase,ids)基因突变所致。患病者均为男性，病人的母亲是携带者但不发病。此型又可分为两个亚型：mpsⅱ-a为重型，智力不全较重，多在15岁前死亡；mpsⅱ-b为轻型，智力正常，寿命较长，可存活到40岁以上。
由于病人体内缺乏艾杜糖-2-硫酸酯酶，而使酸性黏多糖降解发生障碍，该酶基因定位在xq27.3～q28，由于酶的缺乏使过多的黏多糖沉积于组织细胞内，并随尿排出。随着组织细胞内黏多糖沉积的增多，导致功能障碍。呼吸有鼾音，常伴有慢性呼吸道感染。肺动脉高压和冠状动脉梗死也很多见。常有心脏扩大并伴有收缩期和舒张期杂音。重型者智力不全较明显。
初生时多正常，约从2岁开始即出现发育落后、骨骼及面容呈轻度胡勒综合征，但较轻，发生较晚，进展也较慢。可有关节强直、爪状手、短小，但无脊柱后弯。第2和5指骨中节短小，掌骨近端不变尖。桡骨、尺骨远端关节面可相对倾斜而成角，腕关节间隙轻度狭窄。成人常有继发性骨关节改变。皮肤呈皱褶性或结节性增厚，尤以上肢及胸部明显，有时可呈对称性分布，并有多毛。可因视网膜变性而失明。常有进行性耳聋。肝脾肿大，伴有慢性腹泻。尿中出现过多的硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素。
诊断依据尿中排出硫酸皮肤素与硫酸类肝素之比为1:1。成纤维细胞培养，35s粘多糖积蓄，加入纯化的hunter综合征因子可得到纠正，此可间接证明为艾杜糖-2-硫酸酯酶活性缺乏。如能直接测血清和细胞内酶活性则可确诊。
黏多糖贮积症是单基因突变造成的艾杜糖-2-硫酸酯酶活性丧失的疾病，因此基因治疗方法理论上可以实现对该病的彻底治疗。脑内注射intraventricularinjection将药物直接注入脑室内。实验时将微量药物注射管人侧脑室。该方法操作简便，费用较低，可用于观察不同药物注人脑室后各种生理指标和变化。
目前国内外应用病毒载体进行基因传递的基因治疗方法虽然有许多，但是不同病毒载体，甚至相同载体的不同制备方法引起的基因传递效率差异明显，而基因传递效率将直接影响疾病的治疗效果。现在大多应用基因治疗对遗传病进行治疗的方法均存在效率过低以及仅针对血液干细胞进行修饰，使得疾病治疗的临床效果始终达不到预期，因此急需能够最大程度上提高病毒基因传递效率的方法来提高遗传疾病的疗效。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种黏多糖贮积症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述黏多糖贮积症慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体为在ptyf慢病毒载体的5’端的剪接供体位点进行改造，具体改造方式如下：
(a)其5’端的剪接供体位点被删除或改造，改造后的慢病毒载体剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点；
(b)其仍具有病毒包装信号功能；
其中，所述慢病毒载体还包括mpsii基因。
本发明中，通过将5’端的剪接供体位点进行删除或改造从而使得慢病毒载体ptyf剪接供体位点不是所述包装载体和所述参照慢病毒之间的同源重组的潜在位点’，即其不再有致病性，使得hiv病毒丧失了自我复制的功能，因此大大提高了整个基因治疗使用的慢病毒载体自身的安全性能，这是其他所有慢病毒载体所不具备的一种安全机能改良，转染效率更高，稳定性更强，安全性更好，能够更高效的完成基因治疗过程中正常基因的传递，将改造后的慢病毒载体特异性地装载mpsii基因，转导细胞后能够成功实现神经元细胞内mpsii基因的稳定表达，使得慢病毒载体能够实现对黏多糖贮积症基因的治疗。
根据本发明，所述慢病毒载体的5’端的剪接供体位点被删除或改造的核苷酸序列举例如下：
在具体实施例中，野生型5’剪接供体位点gt突变为ca，具体序列如下：野生型(seqidno.3)：ggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggcta；
突变型(seqidno.4)：ggcaagaggcgaggggcggcgactgcagagtacgccaaaaattttgactagcggaggcta.
在具体的实施例中，野生型5’剪接供体位点gt突变为gg，具体序列如下：野生型(seqidno.5)：ggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggcta；
突变型(seqidno.6)：ggcaagaggcgaggggcggcgactggggagtacgccaaaaattttgactagcggaggcta.
根据本发明，所述mpsii基因的核苷酸序列如seqidno.1所示或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述mpsii基因的核苷酸序列与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述mpsii基因的核苷酸序列与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少82％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述mpsii基因的核苷酸序列与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少85％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述mpsii基因的核苷酸序列与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少88％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述mpsii基因的核苷酸序列与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述mpsii基因的核苷酸序列与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少92％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述mpsii基因的核苷酸序列与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
本发明中，发明人发现与seqidno.1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列，是改造后的mpsii基因其仍然具有mpsii基因的功能，可能是对艾杜糖-2-硫酸酯酶长度的缩短或是只采用艾杜糖-2-硫酸酯酶中的功能域部分序列，将这些改造后的核苷酸序列装载到所述慢病毒载体中都可以实现mpsii基因的功能，从而对mpsii基因进行修复，所述seqidno.1所示的核苷酸序列(ids)如下：
atgccgccaccccggaccggccgaggccttctctggctgggtctggttctgagctccgtctgcgtcgccctcggatccgaaacgcaggccaactcgaccacagatgctctgaacgttcttctcatcatcgtggatgacctgcgcccctccctgggctgttatggggataagctggtgaggtccccaaatattgaccaactggcatcccacagcctcctcttccagaatgcctttgcgcagcaagcagtgtgcgccccgagccgcgtttctttcctcactggcaggagacctgacaccacccgcctgtacgacttcaactcctactggagggtgcacgctggaaacttctccaccatcccccagtacttcaaggagaatggctatgtgaccatgtcggtgggaaaagtctttcaccctgggatatcttctaaccataccgatgattctccgtatagctggtcttttccaccttatcatccttcctctgagaagtatgaaaacactaagacatgtcgagggccagatggagaactccatgccaacctgctttgccctgtggatgtgctggatgttcccgagggcaccttgcctgacaaacagagcactgagcaagccatacagttgttggaaaagatgaaaacgtcagccagtcctttcttcctggccgttgggtatcataagccacacatccccttcagataccccaaggaatttcagaagttgtatcccttggagaacatcaccctggcccccgatcccgaggtccctgatggcctaccccctgtggcctacaacccctggatggacatcaggcaacgggaagacgtccaagccttaaacatcagtgtgccgtatggtccaattcctgtggactttcaggaggaccaaagttccacaggtttcagactgaagacttcatctaccagaaagtataagtag.
根据本发明，所述mpsii基因之前还包括启动子序列，所述启动子序列为ef1α和/或cmv，优选为ef1α。
本发明中，只要能够启动mpsii基因表达的启动子都是可行的，发明人发现采用ef1α全长启动子，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递。
根据本发明，所述ef1α的核苷酸序列如seqidno.2所示或与其具有至少90％同源性，优选至少95％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述ef1α的核苷酸序列与seqidno.2所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述ef1α的核苷酸序列与seqidno.2所示的核苷酸序列具有至少92％同源性的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述ef1α的核苷酸序列与seqidno.2所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
本发明中，发明人发现与seqidno.2所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的序列，是改造后的ef1α其仍然具有启动子的功能，可能是对ef1α长度的缩短，将这些改造后的核苷酸序列装载到所述慢病毒载体中都可以实现启动子的功能，从而启动arsa基因的表达，所述seqidno.2所示的核苷酸序列如下：
gcggccgctagcatgcctaggtcgaccaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaagtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaaaactctagagcggccgcggaggccgaattccgtcga.
第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的慢病毒载体ptyf与包装辅助质粒pnhp和phef-vsv-g共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。
优选地，所述哺乳细胞为hek293t细胞和/或te671细胞。
第三方面，本发明提供一种制备如第二方面所述慢病毒的方法，包括如下步骤：
(1)将慢病毒载体ptyf进行改造；
(2)全基因合成启动子及mpsii基因序列并插入步骤(1)点突变的慢病毒载体中；
(3)将构建的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到重组慢病毒。
根据本发明，步骤(2)所述插入的位点可以是任何基因工程可合成的酶切位点，本发明优选采用bamhi和spei酶切位点之间。
根据本发明，步骤(3)所述的包装辅助质粒为pnhp和phef-vsv-g。
根据本发明，所述哺乳细胞为hek293t细胞和/或te671细胞。
根据本发明，所述共转染哺乳细胞后的培养时间为24-72h，例如可以是24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h、35h、36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、50h、52h、55h、58h、60h、62h、65h、68h、70h或72h。
第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞包括如第一方面所述的慢病毒载体和/或如第二方面所述的重组慢病毒。
根据本发明，所述重组细胞为重组干细胞，优选为外周血干细胞和/或间充质干细胞。
本发明中，所述经慢病毒转染后的干细胞能够稳定大量表达mpsii基因，通过将重组慢病毒导入外周血干细胞和间充质干细胞，形成双重干细胞系，可以进一步提高mpsii基因在脑部的传递效率与表达量活，能够实现更快的黏多糖贮积症症状缓解以及更全面持久的基因治疗。
第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的慢病毒载体、如第二方面所述的重组慢病毒或如第四方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供如第一方面所述的慢病毒载体、如第二方面所述的重组慢病毒、如第四方面所述的重组细胞或如第五方面所述的药物组合物在制备黏多糖贮积症治疗的药物和/或试剂中的用途。
在一个具体的实施例中，所述干细胞为通过收集患者外周血后分离其中干细胞，再将慢病毒载体转染干细胞后，以静脉注射的方式回输入患者体内进行黏多糖贮积症疾病的治疗。
在一个具体的实施例中，可以通过将慢病毒载体直接注射至病变细胞部位进行黏多糖贮积症疾病的治疗。
在一个具体的实施例中，可以通过将慢病毒载体转染血液进行黏多糖贮积症疾病的治疗。
根据本发明，所述组合物还包括药学上接受的辅料，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本申请慢病毒载体进行了特异改造，使得hiv病毒丧失了自我复制的功能，大大提高了整个基因治疗使用的慢病毒载体自身的安全性能，改造后的慢病毒载体转染效率更高，稳定性更强，安全性更好，能够更高效的完成基因治疗过程中正常基因的传递；
(2)本申请改造后的慢病毒载体的基础上特异地连入mpsii基因，在ef1α启动子的启动下，能够在保障安全性的同时实现更高效的基因传递，使得mpsii基因在转基因的大脑相关细胞中的表达量明显增加，能够更高效的完成黏多糖贮积症基因治疗过程中正常基因的传递；
(3)本申请慢病毒载体可以直接修复细胞中受损的mpsii基因，可以有效的提高mpsii基因在脑部的传递效率与表达量活，这对保障基因治疗的有效性具有重要的意义，为实现更快的黏多糖贮积症症状缓解以及更全面持久的基因治疗奠定了基础。
附图说明
图1为慢病毒载体ptyf的改造示意图；
图2为慢病毒载体的结构示意图；
图3为慢病毒载体的纯化流程示意图；
图4为慢病毒载体携带正常mpsii基因直接注射入脑治疗黏多糖贮积症疾病的治疗流程示意图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1慢病毒载体的构建
本实施例提供一种慢病毒载体的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)慢病毒载体ptyf的改造示意图如图1所示，具体的突变为将野生型5’剪接供体位点gt突变为ca，将u3中的增强子删除，具体的改造方法可以参见“contributionsofviralsplicesitesandcis-regulatoryelementstolentivirusvectorfunction,yancui,journalofvirology,july1999,p.6171–6176”，具体如下：
5’剪接供体位点的改造：
野生型(seqidno.3)：ggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggcta；
突变型(seqidno.4)：ggcaagaggcgaggggcggcgactgcagagtacgccaaaaattttgactagcggaggcta；
(2)启动子以及mpsii基因的插入：
通过全基因合成正常mpsii基因序列(如seqidno.1所示)以及人类ef1α启动子(如seqidno.2所示)序列，将其经限制性酶切位点连接入慢病毒载体tyf中，通过测序及双酶切(最佳反应条件参照neb原厂建议)，5’用bamhi克隆位点(ggatccacc)–aug；3’用spei克隆位点(actagt)，对所获产物进行鉴定以获得正确连接的hef1α启动下携带正常mpsii基因插入慢病毒载体，具体的连接位置以及慢病毒载体构成如图2所示。
具体的seqidno.1所示的核苷酸序列如下：
atgccgccaccccggaccggccgaggccttctctggctgggtctggttctgagctccgtctgcgtcgccctcggatccgaaacgcaggccaactcgaccacagatgctctgaacgttcttctcatcatcgtggatgacctgcgcccctccctgggctgttatggggataagctggtgaggtccccaaatattgaccaactggcatcccacagcctcctcttccagaatgcctttgcgcagcaagcagtgtgcgccccgagccgcgtttctttcctcactggcaggagacctgacaccacccgcctgtacgacttcaactcctactggagggtgcacgctggaaacttctccaccatcccccagtacttcaaggagaatggctatgtgaccatgtcggtgggaaaagtctttcaccctgggatatcttctaaccataccgatgattctccgtatagctggtcttttccaccttatcatccttcctctgagaagtatgaaaacactaagacatgtcgagggccagatggagaactccatgccaacctgctttgccctgtggatgtgctggatgttcccgagggcaccttgcctgacaaacagagcactgagcaagccatacagttgttggaaaagatgaaaacgtcagccagtcctttcttcctggccgttgggtatcataagccacacatccccttcagataccccaaggaatttcagaagttgtatcccttggagaacatcaccctggcccccgatcccgaggtccctgatggcctaccccctgtggcctacaacccctggatggacatcaggcaacgggaagacgtccaagccttaaacatcagtgtgccgtatggtccaattcctgtggactttcaggaggaccaaagttccacaggtttcagactgaagacttcatctaccagaaagtataagtag；
具体的seqidno.2所示的核苷酸序列如下：
gcggccgctagcatgcctaggtcgaccaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaagtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaaaactctagagcggccgcggaggccgaattccgtcga.
实施例2慢病毒的制备和鉴定
1)慢病毒的制备
将实施例1制备得到的慢病毒载体进一步包装、纯化和浓缩，得到所述慢病毒，具体过程如图3所示，具体步骤如下：
(1)将实施例1中构建的慢病毒载体与包装辅助质粒pnhp和phef-vsv-g共转染哺乳细胞hek293t中培养24-72h；
(2)将培养得到的慢病毒进行纯化和浓缩，得到所述慢病毒。
2)慢病毒的鉴定
将收集的携带正常mpsii基因慢病毒转染后神经元细胞和胶质细胞进行蛋白质表达量鉴定，以明确mpsii基因在神经元细胞中的表达情况。
从结果看来，未经慢病毒转染的神经元细胞阴性对照细胞中不存在艾杜糖-2-硫酸酯酶蛋白的表达，而经携带正常mpsii基因慢病毒转染后神经元细胞中可见明显较大量的艾杜糖-2-硫酸酯酶蛋白表达。
说明本发明能够成功通过慢病毒使神经元细胞大量表达艾杜糖-2-硫酸酯酶蛋白，具有较好的疾病治疗潜能。
实施例3慢病毒的治疗效果
将实施例2制备得到的携带正常mpsii基因的慢病毒对大脑进行直接注射治疗黏多糖贮积症疾病，治疗流程示意图如图4所示，通过脑部的mri或ct确定注射慢病毒载体的位点和脑部具体坐标，以携带正常mpsii基因的慢病毒载体在颅内进行直接注射的方式，输入到患者脑部进行疾病治疗。
从结果可以看出，直接注射慢病毒后，有效的提高mpsii基因在脑部的传递效率与表达量活。
综上所述，本申请慢病毒载体可以直接修复细胞中受损的mpsii基因，可以有效的提高mpsii基因在脑部的传递效率与表达量活，这对保障基因治疗的有效性具有重要的意义，为实现更快的黏多糖贮积症症状缓解以及更全面持久的基因治疗奠定了基础。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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<110>深圳市免疫基因治疗研究院
<120>一种黏多糖贮积症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
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