本发明涉及一种分离提取ε-聚赖氨酸的方法，属于提取分离技术领域。
背景技术：
ε-聚赖氨酸(ε-pl)是由链霉菌、丝状真菌或芽孢杆菌等微生物胞外分泌产生的一种同型氨基酸聚合物，它一般由25-35个l-赖氨酸单体通过α-cooh和ε-nh2脱水缩合而成，分子量通常为2500-4500da。
由于具有水溶性好、热稳定性强、抑菌谱广等优点，ε-pl目前主要作为生物食品防腐剂广泛应用于日本、韩国、欧美等国家和地区的食品工业。2014年，我国也正式批准ε-pl及其盐酸盐在果蔬、米面制品、肉制品、调味品、饮料和焙烤等食品领域中的应用。
事实上，ε-pl与其他生物食品防腐剂，如乳酸链球菌素和纳他霉素，在抑菌谱即使用范围上存在显著互补性。ε-pl能显著抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，乳酸链球菌素只对革兰氏阳性细菌和芽孢有显著抑制作用，而纳他霉素只对霉菌和酵母菌有良好抑制效果，若将它们联合应用于食品工业中，即能最大程度的保证抑菌的效果。
因此，开发和推广ε-pl及其盐在食品工业中的应用，对于解决当前化学食品防腐剂引发的食品安全问题具有重要意义。
然而，ε-pl生产偏高却成为限制其在食品工业中广泛应用的主要因素。
ε-pl的制备主要包括两部分：微生物发酵、提取与精制。在微生物发酵方面，国内学者已经将5l规模ε-pl的发酵水平从10g/l左右提高到30g/l以上(zl201410156360.0)，最高突破到50g/l以上(zl201510021744.6，zl20091003033.0)。实际上，ε-pl发酵单位已经达到大多数工业化发酵产品的发酵水平，表明ε-pl发酵成本接近大规模工业化生产可接受程度。
在提取与精制方面，自zl200910152931.2公开以来，离子交换技术一直是ε-pl提取的核心方法，受到众多研究者的关注。基于该核心操作单元，ε-pl提取工艺也得到了改进，如，cn107164417a将离子交换树脂的离子类型由氢型改变成铵型，省去了后续的脱盐操作，简化了操作流程；cn106380592a建立了两步离子交换方法，用于从高ε-pl浓度和高杂质环境的发酵液中分离提取ε-pl；zl201110053004.2利用离子交换树脂从发酵液中提取ε-pl的同时，还将副产物γ-聚二氨基丁酸进行了分离。
然而，相比较在发酵水平方面上取得的进步，ε-pl后提取技术并未发生实质性进展，主要在于并未革除离子交换工艺。
众所周知，离子交换技术虽然具有产物回收率高、除杂能力强和操作成熟等优点，但其在活化和再生环节中酸碱消耗量大、废水量多的缺陷却始终无法避免。
因此，在环保要求越来越高的背景下，建立无离子交换的ε-pl提取工艺，对于绿色ε-pl产业的建立和未来发展具有重要意义。
技术实现要素：
为克服传统离子交换技术的不足，本发明运用有机溶剂/无机盐双水相体系，提供了一种既能够减少废水产生、简化操作步骤、降低提取成本，又具有提取回收率高、提取成品纯度高等优势的ε-聚赖氨酸(ε-pl)提取方法。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种分离提取ε-聚赖氨酸的方法，所述方法为处理ε-聚赖氨酸发酵液，去除ε-聚赖氨酸发酵液中的菌体，获得发酵液清液；处理发酵液清液，使得其ph值为4.0～11.0，获得ε-聚赖氨酸料液；在ε-聚赖氨酸料液中先加入无机盐，使得无机盐的质量比终浓度为10-30％，然后再加入有机溶剂，使得有机溶剂的质量比终浓度为10-30％，得到双水相体系；将得到的双水相体系静置分相后进行上下相分离，得到上相和下相；将得到的上相进行处理，回收有机溶剂并提取ε-聚赖氨酸；
所述ε-聚赖氨酸发酵液是利用产ε-聚赖氨酸菌进行发酵得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为通过离心或过滤处理ε-聚赖氨酸发酵液，去除ε-聚赖氨酸发酵液中的菌体，获得发酵液清液；用硫酸、盐酸或阳离子树脂处理发酵液清液，使得其ph值为4.0～11.0，获得ε-聚赖氨酸料液；在ε-聚赖氨酸料液中先加入无机盐，使得无机盐的质量比终浓度为10-30％，并充分混合和溶解，然后再加入有机溶剂，使得有机溶剂的质量比终浓度为10-30％，充分震荡或者搅拌后，得到双水相体系；将得到的双水相体系静置分相后进行上下相分离，得到上相和下相；将得到的上相进行处理，回收有机溶剂并提取ε-聚赖氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为通过离心或过滤处理ε-聚赖氨酸发酵液，去除ε-聚赖氨酸发酵液中的菌体，获得发酵液清液；用硫酸、盐酸或阳离子树脂处理发酵液清液，使得其ph值为9.0，获得ε-聚赖氨酸料液；在ε-聚赖氨酸料液中先加入无机盐，使得无机盐的质量比终浓度为20％，并充分混合和溶解，然后再加入有机溶剂，使得有机溶剂的质量比终浓度为20％，充分震荡或者搅拌后，得到双水相体系；将得到的双水相体系静置分相后进行上下相分离，得到上相和下相；将得到的上相进行处理，回收有机溶剂并提取ε-聚赖氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述无机盐为nacl、na2co3、cacl2、(nh4)2so4、kh2po4或k2hpo4中一种或几种。
在本发明的一种实施方式中，所述无机盐为(nh4)2so4。
在本发明的一种实施方式中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或丙酮中一种或几种。
在本发明的一种实施方式中，所述有机溶剂为乙醇。
在本发明的一种实施方式中，所述静置分相的时间为1-3h。
在本发明的一种实施方式中，所述静置分相的时间为2.0h。
在本发明的一种实施方式中，所述上下相分离为将上下相进行自然分离或离心分离。
在本发明的一种实施方式中，所述将上相进行处理为将得到的上相进行蒸馏，回收有机溶剂并收集ε-聚赖氨酸浓缩液进行后续精制处理，得到ε-聚赖氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述将上相进行蒸馏的温度为40-60℃。
在本发明的一种实施方式中，所述将上相进行蒸馏的温度为50℃。
在本发明的一种实施方式中，所述ε-聚赖氨酸浓缩液的后续精制处理包括脱色、脱盐和干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述将上相进行处理为在得到的上相中加入无机盐溶液，使得无机盐的质量比终浓度为20-30％，对ε-聚赖氨酸进行多次萃取后，再进行有机溶剂的回收以及ε-聚赖氨酸的提取。
在本发明的一种实施方式中，所述将上相进行处理为在得到的上相中加入无机盐溶液，使得无机盐的质量比终浓度为20％，对ε-聚赖氨酸进行3次萃取后，再进行有机溶剂的回收以及ε-聚赖氨酸的提取。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包含将得到的下相进行处理，回收有机溶剂以及无机盐。
在本发明的一种实施方式中，所述将下相进行处理为将下相进行蒸馏，回收有机溶剂并得到无机盐浓缩液，将得到的无机盐浓缩液进行浓缩、结晶回收无机盐；
或在下相中加入有机溶剂，过滤回收沉淀的无机盐并得到滤液，将得到的滤液进行蒸馏回收有机溶剂。
在本发明的一种实施方式中，所述将下相进行处理为将下相在40-60℃下进行蒸馏，回收有机溶剂并得到无机盐浓缩液，将得到的无机盐浓缩液在55-80℃下进行浓缩、4-10℃下进行结晶回收无机盐；
或在下相中加入体积为下相0.5-3倍的有机溶剂，过滤回收沉淀的无机盐并得到滤液，将得到的滤液于50-80℃进行蒸馏回收有机溶剂。
在本发明的一种实施方式中，所述将下相进行处理为将下相在50℃下进行蒸馏，回收有机溶剂并得到无机盐浓缩液，将得到的无机盐浓缩液在50℃下进行浓缩、10℃下进行结晶回收无机盐；
或在下相中加入体积为下相5倍的有机溶剂，过滤回收沉淀的无机盐并得到滤液，将得到的滤液于50℃进行蒸馏回收有机溶剂。
本发明提供了应用上述一种分离提取ε-聚赖氨酸的方法分离提取得到的ε-聚赖氨酸。
本发明提供了上述一种分离提取ε-聚赖氨酸的方法在生产ε-聚赖氨酸方面的应用。
本发明提供了上述一种分离提取ε-聚赖氨酸的方法或上述分离提取得到的ε-聚赖氨酸在食品领域的应用。
有益效果：
(1)本发明是通过在除菌后的料液中直接构建有机溶剂/无机盐双水相体系用于ε-pl的分离与提取，相较于传统离子交换提取方法，基本消除了废水产生和酸碱消耗；
(2)本发明使用的有机溶剂和无机盐均被重复利用，因此，本发明的实施将大幅度地降低ε-pl提取成本；
(3)本发明工艺流程简单、操作时间短、投资成本低、便于工业放大，具有很高的实际应用价值且优势明显；
(4)采用本发明的方法分离提取ε-聚赖氨酸，回收率可高达98％以上。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中的ε-pl发酵液由下述方法制备而得，具体操作步骤为：
将小白链霉菌cgmccno.10480的种子液，按照6％的接种量接种到装有发酵培养基的5l发酵罐中，利用氨水或naoh溶液将培养基ph值调节至7.5，开始发酵。在发酵过程中，温度控制在30℃左右，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量为0.5-2vvm，溶氧浓度控制在30％左右；当ph值自发下降为5.0时，自动流加氨水或naoh溶液将ph值控制在5.0左右，保持10h；随后将ph值下调至3.0左右，并维持24h左右，后将ph值上调到4.5左右并维持至发酵结束。当发酵液中残留的甘油或葡萄糖浓度下降为10g/l时，自动流加灭菌后的纯甘油或500g/l的葡萄糖溶液，使其在发酵液中的浓度控制在10g/l左右；当发酵液中nh4+-n浓度降到1g/l时，自动流加硫酸铵溶液，使其浓度维持在1g/l。
按照上述发酵控制方法，经过192h补料分批发酵，ε-pl产量可以达到50g/l。
上述小白链霉菌cgmccno.10480已于2016年6月15日在applbiochembiotechnol杂志的《genomeshufflingandgentamicin-resistancetoimproveε-poly-l-lysineproductivityofstreptomycesalbulusw-156》一文中公开。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
回收率、纯度检测方法参考文献：kaharp.,iwatat.,hirakij.,parke.y.,okabem.,enhancementofε-polylysineproductionbystreptomycesalbulusstrain410usingphcontrol,j.biosci.bioeng.91(2001)190–194.
实施例1
1)发酵液的菌体去除：发酵液经过稀释后，利用离心机对发酵稀释液进行离心处理，获得发酵清液；
2)ph值调节和无机盐溶液的配制：将10gnacl(10％)溶解于90mlε-pl发酵清液中，采用1.0m的naoh调节该混合溶液ph至4.0；
3)双水相体系的构建：向上述ph4.0、含有nacl的ε-pl发酵清液中加入10ml乙醇(10％)，充分振荡、混匀后，于室温静置1.0h，再利用分液漏斗移除下相，收集上相；
4)从上相中分离提取ε-pl：将上相在40℃下进行减压蒸馏和浓缩，回收乙醇，收集ε-pl浓缩液进行真空干燥，得到ε-pl样品。
本实施例从发酵清液中提取ε-pl的回收率为98.5％。
实施例2
1)发酵液的菌体去除：发酵液经过板框过滤后，获得发酵清液；
2)ph值调节和无机盐溶液的配制：将30gk2hpo4(30％)溶解于90mlε-pl发酵清液中，采用1.0m的naoh调节该混合溶液ph至11.0；
3)双水相体系的构建：向上述ph11.0、含有k2hpo4的ε-pl发酵清液中加入30ml丙酮(30％)，充分振荡、混匀后，于室温静置3.0h，再利用分液漏斗移除下相，收集上相；
4)从上相中分离提取ε-pl：将上相在60℃下进行减压蒸馏和浓缩，回收乙醇，收集ε-pl浓缩液进行真空干燥，得到ε-pl样品。
本实施例从发酵清液中提取ε-pl的回收率为94.6％。
实施例3
1)发酵液的菌体去除：发酵液经过稀释后，利用离心机对发酵稀释液进行离心处理，获得发酵清液；
2)ph值调节和无机盐溶液的配制：将200g(nh4)2so4(20％)溶解于900mlε-pl发酵清液中，采用1.0m的naoh调节混合溶液ph至9.0；
3)双水相体系的构建：向上述ph9.0、含有(nh4)2so4的ε-pl发酵清液中加入200ml乙醇(20％)，充分振荡、混匀后，于室温静置1.5h，再利用离心移除下相，收集上相；
4)上相中再分离提取ε-pl：向收集的上相中，加入900ml20％(nh4)2so4溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置1.0h，离心移除下相，收集上相；
5)从上相中分离提取ε-pl：将上相在50℃下进行减压蒸馏和浓缩，回收乙醇，收集ε-pl浓缩液；
6)ε-pl精制：将ε-pl浓缩液进行活性炭脱色后，过滤液利用纳滤膜脱盐浓缩后进行真空干燥，得到ε-pl样品。
本实施例从发酵清液中提取ε-pl的回收率为98.3％。
实施例4
1)发酵液的菌体去除：发酵液经过板框过滤后，获得发酵清液；
2)ph值调节和无机盐溶液的配制：将200g(nh4)2so4(20％)溶解于900mlε-pl发酵清液中，采用1.0m的naoh调节混合溶液ph至10.0；
3)双水相体系的构建：向上述ph10.0、含有(nh4)2so4的ε-pl发酵清液中加入200ml正丙醇(20％)，充分振荡、混匀后，于室温静置2.0h，利用分液漏斗移除下相，收集上相；
4)上相中再分离提取ε-pl：向第一次收集的上相中，加入900ml10％na2co3溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置2.0h，利用离心移除下相，收集上相；
5)上相中再分离提取ε-pl：向第二次收集的上相中，加入900ml25％kh2po4溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置1.5h，利用离心移除下相，收集上相；
6)从上相中分离提取ε-pl：将上相在60℃下进行减压蒸馏和浓缩，回收正丙醇，收集ε-pl浓缩液；
7)ε-pl精制：将ε-pl浓缩液进行活性炭脱色后，过滤液利用纳滤膜脱盐浓缩后进行真空干燥，得到ε-pl样品。
本实施例从发酵清液中提取ε-pl的回收率为99.1％。
实施例5
1)发酵液的菌体去除：发酵液经过板框过滤后，获得发酵清液；
2)ph值调节和无机盐溶液的配制：将200gna2co3(20％)溶解于900mlε-pl发酵清液中，采用1.0m的naoh调节混合溶液ph至10.0；
3)双水相体系的构建：向上述ph10.0、含有na2co3的ε-pl发酵清液中加入200ml正丙醇(20％)，充分振荡、混匀后，于室温静置2.0h，利用分液漏斗移除下相，收集上相；
4)上相中再分离提取ε-pl：向第一次收集的上相中，加入900ml10％na2co3溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置2.0h，利用离心移除下相，收集上相；
5)上相中再分离提取ε-pl：向第二次收集的上相中，加入900ml25％na2co3溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置1.5h，利用离心移除下相，收集上相；
6)从上相中分离提取ε-pl：将上相在60℃下进行减压蒸馏和浓缩，回收正丙醇，收集ε-pl浓缩液；
7)ε-pl精制：将ε-pl浓缩液进行活性炭脱色后，过滤液利用纳滤膜脱盐浓缩后进行真空干燥，得到ε-pl样品。
本实施例从发酵清液中提取ε-pl的回收率为98.1％。
实施例6
1)发酵液的菌体去除：发酵液经过板框过滤后，获得发酵清液；
2)ph值调节和无机盐溶液的配制：将200gcacl2(20％)溶解于900mlε-pl发酵清液中，采用1.0m的naoh调节混合溶液ph至10.0；
3)双水相体系的构建：向上述ph7.0、含有cacl2的ε-pl发酵清液中加入200ml正丙醇(20％)，充分振荡、混匀后，于室温静置2.0h，利用分液漏斗移除下相，收集上相；
4)上相中再分离提取ε-pl：向第一次收集的上相中，加入900ml10％cacl2溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置2.0h，利用离心移除下相，收集上相；
5)上相中再分离提取ε-pl：向第二次收集的上相中，加入900ml25％cacl2溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置1.5h，利用离心移除下相，收集上相；
6)从上相中分离提取ε-pl：将上相在60℃下进行减压蒸馏和浓缩，回收正丙醇，收集ε-pl浓缩液；
7)ε-pl精制：将ε-pl浓缩液进行活性炭脱色后，过滤液利用纳滤膜脱盐浓缩后进行真空干燥，得到ε-pl样品。
本实施例从发酵清液中提取ε-pl的回收率为97.1％。
实施例7
1)发酵液的菌体去除：发酵液经过板框过滤后，获得发酵清液；
2)ph值调节和无机盐溶液的配制：将200gkh2po4(20％)溶解于900mlε-pl发酵清液中，采用1.0m的naoh调节混合溶液ph至10.0；
3)双水相体系的构建：向上述ph9.0、含有kh2po4的ε-pl发酵清液中加入200ml正丙醇(20％)，充分振荡、混匀后，于室温静置2.0h，利用分液漏斗移除下相，收集上相；
4)上相中再分离提取ε-pl：向第一次收集的上相中，加入900ml10％k2hpo4溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置2.0h，利用离心移除下相，收集上相；
5)上相中再分离提取ε-pl：向第二次收集的上相中，加入900ml25％k2hpo4溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置1.5h，利用离心移除下相，收集上相；
6)从上相中分离提取ε-pl：将上相在60℃下进行减压蒸馏和浓缩，回收正丙醇，收集ε-pl浓缩液；
7)ε-pl精制：将ε-pl浓缩液进行活性炭脱色后，过滤液利用纳滤膜脱盐浓缩后进行真空干燥，得到ε-pl样品。
本实施例从发酵清液中提取ε-pl的回收率为98.7％。
对比例1
1)发酵液的菌体去除：发酵液经过稀释后，利用离心机对发酵稀释液进行离心处理，获得发酵清液；
2)ph值调节和无机盐溶液的配制：将10gnacl(10％)溶解于90mlε-pl发酵清液中，采用1.0m的naoh调节该混合溶液ph至5.0；
3)双水相体系的构建：向上述ph5.0、含有nacl的ε-pl发酵清液中加入10ml乙醇(10％)，充分振荡、混匀后，于室温静置1.0h，再利用分液漏斗移除下相，收集上相；
4)从上相中分离提取ε-pl：将上相在40℃下进行减压蒸馏和浓缩，回收乙醇，收集ε-pl浓缩液进行真空干燥，得到ε-pl样品。
本对比例从发酵清液中提取ε-pl的回收率为72.8％。
对比例2
1)发酵液的菌体去除：发酵液经过稀释后，利用离心机对发酵稀释液进行离心处理，获得发酵清液；
2)ph值调节和无机盐溶液的配制：将10gnacl(10％)溶解于90mlε-pl发酵清液中，采用1.0m的naoh调节该混合溶液ph至3.0；
3)双水相体系的构建：向上述ph3.0、含有nacl的ε-pl发酵清液中加入10ml乙醇(10％)，充分振荡、混匀后，于室温静置1.0h，再利用分液漏斗移除下相，收集上相；
4)从上相中分离提取ε-pl：将上相在40℃下进行减压蒸馏和浓缩，回收乙醇，收集ε-pl浓缩液进行真空干燥，得到ε-pl样品。
本对比例从发酵清液中提取ε-pl的回收率为81.5％。
对比例3
1)发酵液的菌体去除：发酵液经过板框过滤后，获得发酵清液；
2)ph值调节和无机盐溶液的配制：将200gcacl2(20％)溶解于900mlε-pl发酵清液中，采用1.0m的naoh调节混合溶液ph至9.0；
3)双水相体系的构建：向上述ph9.0、含有cacl2的ε-pl发酵清液中加入200ml正丙醇(20％)，充分振荡、混匀后，于室温静置2.0h，利用分液漏斗移除下相，收集上相；
4)上相中再分离提取ε-pl：向第一次收集的上相中，加入900ml10％cacl2溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置2.0h，利用离心移除下相，收集上相；
5)上相中再分离提取ε-pl：向第二次收集的上相中，加入900ml25％cacl2溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置1.5h，利用离心移除下相，收集上相；
6)从上相中分离提取ε-pl：将上相在60℃下进行减压蒸馏和浓缩，回收正丙醇，收集ε-pl浓缩液；
7)ε-pl精制：将ε-pl浓缩液进行活性炭脱色后，过滤液利用纳滤膜脱盐浓缩后进行真空干燥，得到ε-pl样品。
本对比例从发酵清液中提取ε-pl的回收率为87.4％。
对比例5
1)发酵液的菌体去除：发酵液经过板框过滤后，获得发酵清液；
2)ph值调节和无机盐溶液的配制：将200gna2co3(20％)溶解于900mlε-pl发酵清液中，采用1.0m的naoh调节混合溶液ph至7.0；
3)双水相体系的构建：向上述ph7.0、含有na2co3的ε-pl发酵清液中加入200ml正丙醇(20％)，充分振荡、混匀后，于室温静置2.0h，利用分液漏斗移除下相，收集上相；
4)上相中再分离提取ε-pl：向第一次收集的上相中，加入900ml10％na2co3溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置2.0h，利用离心移除下相，收集上相；
5)上相中再分离提取ε-pl：向第二次收集的上相中，加入900ml25％na2co3溶液，充分振荡、混匀后，于室温静置1.5h，利用离心移除下相，收集上相；
6)从上相中分离提取ε-pl：将上相在60℃下进行减压蒸馏和浓缩，回收正丙醇，收集ε-pl浓缩液；
7)ε-pl精制：将ε-pl浓缩液进行活性炭脱色后，过滤液利用纳滤膜脱盐浓缩后进行真空干燥，得到ε-pl样品。
本对比例从发酵清液中提取ε-pl的回收率为79.8％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。