本发明涉及一种与鸡致死相关的snp标记及其应用、检测引物、检测试剂盒，属于生物育种技术领域。
背景技术：
在畜禽的遗传育种中，应用分子标记的现代育种技术能够提高选种的准确性，快速提高和改善畜禽生产性能，是畜禽遗传育种的有效方法。应用分子标记育种首先是在dna水平上筛查与畜禽经济性状密切相关的遗传标记，其次是建立其基因多态性的快速检测方法，从而实现早期选择和遗传标记辅助选择。
鸡是一种重要的经济禽类，同时也是一种科研上的重要模式生物，繁殖性能是评价蛋鸡生产性能的主要指标。国内优质地方鸡普遍存在繁殖性能差(包括产蛋性能差、孵化率低等)的问题，从而影响了经济效益。繁殖性能是由多基因决定的复杂性状，受到遗传、环境以及二者互作的共同调控，对这类复杂性状形成机理的探讨和研究，一直是动物遗传育种领域关注的焦点。因此，开发与繁殖性能相关的分子标记，可实现繁殖性能的分子辅助选择，加速鸡繁殖性能的遗传进展，应用前景广阔。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种与鸡致死相关的snp标记，该标记的纯合突变会使鸡死亡。
本发明还提供了上述snp标记的应用。
本发明还提供了一种用于检测鸡致死基因型的检测引物及检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种与鸡致死相关的snp标记，其核苷酸序列如seqidno.1所示，5'端起第267位碱基发生t＞g突变。
本发明首次发现上述的snp位点，该分子标记位点对应于ncbi公布的鸡参考基因组gallus_gallus-5.0版本序列信息3号染色体正义链第100471368位脱氧核苷酸，该snp位点在之前没有被报道过，是一新发现的分子标记，该标记的纯合突变会使鸡死亡。因此，在鸡群体中该位点仅存在tt基因型或者tg基因型，gg纯合突变型会使鸡致死，故不存在这种基因型的个体。
可以通过pcr扩增该标记，然后用pvuii内切酶消化或测序的方法，判断待测样品的基因型。
上述的snp标记在鸡育种中的应用。具体的，在鸡繁殖性状选育种中的应用。更为具体的，在检测并淘汰携带有致死等位基因的杂合个体鸡中的应用。
在实际应用时，检测如seqidno.1所示序列5'端起第267位核苷酸的种类，选择该位点为tt纯合型的鸡个体，弃去该位点为tg基因型的鸡个体。
通过pcr扩增检测第267位核苷酸的种类，所述pcr扩增时使用的引物如下所示：
snp-f：5'-ccttatgggggagaggagaca-3'；
snp-r：5'-ctgcacatagcagaggggtt-3'。
在pcr扩增后，可以使用测序或酶切的方法检测所述pcr扩增的产物的snp位点基因型，进而确定所测样本snp位点的基因型。
优选的，通过pvuii内切酶消化所述pcr扩增产物的方法，来检测所述第267位核苷酸的种类。在pcr扩增后，可以通过pvuii内切酶消化所述pcr扩增的产物，然后将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，通过酶切片段的大小来检测所述第267位核苷酸的种类。如pvuii消化pcr产物后只有一个626bp的片段，则待测样本为tt基因型；如产生626bp，267bp和359bp的3个片段，则待测样本为tg基因型。因为当pcr产物中该位点碱基为g时，pvuii可以对其进行消化，消化后产生长度为626bp，267bp和359bp的3个片段，而当pcr产物中该位点为t碱基时，则pvuii不能对其消化，仍为原长626bp。
本发明新发现的snp标记可以应用于鸡非致死基因型的早期选择，辅助于鸡的育种，提高鸡繁殖性能，有助于节省生产成本并加快遗传选育进展，具有很大的经济应用价值和科研价值。
一种用于检测鸡致死基因型的检测引物，依据如seqidno.1所示的序列设计，所述检测引物的扩增片段包含该序列5'端起的第267位。该引物采用现有技术中常用的设计方法，也可以根据检测方法的不同进行设计。
具体的，所述引物序列如下所示：
snp-f：5'-ccttatgggggagaggagaca-3'；
snp-r：5'-ctgcacatagcagaggggtt-3'。
包含上述检测引物的检测试剂盒。具体的，还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶、pvuii内切酶中的一种或几种。优选的，包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶和pvuii内切酶。
上述的检测引物及检测试剂盒在鸡育种中的应用。具体的，在鸡繁殖性状选育种中的应用。更为具体的，在检测并淘汰携带有致死等位基因的杂合个体鸡中的应用。
本发明的检测引物及试剂盒，检测结果准确可靠，可操作性强，为本领域提供了一种能快速高效区别出携带有突变纯合致死等位基因的杂合个体种鸡的方法。本发明的关键技术在于发现了与鸡胚胎致死相关的突变snp位点，通过检测个体基因组上该位点的等位基因的基因型，即可判断该个体是否为携带有致死等位基因的杂合个体，进而淘汰该个体，利用该方法即可快速纯合非致死的等位基因。
附图说明
图1为n.267t>gsnp位点在不同品种鸡中的pcr产物pvuii酶切后条带图；
图2为不同基因型pcr产物的测序图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1
本实施例中与鸡致死相关的snp标记如seqidno.1所示，该序列5'端起267位为t或g，该snp位点对应于ncbi公布的鸡参考基因组gallusgallus-5.0版本序列信息3号染色体正义链第100471368位脱氧核苷酸。
实施例2
本实施例中用于检测鸡致死snp的检测引物，如下所示：
snp-f：5'-ccttatgggggagaggagaca-3'；
snp-r：5'-ctgcacatagcagaggggtt-3'。
实施例3
本实施例中用于检测鸡致死snp的试剂盒，包括如实施例2所示的引物，还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶和pvuii内切酶。
实施例4
本实施例中的待测鸡群体来自于河南农业大学鸡种质资源场，包括96只海兰褐鸡，60只罗曼鸡，188只卢氏绿壳蛋鸡，136只淅川乌骨鸡，180只固始鸡，144只丝毛乌骨鸡，60只安卡鸡和736只安卡鸡与固始鸡正反交产生的f2代个体。
本实施例中利用实施例1中的snp标记对于鸡进行育种。具体的，检测携带有致死等位基因的杂合个体鸡，然后淘汰掉该基因型的鸡，以提高鸡群的繁殖性能。
检测鸡致死基因型的方法，包括如下步骤：
1、基因组dna提取
对待测鸡进行翅静脉采血，用抗凝剂处理后经裂解、蛋白酶消化处理，然后采用酚仿法提取基因组，以灭菌双蒸水溶解后备用。
具体的，鸡翅静脉采血，acd抗凝剂(1.32％(m/v)柠檬酸钠、0.48％(m/v)柠檬酸、1.47％(m/v)葡萄糖)抗凝后经裂解，蛋白酶(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)消化处理，采用酚仿法提取dna，灭菌双蒸水溶解。
2、snp位点的pcr扩增
用pcr引物对鸡的基因组dna进行pcr扩增，pcr反应体系均为10μl，其中包括2×easytaqpcrsupermix5μl，上下游引物snp-f(如seqidno.2)和snp-r(seqidno.3)各0.5μl(10umol·l-1)，基因组dna(50ng·μl-1)0.5μl，用双蒸水补至10μl。
pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃预变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr扩增片段长度为626bp。
3、基因分型
1)采用酶切法检测待测鸡的基因型：利用限制性内切酶pvuii消化扩增的pcr产物(pvuii酶切的位点为cag^ctg，对应酶切seqidno.1的第265-270位)。
取pcr产物10μl，加入0.2μl限制性内切酶pvuii，1.5μl反应缓冲液(10×)，用超纯水补至15μl；37℃恒温培养箱消化6小时。pvuii为日本takara公司产品，其产品货号为d1076b。
2)使用1.5％的琼脂糖凝胶对消化后的pcr产物进行电泳分离，如果只有一个626bp片段，即为tt基因型，如果有626bp、267bp和359bp3个片段，即为tg基因型(如图1所示)。
分别选取酶切鉴定为tg、tt的pcr产物进行测序，结果如图2所示，在不同的品种鸡中，一条特征带为tt基因型，三条特征带为tg基因型，测序基因型检测结果与酶切检测基因型结果一致，表明酶切检测结果准确。tt基因型和tg基因型的测序结果如图2所示。
3)将如seqidno.1中所述的第267处发生的t>g突变位点在不同品种的鸡中进行基因型检测统计分析结果如表1所示。
表1.n.267t＞gsnp位点在不同品种鸡群体中分型统计结果
从表1结果可以看出，在高产蛋鸡海兰褐鸡和罗曼鸡实验群体中只存在tt基因型；在除了高产蛋鸡群体外的其他群体中均存在tt和tg基因型，而在所有被检测群体中均不存在gg基因型。
实施例5
本实施例中snp标记的应用，包括以下步骤：
1)鸡的基因组提取(同常规的提取方法或者实施例4的提取方法)。
2)pcr扩增(同实施例4的pcr扩增方法)。
pcr反应体系均为10μl，其中包括2×easytaqpcrsupermix5μl，上下游引物snp-f(如seqidno.2)和snp-r(seqidno.3)各0.5μl(10umol·l-1)，基因组dna(30-50ng·μl-1)0.5μl，用纯蒸水补至10μl。
pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃预变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr扩增片段长度为626bp。
3)利用限制性内切酶pvuii消化扩增的pcr产物。
取pcr产物10μl，加入0.2μl限制性内切酶pvuii，1.5μl反应缓冲液(10×)，用超纯水补至15μl；37℃水浴消化6小时。
使用1.5％的琼脂糖凝胶对消化后的pcr产物进行电泳分离，如果只有一个626bp片段，即为tt基因型，如果有626bp、267bp和359bp三个片段，即为tg基因型。
4)选择tt基因型个体进行培育，弃去tg基因型的鸡个体，即可快速纯合优势等位基因，得到繁殖性能较好的鸡群。
<110>河南农业大学
<120>一种与鸡致死相关的snp标记及其应用、检测引物、检测试剂盒
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<211>626
<212>dna
<213>鸡
<400>1
ccttatgggggagaggagacaactaggttggccctccaggtgcctgagagcaagcaagcc60
acacgaggcttttagaggcagcaaggactgtccagctttctggaggtctttgcatactac120
agctaagttttaggtgtgggaacagagtgggccctttagaacaagtggcagagacaaatg180
agggtgggagtcagccatgggacagagacagccacgcctgttcttttgcttgtgggcagt240
gacccttggaataacagacagatgcatctgcgggcaccacctctccttcttgctctggga300
cgggatgtatctatctcccccagaacccctgcctctccctttcaagggcagtaaggattg360
tgccaaagtggtgacctgagggccctgggaggctggcaggatcccagtcctgtgctctgg420
ggctcacatggagctctacctgcacaactatgtcctaggatgagaaggtggtcaaggagg480
aggagatgaacagaatccctaagtaggcagggcagtgatggcctttgccggtcctactgc540
ttctcattactcatagaatcatagaatggcccgggttgaaaaggacctcaaagatcatct600
agtttcaacccctctgctatgtgcag626
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<221>snp-f
<400>2
ccttatgggggagaggagaca21
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<221>snp-r
<400>3
aacccctctgctatgtgcag20