本发明提供一种敲除plac8基因的hek293t细胞系构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
hek细胞是来源于人源胚胎肾细胞，hek293t细胞是hek细胞的变种，是由其转染sv40大t抗原得到的可以体外增殖的细胞系，这种细胞系增殖快，转染效率高，常用于蛋白表达。胎盘特异蛋白8(placentaspecialgene8，plac8)又称onzin或c15，是一种富含半胱氨酸的蛋白。plac8广泛分布于真核生物中，其功能也得到越来越广泛的研究，发现其不仅可以调控细胞的分裂，分化和凋亡，还在机体免疫过程中发挥重要作用。然而，关于plac8的作用机理目前还尚不明确，并且关于plac8的作用还有待进一步的研究。因此，构建plac8基因的敲除细胞系是极为重要的，构建成功的细胞系可用于蛋白水平表达、转录组分析以及其他多种实验用途。
目前，plac8敲减细胞系的构建是利用预测软件和mirna库来选择一个潜在靶向plac8的mirna将该基因沉默。此外，crispr/cas9基因编辑技术具有操作简单、作用高效等优点，是目前应用广泛的基因组编辑工具，该系统利用一段rna引导cas9核酸酶可对多种细胞以及动植物基因组实现定点的切割与修饰。然而，目前本领域中尚无采用crispr/cas9技术来构建plac8基因敲除细胞系的相关报道。
此外利用该技术建立基因敲除细胞系，现在大多数实验室都是将设计好的sgrna与某一crispr相关的载体(如px458或者lenticrisprv2等)连接，构建载体-sgrna敲除重组质粒，再将该重组质粒导入病毒包装细胞中，收集病毒上清液转染细胞。然后用嘌呤霉素或者g418等抗生素进行筛选，通过提基因组测序，筛选出敲除成功的细胞，再对敲除成功的细胞通过有限稀释法将细胞分成单克隆，最后在96孔板中培养。这个方法操作起来十分繁琐，并且需要成熟的技术和高要求的实验平台，如慢病毒侵染的方法需要操作病毒，不能在一般的实验室内进行，有限稀释法需要大量的重复性工作，也不能确保能将细胞全部分为单克隆。
技术实现要素：
本发明解决了现有技术中的不足，提供了一种敲除plac8基因的hek293t细胞系构建方法。本发明还同时提供了利用上述方法制备的plac8基因敲除的hek293t细胞系。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种特异性敲除人源plac8基因的sgrna，包括序列a和序列b，所述sgrna在plac8基因上的靶序列位于plac8基因的2号和3号外显子上，其中与2号外显子对应的sgrna序列a为：5’-gtggtcgttgtgacccaacc-3’，与3号外显子对应的sgrna序列b为：5’-actctctacaggacccgata-3’。
本发明同时提供了包含上述的sgrna的重组质粒px458-sgrna1和px458-sgrna2，所述px458质粒上带有egfp的序列。
进一步的，本发明提供了一种plac8基因敲除的hek293t细胞系以及所述的plac8基因敲除的hek293t细胞系的构建方法，包括以下步骤：以重组质粒px458-sgrna1和/或px458-sgrna2作为plac8基因的打靶载体，转染hek293t细胞，获得plac8基因敲除的阳性细胞株，然后进行细胞培养即可。
具体的构建方法如下：
(1)、细胞系的转染：将293t细胞培养在6孔板中，细胞密度长到70～80％时开始做转染；首先将细胞培养液换成opti-mem将细胞饥饿30分钟，然后将构建好的px458-sgrna重组质粒、p3000试剂与lipo3000试剂混合，最后将混合均匀的溶液加入到细胞培养液中；5小时后，换上完全培养液继续培养；24小时后观察荧光；
(2)、流式细胞术分选阳性细胞：将准备分选的细胞消化下来，用pbs按照1000r/5min洗2次，然后取含1％胎牛血清的pbs将细胞吹打混匀，把细胞过膜分散成单细胞，收集在灭菌的15ml离心管中，上机前用1ml枪头轻轻混匀；
(3)、单细胞培养：将筛选出来的细胞养在含有20％血清和2％双抗的完全培养基培养的96孔板中，培养14～16天后将细胞转到24孔板中，待细胞密度达到80％将细胞转入12孔板中，最后将细胞转到6孔板中继续培养；
(4)、测序检测：收取6孔板中长满的细胞提取基因组，进行测序；筛选出被编辑的细胞系，并将该细胞扩大培养，冻存一批。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明利用改进型的crispr/cas9系统从hek293t细胞中敲除plac8基因，操作简便，效果完整而彻底，与hek293t细胞特性一起构成了理想的细胞模型，用于研究细胞内表观遗传学的改变。(2)本发明中基于crispr/cas9系统敲除plac8基因的方法，与沉默、敲低、干扰等方法相比，敲除效果更加彻底，更有利于研究plac8对细胞增殖和凋亡作用的影响。(3)本发明从基因和蛋白水平的检测都证实，plac8已被成功敲除，说明该蛋白已被彻底改变，能造成plac8功能的彻底丧失，适于对plac8进行更加深入的研究。(4)、本发明中采用改进型的crispr/cas9系统从hek293t细胞中敲除plac8基因，用lipo3000转染试剂将载体转染到细胞中，利用流式细胞仪将带绿色荧光的细胞分选为单细胞并直接打到96孔板中，37℃培养箱培养2周左右，将细胞提基因组并测序，筛选出被编辑的细胞。这种方法解决了构建敲除细胞系过程中的转染效率低及慢病毒包装两个瓶颈，提供了一种简便高效的构建敲减细胞系的方法。
附图说明
图1为实施例中重组质粒px458-sgrna1和px458-sgrna2转染293t细胞后的荧光检测图；
图2为实施例中重组质粒px458-sgrna1和px458-sgrna2转染293t细胞后的白光检测图；
图3为野生型序列与敲除型细胞系序列比对图；
图4为敲除型细胞的基因测序峰图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，以下实施例仅用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。若未特殊指明，实施例均按照常规实验条件进行，如j.萨姆布鲁克等人所著的《分子克隆实验指南》，或按照试剂厂商说明书建议的条件。
本发明以下实施例中所采用的重组质粒中包含有sgrna，所述sgrna在plac8基因上的靶序列位于plac8基因的2号和3号外显子上，其中与2号外显子对应的序列a如seqidno.1所示：5’-gtggtcgttgtgacccaacc-3’，与3号外显子对应的序列b如seqidno.2所示：5’-actctctacaggacccgata-3’。利用酶切连接的方法构建重组质粒px458-sgrna1和px458-sgrna2，所述px458质粒上带有egfp的序列。
本发明所提供的敲除plac8基因的hek293t细胞系的具体构建方法如下：
1细胞系的转染
将293t细胞培养在6孔板中，细胞密度长到70～80％时开始做转染。首先将细胞培养液换成opti-mem将细胞饥饿30分钟，然后将构建好的px458-sgrna1以及px458-sgrna2重组质粒取2.5ug和5ulp3000试剂与7ullipo3000试剂混合，最后将混合均匀的溶液加入到细胞培养液中。5小时后，换上完全培养液继续培养。24小时后观察荧光。检测结果如图1和图2所示，图1中a为根据plac8基因组2号外显子上设计的序列a构建的打靶载体(px458-sgrna1)转染293t细胞的荧光图，b为plac8基因组3号外显子上设计的序列b构建的打靶载体(px458-sgrna2)转染293t细胞的荧光图；图2中c为plac8基因组2号外显子上设计的序列a构建的打靶载体转染293t细胞的白光图，d为plac8基因组3号外显子上设计的序列b构建的打靶载体转染293t细胞的白光图，从图1和图2中可以看出本申请中的转染效率很高，约达到了80％左右，证明本申请提供的方案突破了慢病毒包装的瓶颈，提供了一种高效、无毒并简便的构建细胞的方法。
2流式细胞术分选阳性细胞
将准备分选的细胞消化下来，用pbs洗2次1000r/5min，然后取1ul准备好的含1％胎牛血清的pbs将细胞吹打混匀，把细胞过膜分散成单细胞，收集在灭菌的15ml离心管中，上机前用1ml枪头轻轻混匀。
3单细胞培养
将筛选出来的细胞养在含有20％血清和2％双抗的完全培养基培养的96孔板中，约15天左右便可以将细胞转到24孔板中，待细胞密度达到80％就可以将细胞转入12孔板中，最后将细胞转到6孔板中继续培养。
4测序检测
收取6孔板中长满的细胞提取基因组，进行测序，筛选出被编辑的细胞系。测序结构如图3和图4所示，图3为单克隆细胞系序列与野生型序列比对图，图4为测序峰图。从图3中可以看出ko细胞系基因组与wt细胞系基因组相比，序列同源性为78.8％，在sgrna上及其后面相继有序列突变，说明ko细胞系的基因组已经被成功编辑了。从图4测序峰图可以看出，从sgrna序列开始由单峰转变为双峰，进一步证实了碱基序列对比的结果，说明ko细胞系plac8基因组被编辑了。
最后将该细胞继续扩大培养，冻存一批，以便进行后续相关的生理鉴定实验研究。
虽然，本文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做出了详尽的描述，但本领域技术人员可以在本发明基础上对其做一些修改或改进。因此在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中南民族大学
<120>一种敲除plac8基因的hek293t细胞系构建方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gtggtcgttgtgacccaacc20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
actctctacaggacccgata20