一株短尾帚霉WNF22及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及一株短尾帚霉wnf22及其应用。

背景技术

天然气是国民经济发展的重要能源，但天然气勘探开采过程中必须使用钻井基液以润滑冷却钻具、保护井壁、平衡地层压力。聚磺体系钻井基液，具有抗高温和降滤失、成本低等优点，广泛应用于深井和超深井钻探。聚磺体系钻井基液添加了3％-5％磺化褐煤(smc)和2.5％磺化酚醛树脂(smp)等有机聚合物，这些聚合物均由多种有机物聚合而成，是废弃泥浆cod的重要来源。我国每年累计产生废弃钻井泥浆2.50×10⁶m³，且废弃泥浆具有高污染物浓度、高水溶性cod和色度大等特点。因此，若不经处理或处理不彻底进入水环境或土壤，严重影响动物、作物生长，甚至危害人体健康，开展废弃钻井泥浆无害化处理意义重大。

为实现钻井废弃泥浆无害化，世界各国均开展了废弃泥浆理化处理、生物降解技术、废弃泥浆治理工艺的研究与应用。目前常用的钻井废弃泥浆处理工艺包括：注入安全地层、回填处理、固液分离、固化处理和干燥焚烧等。但这些处理工艺未对废弃泥浆进行无害化处理，存在能耗高，易造成二次污染风险。为此，近年来提出了“钻井泥浆不落地”处理工艺，将钻井废弃泥浆分成为岩屑、泥饼和水三部分，再进行分类深度处理，其中岩屑作为铺路材料回收利用，水溶液经预处理—反渗透膜工艺实现达标排放；由于泥饼含有较高浓度的磺化褐煤等有机污染物，仍需要进行无害化处理，因此迫切需要筛选高效降解微生物。

自然界中微生物是环境中有机污染物生物修复的主力军。通过微生物新陈代谢，有机污染物被彻底分解、矿化降解为无机小分子或气体。迄今已报道了100多个属，200多个种的细菌、放线菌、酵母、霉菌以及藻类等微生物类群能够降解有机污染物，部分菌株已得到应用。在石油和天然气勘探领域，钻井废弃泥浆的微生物处理技术已成为国内外研究的热点，但现有研究只涉及石油烃类降解微生物，而对高分子有机物添加物的降解微生物研究较少。

四川盆地是目前全国最大的天然气工业基地，但天然气开采多为深层钻探，主要采用聚磺体系钻井基液。据统计四川省每年天然气钻探井超过300口，年产废弃泥浆90000～150000m³。四川地处长江上游生态敏感和脆弱区，而废弃泥浆主要采用固化处理，环境风险高，因此迫切需要筛选高效降解聚磺废弃泥浆中有机污染物的微生物，进而建立适合四川地理气候条件的废弃磺化钻井泥浆生物处理体系。

技术实现要素：

本发明针对现有降解聚磺废弃泥浆中有机污染物的技术难题，旨在提供一株从聚磺废弃水基钻井泥浆中分离得到的短尾帚霉wnf22，以及其在降解钻井泥浆高分子有机污染物的应用。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明从四川省德阳市废弃钻井泥浆处理场地采集废弃聚磺水基钻井泥浆样品，通过驯化、分离纯化得到真菌菌株wnf22。在pda培养基上培养，菌株wnf22菌丝白色有膈膜、产生圆形的分生孢子、孢子大小4×2.5μm；菌落为粉质状、质地紧密。

提取该菌株的总dna，扩增its片段，所述的菌株wnf22的its序列如seqidno.1所示。将所测得的its序列在美国国立生物信息中心(ncbi)进行比对，wnf22与genbank模式菌株短尾帚霉(scopulariopsisbrevicaulis)ifm55293^t的相似度最高(99.7％)，wnf22在分类上属于短尾帚霉，命名为scopulariopsisbrevicauliswnf22。

基于以上特征，本发明提供了一株短尾帚霉(scopulariopsisbrevicaulis)wnf22，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2018年5月21日，保藏编号为cctccno：m2018293。

本发明所得到的短尾帚霉wnf22在降解水基钻井泥浆中的应用，特别是对磺化褐煤的降解。

优选的，所述的短尾帚霉wnf22或其菌悬液或其培养液或其发酵产物在降解水基钻井泥浆中的应用也在本发明的保护范围内。

同时本发明还提供了所述的短尾帚霉wnf22在修复水基钻井泥浆污染介质中的应用，所述的介质为土壤、水或空气。

另外本发明所述的短尾帚霉wnf22在制备降解水基钻井泥浆的生物制剂中的应用，所述的生物制剂包含短尾帚霉wnf22或其菌悬液或其培养液或其发酵产物。

本发明的有益效果为

本发明提供了一株短尾帚霉wnf22，该菌株能有效降解废弃水基钻井泥浆及主要有机添加物，接菌培养14d后，其对泥浆的cod去除率达24.32％，磺化褐煤降解率达29.29％，处理效果显著。同时，短尾帚霉wnf22具有较强抗逆能力，可作为优良降解菌用于废弃泥浆污染生物处理，应用前景良好。

附图说明

图1是短尾帚霉wnf22在pda培养基上的菌落形态；

图2是短尾帚霉wnf22的its序列的系统发育图。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1短尾帚霉wnf22的分离、纯化和保存

从四川省德阳市钻井废弃泥浆处理场地采集聚磺废弃水基钻井泥浆样品，低温保存带回实验室。

分别制备：

微量元素液：mgso42g，mnso45g，feso4·7h2o5g，cacl25g，znso45g，蒸馏水1l。

ms培养基：nh4cl0.6g，k2hpo40.5g，kh2po40.5g，微量元素液16ml，ph自然，水1000ml。

pda培养基：土豆200g，葡萄糖10g，琼脂20g，ph自然，水1000ml。

取聚磺废弃水基钻井泥浆样品5.0g，加入含95mlms培养基，25℃和140r/min条件下振荡培养7d；吸取1ml培养液，加入新鲜已灭菌的99ml含1％磺化褐煤ms培养基，25℃、140r/min继续振荡培养7d，重复此操作3次。最后吸取1ml培养液，采用梯度稀释法，于pda培养基上涂布，25℃恒温培养。待长出菌落后，从平板上挑选形态不同的菌落在pda平板上点接培养。待菌落产生孢子，挑去一环进行重复点接，结合显微观察，直至纯化为止。纯化后的菌株接入pda培养基的试管斜面培养基保存。

如图1所示，本实施例的分离纯化得到的菌株wnf22在pda培养基上培养，菌丝白色有膈膜、产生圆形的分生孢子、孢子大小4×2.5μm，菌落为粉质状、质地紧密。

实施例2菌株wnf22的its的扩增及系统发育分析

提取菌株总dna，以总dna为模板，用its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)和its5(5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’)为引物扩增its片段，pcr反应用bio-radmycyclertm仪器。

反应体系(50μl)：2×pcrmix25μl，引物its4和its5(10μm)各1μl，dna模板1μl，加超纯水补足至50μl；

pcr反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸8min。

pcr扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检测后，送到上海生工生物工程有限公司进行序列测定。用软件dnaman6.0进行基因序列相似度的计算。所测序列结果如seqidno.1。

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(ncbi)进行比对，发现wnf22的its基因序列与模式菌株短尾帚霉(scopulariopsisbrevicaulis)ifm55293^t的相似度最高，为99.7％。根据ncbi比对结果，选择相似性最高的模式菌株作为参比菌株，用mega6.0软件的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树(图2)，自展值(bootstrap)1000。

基于以上特征，将菌株wnf22鉴定为短尾帚霉(scopulariopsisbrevicaulis)。该菌株已于2018年5月21日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2018293。

实施例3短尾帚霉wnf22降解磺化褐煤能力测定

菌丝长势测定：将wnf22接种于pda固体培养基上活化培养3d，在菌落边缘用内径1cm打孔器打孔，挑取4个菌块，接种于100ml含1％磺化褐煤的ms培养液中，25℃、140r/min振荡培养，以不接菌含1％磺化褐煤ms培养液为对照，重复3次。振荡培养14d后，双层尼龙网过滤菌丝体，蒸馏水洗涤菌丝体3次，80℃烘至恒重，称重并记录。

菌株降解磺化褐煤能力测定：将滤纸80℃烘干至恒重备用，称重并记录(m1)，将上述试验中收集的滤液和洗涤液用已称重的滤纸过滤，滤纸和固体残留物于80℃烘至恒重，称重并记录(m2)；同法称量对照残留物重量并记录(m3)。

测定结果表明，wnf22可利用磺化褐煤为唯一碳源或能源生长，培养14d后，菌丝体生物量为0.250g，显著高于对照处理的0.009g；经计算，该菌株对磺化褐煤的降解率达29.29％。

实施例4短尾帚霉wnf22的抗逆性

针对短尾帚霉wnf22的抗逆能力，主要进行了耐碱、耐盐及生长温室范围测定。将上述的短尾帚霉wnf22的pda斜面培养物在新鲜pda平板上活化培养3d。

采用点接种方法，用接种环挑取一环菌丝，接种于供试培养基的平板上，重复3次。以pda为基础培养基，用1％的naoh溶液分别调节ph至7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。同样，耐盐性测定以pda为基础培养基，调节nac1质量体积分数为1％、2％、4％、6％、8％和10％。耐碱、耐盐试验的平板均为25℃培养5d，测定菌落直径，计算菌丝生长速率。生长温度范围测定，则将接种供试菌株的pda平板，分别放置在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃的生化培养箱中恒温培养5d，测定菌落直径，计算菌丝生长速率。

结果表明，短尾帚霉wnf22有良好的抗逆性，其生长初始ph范围为ph＝7.0～11.0；其耐盐能力较强，能在含10％nacl的pda平板上生长；生长温度范围较广，能在10～35℃温度范围内生长。

实施例5短尾帚霉wnf22对废弃聚磺水基钻井泥浆cod去除能力

将短尾帚霉wnf22接种于pda平板上活化培养3d，在菌落边缘用内径1cm打孔器打孔，挑取4个菌块，接种于100ml含5％泥浆ms液体培养基中，25℃、140r/min振荡培养，以不接菌含5％泥浆ms培养液为对照，重复3次。振荡培养14d后，收集培养液10000r/min离心10min，吸取上清液，并测定其cod值。

结果表明，经过14d处理，wnf22对聚磺废弃水基钻井泥浆cod的去除率达到了24.32％，表现出良好的降解特性。

实施例6废弃钻井泥浆的生物处理效果

1、试验设置

(1)试验共设生物处理(泥浆:自然土按2:1混匀+接种降解菌+栽培刺槐和黑麦草)和对照处理(泥浆:自然土按2:1混匀，不接菌)，于2015年5月至2016年5月进行。按废弃泥浆的0.3％(m/m)接种短尾帚霉wnf22菌剂(菌数≥2.0×10⁸cfu/g，辅料为细米糠和麦麸)，充分混合均匀。

(2)将步骤(1)的混合物料置入处理池，表面覆盖10-15cm的自然土壤；

(3)步骤(1)的混合物料中栽种刺槐，表面的覆土中播撒黑麦草种子，形成植物处理层。

2、降解效果检测

自然条件下处理12个月，期间注意保持处理体系湿度25％左右。分别于2015年5月和2016年5月采集样品，测定生物处理和对照处理的样品水浸提液cod、总石油烃(tph)、硫化物含量和ph值变化(表1)。

表1菌株wnf22对钻井泥浆的处理效果

表1结果显示，处理前污染物初始值均较高，处理1年后各指标大幅降低，处理体系浸出液cod去除率和tph降解率均高于98％，而对照仅为18.98％和13.56％；硫化物含量也大大降低，ph值接近中性。本实施例说明在室外条件下，短尾帚霉wnf22与植物联合处理钻井废弃泥浆，效果显著，应用前景良好。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110>四川农业大学

<120>一株短尾帚霉wnf22及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>594

<212>dna

<213>短尾帚霉wnf22(scopulariopsisbrevicaulis)

<400>1

atcgtaacaaggtctccgttggtgaaccagcggagggatcattaccgaagttactcttca60

aaacccattgtgaaccttacctcttgccgcgcgttgcctcggcggggaggcggggctcgg120

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cgggtcccggcgaaggccagccgtcgaacctttttatttcatggttgacctcgg594

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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