一种动态记录苹果花粉管微丝形态的方法及其试剂盒与流程

本发明涉及植物生物技术领域，具体地说，涉及一种动态记录苹果花粉管微丝形态的方法及其试剂盒。

背景技术

植物的细胞骨架包括微丝和微管，它们组成不同的列阵参与细胞分裂、生长和分化等众多的生理过程。不同的真核生物细胞骨架的排列差异很大，花粉管细胞中的微丝骨架在生殖过程中承担着重要的角色。以往的研究主要集中在体外培养花粉管并观察其细胞微丝骨架的形态，那么如何能够清晰直观地观察花粉管在生长过程中微丝骨架的动态变化、微丝循环、花粉管顶端、亚顶端、颈部的微丝结构变换、单根微丝的生命。花粉管正常生长承担着延续生命的重要职责，大量的离子和蛋白会沿着微丝‘行走’进行物质运输和信号转导，其功能和机制的研究充满着谜题，由于苹果属于多年生木本植物，不仅杂合度高而且染色体经历过多次的加倍和变异，微丝蛋白分子量大且具有高度的复杂性，所以动态实时观测花粉管微丝骨架至今没有在苹果上突破。

本研究以同一地域、同一树龄(10年)、生长势一致的‘金冠’苹果树上的一年生枝条上的大气球期中心花为材料，经过花朵采摘，4℃低温短时期保存，花粉常温干燥、花粉基因枪轰击微丝的marker，lat52-lifeact基因，固体培养基培养2-3h，激光共聚焦观察正常生长过程中微丝骨架排列方式。为直观观察木本植物花粉管内微丝骨架结构与排列方式提供技术支持。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于动态记录苹果花粉管微丝形态的试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种动态记录苹果花粉管微丝形态的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种动态记录苹果花粉管微丝形态的试剂盒，包括以下试剂组合：

用于配制金粉悬液的试剂：粒径为0.06～0.08μm的金粉、质量百分含量为65％～70％的乙醇和质量百分含量为40％～50％的甘油；

用于制备dna子弹的试剂：1.5～2.0mol/lcacl2、0.05～0.10mol/l亚精胺、质量百分含量为65％的乙醇和无水乙醇；

花粉液体培养基：由0.06～0.08g/ml葡萄糖、0.20～0.25mg/mlcacl2和0.06～0.08mg/ml硼酸组成。

优选地，所述试剂盒包括以下试剂组合：

用于配制金粉悬液的试剂：粒径为0.08μm的金粉、质量百分含量为70％的乙醇和质量百分含量为50％的甘油；

用于制备dna子弹的试剂：2.0mol/lcacl2、0.10mol/l亚精胺、质量百分含量为65％的乙醇和无水乙醇；

花粉液体培养基：由0.06～0.08g/ml葡萄糖、0.20～0.25mg/mlcacl2和0.06～0.08mg/ml硼酸组成。

本发明还提供利用所述试剂盒动态记录苹果花粉管微丝形态的方法，包括以下步骤：

1)配制金粉悬液；

2)制备dna子弹；

3)用培养皿体外培养花粉，收集完成水合的花粉；

4)将水合完毕的花粉平铺于用花粉液体培养基湿润的nc尼龙膜上；

5)装配可裂膜，打开基因枪装置，将氦气压力大小调至高于可裂膜压力，进行基因枪轰击；

6)取出轰击后的花粉，用花粉液体培养基将花粉洗脱，洗脱至盛有固体培养基的平皿中，在超净台吹干至粘稠状态；

7)将含有洗脱后的花粉的固体培养基置于潮湿的直径为15cm大号的玻璃皿中，暗培养一段时间；

8)将上述培养充分的花粉管置于全内反射荧光显微镜下观察，根据基因所连接荧光蛋白的不同选择不同的激发光进行观察，动态记录苹果花粉管微丝的形态。

前述方法步骤1)中，所述金粉用量为60mg，加入1.0ml65％乙醇，震荡20min；1000rpm离心10s，弃上清；加入1.0ml无菌水，继续震荡5min；1000rpm离心10s，弃上清；用1.0ml40％甘油将金粉重悬，震荡8min，得到终浓度为50mg/ml的金粉悬液，于4℃保存。

前述方法步骤2)中，用分光光度计测定携带有外源目的基因的质粒的浓度，所述浓度为800ng/μl；取5μl步骤1)的金粉悬液，加入6μl上述质粒；加入8倍质粒体积的2.0mol/lcacl2后加入45μl的0.10mol/l亚精胺；震荡仪上震荡8min；10000rpm离心15s，弃去上清；

加入250μl65％乙醇，10000rpm离心15s，弃去上清；此清洗操作步骤重复2次；

加入8μl无水乙醇，进行重悬。

前述方法中，步骤3)中采用直径为2cm的培养皿，向0.8g花粉中加入1.5ml花粉液体培养基培养花粉35min，直至花粉管长度为4μm。

前述方法中，步骤4)中用枪头吸取花粉液体培养基底部水合完毕的花粉，平铺于用花粉液体培养基湿润的nc尼龙膜上，此操作在直径为10cm的玻璃培养皿中进行，且培养皿中放置大小合适的浸湿的滤纸；在超净台中通风吹至nc尼龙膜上的花粉呈潮湿状态，此时大量花粉液体培养基被吹干。

前述方法中，步骤5)具体操作如下：打开基因枪装置，将氦气压力的大小调到高于可裂膜压力的100-150psi；装配压力为1100psi的可裂膜；将涂有包被金粉的承载膜置于基因枪装置的由上至下第二格，花粉置于第三格，抽真空到24mmhg，进行基因枪轰击；抽真空以及轰击的操作步骤重复2次。

前述方法中，步骤6)中将轰击后的花粉用600μl花粉液体培养基进行洗脱，洗脱至直径为2cm的盛有固体培养基的平皿中。

本发明中所用固体培养基是向所述花粉液体培养基中加入浓度为0.01～0.06g/ml(优选0.01g/ml)的琼脂。

前述方法中，步骤7)中在23℃黑暗的培养箱中培养2h，可微调培养时间。

前述方法中，步骤8)中利用安道尔全内反射荧光显微镜动态记录苹果花粉管微丝的形态。将盖玻片架平放置后，在其上中间位置滴加peg液体，将载玻片对正靠近液滴，载玻片和盖玻片会在液体张力的作用下自动吸附在一起。

将吸附在一起的载玻片和盖玻片孵育过夜后在去离子水流中将载玻片和盖玻片冲洗干净并烘干。

黏贴双面胶带于载玻片上，在载玻片上垂直分成多个通道凹槽，将盖玻片正对通道凹槽黏在双面胶带上并压紧胶带，使得相邻通道凹槽之间互不贯通。

上述经过花粉基因枪轰击过微丝markerlat52:lifeact-egfp的花粉管，利用全内反射荧光显微镜检测单根微丝的动态变化，通过采集荧光分子信号准确检测微丝动态变化。

本发明具有以下优点：

本发明提供了一种动态记录苹果花粉管微丝形态的方法。可实现快速、灵敏、准确性高、简便地验证木本植物材料花粉管微丝骨架的形态。本发明以苹果花粉为试材，通过水合花粉、dna子弹制备以及利用氦气轰击刚萌发的花粉粒，进行高效的基因枪瞬时转化，利用全内反射荧光显微镜动态观察，为直观鉴定木本植物花粉管内微丝骨架及功能验证提供技术支持。

附图说明

本发明有如下附图：

图1为本发明实施例1中动态记录苹果花粉管微丝形态检测结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明试剂中各组分浓度如无特殊说明，均指终浓度。

金粉(目录号为1652262)、1100psi可裂膜(目录号为1652329)，承载膜(目录号为1652323)购于美国bio-rad公司，亚精胺(目录号124209)购于sigma公司，其他常规生化试剂购自北京经科宏达生物技术公司和北京欣经科生物技术公司。离心管等一般耗材购于axygen公司。

实施例1苹果花粉管微丝骨架基因枪瞬时转化方法

由于本发明人前期克隆获得了一个苹果‘金冠’花粉管中的微丝骨架marker基因lifeact-egfp，并经载体构建获得用于基因枪转化的dna，选择‘金冠’花粉为研究对象。花粉基因枪瞬时表达的流程：金粉的预处理—dna子弹的制备—基因枪轰击—花粉收集—花粉培养—激光共聚焦显微镜观察，因此分别从以上各个步骤设计实验来确定花粉基因枪瞬时转化的方法。

一、苹果花粉基因枪的制备

1、苹果花粉的培养

将苹果花粉分散于花粉液体培养基表面，置于23℃培养箱中暗培40min，期间利用体式显微镜观察花粉管的长度，待花粉管长度长至4μm，可停止萌发培养。

2、dna子弹的制备

取直径为0.08μm的金粉60mg，加入1.0ml65％乙醇，震荡20min；1000rpm离心10s，弃上清；加入1.0ml无菌水，继续震荡5min；1000rpm离心10s，弃上清；用1.0ml40％甘油将金粉重悬，震荡8min，得到终浓度为50mg/ml的金粉悬液，于4℃保存。质粒由小量质粒提取试剂盒提取。用分光光度计测定携带有外源目的基因的质粒的浓度，所述浓度为800ng/μl；取5μl步骤1)的金粉悬液，加入6μl上述质粒；加入8倍质粒体积的2.0mol/lcacl2后加入45μl的0.10mol/l亚精胺；震荡仪上震荡8min；10000rpm离心15s，弃去上清；加入250μl65％乙醇，10000rpm离心15s，弃去上清；此清洗操作步骤重复2次；加入8μl无水乙醇，进行重悬。

3、基因枪轰击

用枪头吸取花粉液体培养基底部水合完毕的花粉，平铺于用花粉液体培养基湿润的nc尼龙膜上，此操作在10cm的玻璃培养皿中进行，且培养皿中放置大小合适的浸湿的滤纸。在超净台中通风吹到nc尼龙膜上的花粉呈潮湿状态，此时大量花粉液体培养基被吹干；打开基因枪装置，将氦气压力的大小调到高于可裂膜压力(1100psi)100-150psi；装配1100psi的可裂膜；将涂有包被金粉的承载膜置于基因枪装置的由上至下第二格，花粉置于第三格，抽真空到24mmhg；抽真空进行基因枪轰击(此操作步骤重复2次)。

4、花粉收集

将上述轰击过的花粉用600μl花粉液体培养基进行洗脱，洗脱至直径为2cm的盛有固体培养基的平皿中，在超净台吹干至粘稠状态。

5、花粉培养

将含有花粉的固体培养基置于潮湿的15cm大号的玻璃皿中，在23℃黑暗的培养箱中培养2h，期间利用光学显微镜观察花粉管生长状态，可微调培养时间。

6、全内反射荧光显微镜观察

将上述培养充分的花粉管置于全内反射荧光显微镜下观察，根据基因所连接荧光蛋白的不同选择不同的激发光进行观察。图1所示表示基因枪成功瞬时转化了egfp荧光蛋白，每隔1s进行一次拍摄，连续拍摄6min,每隔40s截取一张图片并记录6min内微丝的动态变化，最后将所拍摄图片利用imagej软件制作成movie，本方法能够高效率地瞬时转化花粉管基因，可以进行后续研究。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。