一种延缓哺乳动物细胞和机体衰老的化合物及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中，能够延缓人间充质干细胞衰老并增强细胞活力的化合物。

背景技术

人口老龄化是包括中国在内的全世界正在面临的严峻问题，正在对全球经济和社会的持续性发展带来重大影响。如何通过延缓机体衰老实现“健康衰老”，也已成为全球科研的热点及难点。

近年来衰老领域的研究进展表明干细胞衰老是导致机体衰老和衰老相关疾病的重要诱因。成体干细胞广泛存在于人类机体，具有自我更新和多向分化潜能，是进行组织修护、开展临床应用治疗特定组织器官疾病的重要资源。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，msc)是成体干细胞的重要组分，具有分化为脂肪、成骨和软骨等多种组织细胞的潜能。已有研究表明伴随着机体衰老，间充质干细胞的耗竭和功能衰退会导致增龄性骨质疏松和肌肉萎缩等衰老相关组织功能减损。因此，维持间充质干细胞等人类成体干细胞的稳态和正常生理功能，将有助于维持其在机体衰老进程中发挥正常组织器官修复和再生的重要功能，从而延缓机体衰老。

植物来源的槲皮素，作为一种具有抗氧化功能的自由基清除剂，已被报道具有抗癌、抗炎、抗病毒以及抑制脂质过氧化等广泛的生物学作用。在延缓衰老方面，有研究报道槲皮素能够能够延长线虫的平均寿命约15％。此外，槲皮素还具有调控原代人成纤维细胞存活率和诱导衰老内皮细胞凋亡等生理功能，但迄今未见槲皮素调控人类间充质干细胞等成体干细胞稳态和细胞衰老的报道。

本发明利用人间充质干细胞复制性衰老模型证明100-300nm工作浓度的槲皮素对于体外培养的人类间充质干细胞具有明显的延缓衰老作用，同时以0.1-0.25毫克/千克体重剂量每周灌胃处理24周后，13-15月龄小鼠的运动耐力也获得明显提升。

技术实现要素：

一种延缓哺乳动物细胞和机体衰老的天然化合物及其应用，所述化合物是槲皮素。

所述哺乳动物细胞为人野生型间充质干细胞和人原代间充质干细胞。

所述人野生型间充质干细胞，其特征在于：所述干细胞为人野生型胚胎干细胞定向分化的间充质干细胞。

所述人原代间充质干细胞，其特征在于：所述干细胞为原代分离的人牙髓间充质干细胞。

所述哺乳动物细胞衰老，其特征在于：所述间充质干细胞具有复制性衰老的细胞表型

所述哺乳动物，其特征在于：所述哺乳动物为野生型小鼠

所述机体衰老，其特征在于：所述15月龄野生型小鼠，其运动耐力显著低于3月龄野生型小鼠；

所述天然化合物，其特征在于：所述化合物为槲皮素。

所述天然化合物，其特征在于：所述化合物延缓间充质干细胞衰老的浓度为100-300nm。

所述天然化合物，其特征在于：所述化合物在延缓细胞衰老、增强小鼠运动耐力等方面的应用。

所述的应用，其特征在于：所述化合物应用包括但不限于治疗增龄相关骨质疏松和肌肉萎缩等衰弱症或其它衰老相关疾病，以及作为延缓衰老保健品的应用。

所述化合物，其特征在于：所述化合物包括但不限于天然提取化合物、人工合成化合物、以及所述化合物的水合物、纳米材料包裹或其他形式修饰的化合物。

附图说明

图1.槲皮素有效浓度筛选实验。a，不同浓度槲皮素处理的人野生型间充质干细胞的细胞生长曲线；b，人野生型间充质干细胞经不同浓度槲皮素处理后进行的衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色；c，图1-a中sa-β-gal阳性细胞数统计。

图2.利用有效工作浓度的槲皮素处理人野生型间充质干细胞后进行的衰老相关标志物检测。细胞衰老标志物p16和p21的westernbloting检测。

图3.利用有效工作浓度的槲皮素处理人原代间充质干细胞后进行的衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色。

图4.槲皮素灌胃处理后生理性衰老小鼠的运动能力检测。对照组灌胃含10％peg的pbs，槲皮素组灌胃槲皮素(0.1-0.25mg/kg体重)，每周灌胃一次，连续24周。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的细胞培养条件如无特殊说明，均为37摄氏度，5％co2。

下述实施例中使用的槲皮素为quercetin，购自selleck公司，货号s2391。

下述实施例中的细胞培养基配方如下：

(1)人胚胎干细胞(esc)培养基配方：

dmem/f12培养基(thermo，11320-033)

0.1mm非必需氨基酸(thermo，11140-050)

1mmglutamax(thermo，35050-061)

20％(体积百分含量)knockout血清替代物(thermo，n10828-028)

1％(1g/100ml)青霉素/链霉素(thermo，15070-063)

55μmβ-巯基乙醇(thermo，21985-023)

10ng/ml人fgf2(jointproteincentral)

(2)间充质干细胞(msc)培养基配方：

mem培养基(thermo，12571071)

10％(体积百分含量)胎牛血清(thermo，10091148)

1％(1g/100ml)青霉素/链霉素(thermo，15070-063)

10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(jpc，bfgf)

msc分化培养基需额外添加5ng/mltgfβ(humanzyme，hz1131)。

下述实施例中的细胞系如下：

人野生型胚胎干细胞系是wicell公司产品，货号：wa09(h9)-dl-7。

下述实施例中的人野生型胚胎干细胞系(esc)培养方法如下：

(1)将esc细胞接种至预先培养了经过丝裂霉素(美国sigma公司产品，货号：m0503)灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(美国invitrogen公司产品，货号：s1520-100)的培养板中，使用人类胚胎干细胞培养基(cdf12培养基)与小鼠胚胎成纤维细胞共同培养；

(2)将esc细胞接种至预先用细胞外基质(qualified-matrigel，美国bdbiosciences产品，货号：354277)包被的培养板中，使用mtesr培养基(美国stemcelltechnologies产品)培养。

下述实施例中的人野生型间充质干细胞(msc)定向诱导分化方法如下：

1、将上述esc细胞进行拟胚体(eb)分化，具体步骤如下：准备含有300-500个细胞、大小均一的esc克隆，用室温pbs清洗一次，用dispase(invitrogen公司，货号为17105041)37℃消化20-30min。待esc克隆形成球体后，用人胚胎干细胞(esc)培养基重悬后，加到低粘附培养板(corning公司，货号3471)中，37℃，5％co2条件培养1-3天后即形成拟胚体。

2、将步骤1获得的拟胚体接种于基质胶(matrigel)(invitrogen公司)包被的6孔板中进行培养，继续培养2周至纤维状细胞出现。再经过一次传代后，利用流式细胞术分选其中的cd73、cd90和cd105均为阳性的细胞类群，即为人野生型间充质干细胞(msc)。

实施例1、槲皮素有效浓度筛选实验。

将第3代(p3)的msc细胞铺种于6孔板中，接种密度为3-5x104个细胞/孔，过夜培养，然后换用分别含有50-2000nm槲皮素和对照溶剂(二甲亚砜，dmso)的间充质干细胞(msc)培养基，隔天换液，连续培养5-6天至细胞汇合度达到90％传代培养，接种密度仍为3-5x104个细胞/孔，记为第4代细胞(p4)，依此方式连续培养至第10代(p10)。衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色和细胞增值曲线的结果表明100-300nm为槲皮素延缓人间充质干细胞复制性衰老的有效工作浓度(图1)。

细胞增值曲线绘制步骤如下：

1)利用细胞计数，统计连续传代(p4-p10)的mscs细胞累积增殖倍数，绘制细胞增殖曲线；

2)每代细胞增殖倍数＝每代结束培养时细胞数/每代起始培养时细胞数；

3)p10代细胞的累积增殖倍数＝log2(p8细胞增殖倍数)+log2(p9细胞增殖倍数)+log2(p10细胞增殖倍数)。

sa-β-gal染色步骤如下：

细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色(senescence-associated-β-galactosidase，sa-β-gal)是一种基于细胞衰老时β-gal活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法。

分别以dmso和槲皮素100nm处理的wsmscs细胞为供试细胞进行sa-β-gal染色：

1)6孔板中以合适密度种入细胞；

2)细胞密度达到60～80％时，pbs清洗两次细胞；

3)2％多聚甲醛+0.2％异戊醛固定，不超过5分钟；

4)pbs清洗2次；

5)加入染色液，37度避光过夜孵育。染色液配方如下：

柠檬酸/磷酸钠缓冲液40mm

k4[fe(cn)6]·6h2o5mm

k3[fe(cn)6]5mm

nacl150mm

mgcl22mm

x-gal1mg/ml

6)pbs清洗2次；

7)hoechst33258(invitrogen，货号：h3569)室温避光孵育5分钟；

8)pbs清洗一次；

9)显微镜下观察。

衰老细胞特异性表达的β-半乳糖苷酶能够催化其底物x-gal生成深蓝色产物。通过对细胞中sa-β-gal染色阳性细胞数进行定量统计即可分析细胞衰老水平。

实施例2、利用有效工作浓度的槲皮素处理人野生型间充质干细胞后进行的衰老相关标志物检测。

收取实施例1中槲皮素和对照试剂处理的p10代人野生型间充质干细胞，利用westernblotting检测发现与对照试剂组相比，槲皮素处理后的人野生型间充质干细胞中衰老分子标志物p16和p21的表达量明显下调。上述结果表明有效工作浓度的槲皮素能够明显延缓人野生型间充质干细胞的细胞衰老表型(图2)。

westernbloting检测步骤如下：

dmso和槲皮素100nm处理的wsmsc第七代细胞作为供试细胞，提取各细胞的总蛋白，利用western-blot检测细胞表达的蛋白质。所用一抗为:anti-p21(cellsignalingtechnology),anti-p16(bdbioscience4828)，二抗为hrp标记的羊抗兔抗体(santacruz公司(货号为sc-2004))。以β-actin为内参，一抗为鼠源抗β-actin抗体(santacruz公司，货号为sc-8432)，二抗为hrp标记的羊抗鼠抗体，santacruz公司(货号为sc-2005)。

实施例3、利用有效工作浓度的槲皮素处理人原代间充质干细胞后进行的衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色.

将第3代(p3)的人原代间充质干细胞铺种于6孔板中，接种密度为3-5x104个细胞/孔，过夜培养，然后换用分别含有100nm槲皮素和对照溶剂(二甲亚砜，dmso)的间充质干细胞(msc)培养基，隔天换液，连续培养5-6天至细胞汇合度达到90％传代培养，接种密度仍为3-5x104个细胞/孔，记为第4代细胞(p4)，依此方式连续培养至第10代(p10)。衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色结果表明有效工作浓度的槲皮素能明显延缓人原代间充质干细胞的复制性衰老(图3)。

sa-β-gal染色步骤同实施例1。

人原代间充质干细胞分离和培养步骤：

分离医院拔除的牙齿牙髓组织，置于间充质干细胞培养基中，在体式镜下将其剪成约0.5x0.5mm大小的组织块，转移至提前用0.1％gelatin(sigma公司)包被的培养板中，加入间充质干细胞培养基，隔天换液，连续培养7-10天后，消化传代，按照2-3x105个细胞/孔的接种密度铺种于6孔板中，记为p1代。

实施例4、槲皮素灌胃处理后生理性衰老小鼠的运动能力检测。

3月龄和15月龄雄性c57bl/6小鼠在22±2℃环境下单独饲养。给予15月龄小鼠槲皮素(0.1-0.25毫克/千克体重)或对照试剂(10％peg的pbs)口服灌胃处理，同时给予3月龄小鼠对照试剂(10％peg的pbs)口服灌胃处理，每周灌胃一次。连续灌胃24周后进行转棒试验测量小鼠的运动耐力，具体为将动物放置在转棒上，初始速度设为5转/分钟，平衡1分钟后记录初始时间，随后加速至40转/分进行测试，记录小鼠从转棒脱落的终止时间。实验结果显示，槲皮素能够明显提升15月龄中年小鼠的运动耐力，提示槲皮素对机体衰老具有明显的延缓作用(图4)。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。