本发明涉及一种提高浓香型白酒固态发酵过程中己酸乙酯含量的混菌制剂的制备方法，属于酿酒微生物领域。
背景技术：
：白酒界素有“千年窖池万年糟，酒好全凭窖池老”的说法，其根本原因在于窖池中窖泥的微生物的活性及其群落组成结构的差异性，窖泥微生物的重要作用不言而喻。窖泥是中国所有涉及到使用窖池固态发酵的白酒酿造的基础，是一个扩大化了的适合白酒发酵功能菌代谢、生长繁殖的广义培养基。己酸乙酯是中国各大香型白酒中重要的风味物质之一，尤其是浓香型白酒的主体香味成分，对白酒酒体的风格有着重要的作用，己酸是合成己酸乙酯的重要前体物质，己酸菌是一类能够产生己酸的菌，多数以梭菌属为主。窖泥中己酸菌活菌数的测定一直是白酒生产过程中发酵容器窖池中窖泥的重要理化指标之一，多被认为其对发酵过程最终形成的白酒产质量的一项重要的影响因素。技术实现要素：本发明旨在提供一种提高浓香型白酒固态发酵过程中己酸乙酯含量的混菌制剂的制备方法，通过窖池底部窖泥厌氧微生物中优势菌种的培养，与窖泥共同制作成菌球，再投放回窖池底中，能够提升白酒中风味物质的含量，尤其能够提高白酒固态发酵过程中己酸乙酯的含量。本发明提高浓香型白酒固态发酵过程中己酸乙酯含量的混菌制剂的制备方法，包括如下步骤：步骤1：营养液的配制将老窖窖泥(是指连续使用50-100年的窖池)和发酵酒醅按照质量比0.5-2：1的比例混合，加入100体积倍的ddH2O中，混合均匀，10000rpm/min下离心，留取上清液作为营养液；步骤2：培养基的配制向500mL营养液中添加酵母提取物1.5-2.0g、蛋白胨5-8g、葡萄糖2.5-5.0g、氯化钠2.5-5.0g、牛肉膏2.5-5g、可溶性淀粉0.5-1.5g、半胱氨酸盐酸盐0.25-0.5g、乙酸钠1.5-3.0g以及琼脂粉5.5-7.5g，pH值调至6.5-7.0。步骤3：菌悬液的配制采用五点取样的方法，在老窖池底四角加池底中心点采取新鲜窖泥(发酵结束后窖池底部的窖泥，下同)样本，混匀于无菌容器中，按照1-2g/100mL的质量体积比将新鲜窖泥和无菌水混匀，获得窖泥原液；梯度稀释窖泥原液，制成菌悬液。梯度稀释窖泥原液的过程中，至少设置五个梯度，每个梯度稀释10倍体积。步骤4：菌苔的制备分别将各个梯度菌悬液铺在步骤2获得的培养基上，37℃厌氧培养3-5天，得到的菌落一方面进行备份培养，一方面进行分子鉴定。老窖(50-100年)窖泥中菌种多样性很明显，在本发明厌氧培养条件下，生长的厌氧菌落主要包括Clostridiumtyrobutyricum酪丁酸梭菌、RuminococcaceaebacteriumCPB6反刍球菌细菌CPB6、Lactobacillusacidipiscis乳酸杆菌、Lactobacillussp.GJG1乳杆菌GJG1、LachnospiraceaebacteriumBTY6木犀科细菌BTY6、ClostridiumbeijerinckiiGJG2拜氏梭菌GJG2等优势菌种。这些经过分子鉴定的优势厌氧菌都可以进一步纯培养并通过菌苔生长实现扩大培养。将反刍球菌细菌CPB6(RuminococcaceaebacteriumCPB6)、酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)、乳杆菌GJG1(Lactobacillussp.strainGJG1)、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillusacidipiscis)、木犀科细菌BTY6(LachnospiraceaebacteriumBTY6)以及拜氏梭菌GJG2(ClostridiumbeijerinckiiGJG2)按照2-5：1-3：1-3：1-2：0.5-1：0.5-1的菌落个数比例混合于培养基中获得混菌悬液，将所得混菌悬液铺板培养获得混菌菌苔(培养的温度37℃时间96h)，优选比例为3.5：2：1.5：1：1：1。厌氧培养的气体条件为：N2：H2：CO2＝8:1:1，体积比。步骤5：菌球的制备取池底新鲜窖泥，向所取窖泥中加入窖泥质量2％的窖池底部积存的黄浆水，混和均匀，团作球状；将步骤4所得混菌菌苔连同培养基揉碎后密封内置于球状窖泥中，获得菌球。每个菌球为实心球，铅球大小，重0.5-1.5kg。菌球的益处在于，可以把厌氧菌与外界空气之间实现足够程度的隔离，可以保障至少有一定比例的厌氧菌在投放窖池前处于成活状态。将制作好的菌球均匀投放在窖池底部，投放密度为每2平方米1-2个菌球，投放后立即用酒醅覆盖，入池完毕后封窖发酵。本发明的有益效果体现在：1、本发明所提供的培养方法培养的混菌，其混菌的发酵液能够显著消耗乙酸，乳酸，产生己酸，并且产酸及其他风味物质含量均优于空白对照。2、本发明所提供的菌球制作方法及投放方式，能够在很大程度上起到隔绝氧气的作用，利于所培养的混菌能够大量存活并在发酵过程中起到重要作用。3、本发明菌球在窖池投放中应用时，白酒固态发酵过程中，对发酵结束后出池酒醅的淀粉残余量更小，表明被相关微生物分解的彻底，发酵更充分。发酵后的酒醅明显香气更浓，显著提升出池酒醅的香味物质含量，尤其对酒体风味影响较大的香味物质己酸和己酸乙酯的含量。4、本发明中菌球在窖池底投放发酵后，能够改善窖底泥中pH，己酸菌活菌数也有一定的提升，更利于窖池老熟及窖泥中优质菌群的生长。5、本发明菌球在固态发酵过程中，在一定程度上能够延长窖池发酵温度中“前缓中挺后缓落”各阶段的时间，更有利于发挥发酵各阶段相关微生物的作用，更利于产酒、产香，发酵更彻底。6、本发明中菌球在白酒固态发酵过程中，发酵结束后能够提升基酒中己酸乙酯的含量以及风味物质总量也有所提升，可以起到提升基酒的质量的重要作用。附图说明图1是qPCR定量测定Lactobacillusacetotolerans在18个窖泥样本中的相对含量。其中图1a是qPCR扩增曲线；图1b是Tm曲线分析；图1c是标准曲线；图1d是目标序列在18个样本中的拷贝数。图2是qPCR定量测定RuminococcaceaebacteriumCPB6在18个窖泥样本中的相对含量。其中图2a是qPCR扩增曲线；图2b是Tm曲线分析；图2c是标准曲线；图2d是目标序列在18个样本中的拷贝数。图3是混菌菌苔和纯菌菌苔的照片。具体实施方式实施例1：新老窖池窖泥微生物厌氧培养菌落的分子鉴定提取各个菌落的基因组，扩增16S全长rDNA并测序，部分结果如下表格1-3。总的结果发现新窖池(5年)窖泥厌氧培养的菌落以乳酸杆菌为主，老窖池(50-100年)窖泥中菌种多样性很明显，在本发明的厌氧培养条件下，生长的厌氧菌属主要包括Clostridiumtyrobutyricum酪丁酸梭菌、RuminococcaceaebacteriumCPB6反刍球菌细菌CPB6、Lactobacillusacidipiscis乳酸杆菌、Lactobacillussp.GJG1乳杆菌GJG1、LachnospiraceaebacteriumBTY6木犀科细菌BTY6、ClostridiumbeijerinckiiGJG2拜氏梭菌GJG2等。老窖泥厌氧菌落的测序有时整板也可能基本上都是乳酸杆菌，提示窖泥取样的时候比较容易发生取样不均匀的情况，出现乳酸杆菌含量较高的情况的是一些产酒质较差的老窖池的窖泥。经过测序发现RuminococcaceaebacteriumCPB6、Clostridiumtyrobutyricum酪丁酸梭菌等主要存在于老窖泥(优质窖泥)中，而Lactobacillusacetotolerans主要存在于新窖泥(普通窖泥)中。部分测序结果见表1-5。表1古井老厂区厌氧菌16SrDNA测序结果(I)表2古井老厂区厌氧菌16SrDNA测序结果(II)表3古井老厂区厌氧菌16SrDNA测序结果(III)表4古井老厂区厌氧菌16SrDNA测序结果(IV)表5古井新厂区厌氧菌16SrDNA测序结果(I)实施例2：利用物种特异性引物和qPCR测定不同窖泥样本中RuminococcaceaebacteriumCPB6和Lactobacillusacetotolerans的含量利用Primer-Blast方法为Lactobacillusacetotolerans和RuminococcaceaebacteriumCPB6设计了基于全基因组信息的物种特异性引物。设计时以古井已知具备全基因组序列的全部物种为背景。以老窖泥和新窖泥宏基因组的混合样为模板使用设计的引物首先经过PCR扩增，确认扩增的片段大小正确，之后将扩增产物纯化后进行DNA测序，进一步确认目标扩增产物的正确性。扩增产物进一步进行TA克隆，随机抽取15个阳性克隆进行插入序列的测序验证，进一步确认目标靶序列的正确性。经过这几轮测试后，引物的特异性得到了保证。但是是否可以用于qPCR实验仍然需要进一步验证，要求在合适的扩增条件下扩增产物的Tm曲线只有目标产物的一个主峰(没有明显的引物二聚体对应的峰)。Lactobacillusacetotolerans的两对引物信息如下：LA2F:5'-GTGCAGCTTAAGGGCTTCCT-3'(Tm:60.32℃)，LA2R：5'-ATCTGTGCAGATTGTTCCCTT-3'(Tm:57.55℃)，目标靶序列194bp；LA3F:5'-AGAGTGTCCCGAGTAGTCCC-3'(Tm:60.03℃)，LA3R:5'-AACTGCTCAAGAAGGGACCG-3'(Tm：59.96℃)，目标靶序列150bp；RuminococcaceaebacteriumCPB6的两对引物信息如下：CPB6-1F:5'-GGTGAAACGCCGAAAACGAA-3'(Tm：59.97℃)，CPB6-1R：5'-CCAAAAAGGCCACTGTCTGC-3'(Tm：59.97℃)，目标靶序列118bp；CPB6-2F：5'-CGCACTATGAGCAAATGGGC-3'(Tm:59.97℃)，CPB6-2R：5'-CATCAATGCGCTTCAGAGCC-3'(Tm：59.97℃)，目标靶序列211bp。上述4对引物的特异性都没有问题。Lactobacillusacetotolerans的两对引物也都满足qPCR的要求；但是RuminococcaceaebacteriumCPB6的两对引物中只有第一对引物符合qPCR实验要求。选择18个窖泥样本提取宏基因组测试上述两个菌种的相对含量。这18个窖泥样本是依据对应的酒体质量进行选择的，其中G1-G7属于酒体质量最好，为老窖泥；N-N6属于酒体质量中等，其中既有老窖泥也有新窖泥样本；B1-B6属于普通酒体质量，为新窖泥。qPCR结果证实了如下结论：Lactobacillusacetotolerans在新窖泥中的含量明显高于老窖泥(图1)，而RuminococcaceaebacteriumCPB6菌种的含量是老窖泥明显高于新窖泥(图2)。不过，即使在新窖泥中，有的窖池之窖泥Lactobacillusacetotolerans菌种的含量也很低(图1)。而且，即使在老窖泥中，有的窖池之窖泥RuminococcaceaebacteriumCPB6菌种的含量也不高(图2)。但是总的趋势差异是明显的。实施例3：营养液的配制选取老窖窖泥50g、发酵酒醅75g，加入500mL的ddH2O中，充分混合均匀，10000rpm/min离心，取上清液即作为营养液。营养液可以在-80℃长期冻存。实施例4：厌氧菌苔的制备1、培养基的配制在500mL的营养液中，添加酵母提取物1.5g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，氯化钠3.0g，牛肉膏2.5g，可溶性淀粉1.0g，半胱氨酸盐酸盐0.25g，乙酸钠1.5g，琼脂粉5.5g，最终pH调至7.0。2、菌悬液的配制新鲜窖泥样本，采用五点取样的方法，池底四角加池底中心点，混匀于一个无菌的管子中，使用1-2％的窖泥和无菌水混匀，梯度稀释窖泥原液，制成菌悬液。3、混菌的培养使用新鲜窖泥各梯度菌悬液铺在特制的培养基上，37℃，厌氧条件下培养3-5天。实施例5：菌球的制备和投放1、菌球的制作取池底新鲜窖泥，加入一定2％的窖池底部积存的黄浆水，混和均匀，团作球状，将培养好的菌苔内置其中，再使用均匀的窖泥密封，制成“菌球”，每个“菌球”为实心球，铅球大小，重1.5kg左右，把纯培养备份的优势厌氧菌的菌落个数(菌落大小都类似，直径大概为2.5-3mm)按照RuminococcaceaebacteriumCPB6：Clostridiumtyrobutyricum：Lactobacillussp(GJG1)：Lactobacillusacidipiscis：BTY6＝3.5：2：1.5：1：1：1的比例混合在一起制备铺板制备足够数量的混菌菌苔，菌苔连同培养基揉碎后与窖泥土壤混合制备菌球，其中，每个菌球中菌苔添加比例约为5％(w/w)。2、菌球的投放将制作好的菌球均匀投放在窖池底部，每2平方米投放菌球1-2个，投放后立即将入池的酒醅覆盖，入池完毕后封窖开始发酵。实施例6：窖池测试效果(1)降低乳酸增加己酸在500mL的营养液中，添加酵母提取物1.5g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，氯化钠3.0g，牛肉膏2.5g，可溶性淀粉1.0g，半胱氨酸盐酸盐0.25g，乙酸钠1.5g，刃天青钠盐2.0g。把纯培养备份的优势厌氧菌的菌落个数(菌落大小都类似，直径大概为2.5-3mm)按照RuminococcaceaebacteriumCPB6：Clostridiumtyrobutyricum：Lactobacillussp(GJG1)：Lactobacillusacidipiscis：BTY6＝3.5：2：1.5：1：1：1的比例混合在一起制成混合菌液，对照组则不加混合菌，最终pH调至7.0，灭菌除氧，厌氧罐中培养7天。混合菌液发酵实验结果如下：表5混合菌液发酵实验产酸情况(单位：mg/L)样品己酸乳酸丁酸乙酸混菌156.137252.3756.80377.90对照组1.6014468.402.323463.38由表5可知，混合菌液具有显著消耗乙酸、乳酸和产己酸、丁酸的能力，其中，对照组产乳酸是混合菌液的2倍，对照组产乙酸是混合菌液的接近10倍，混合菌液产己酸是对照组的接近100倍，混合菌液产丁酸是对照组的23倍。实施例7：窖池测试效果(2)提高酒醅发酵程度表6加菌球发酵前后出池酒醅理化指标对比分析注：(“+”表示加“菌球”，“/”表示未加“菌球”，“P0”表示加“菌球”前出池酒醅，“P1”表示加“菌球”发酵结束后出池酒醅，“A、B表示车间编号，“A和对照A”表示A车间的实验窖池和对照窖池，“B和对照B”表示B车间的实验窖池和对照窖池。)由表6可知，加菌球发酵一轮后的，出池酒醅实验组比对照组残余淀粉含量比例小，表明实验组中淀粉被相关微生物分解的更充分，发酵更为充分，提高酒醅发酵程度。实施例8：窖池测试效果(3)改善窖泥pH，提高窖泥中己酸菌活跃度表7加菌球发酵前后出池酒醅理化指标对比分析注：(“+”表示加“菌球”，“/”表示未加“菌球”，“P0”表示加“菌球”前池底窖泥，“P1”表示加“菌球”发酵结束后池底窖泥，“A、B表示车间编号，“A和对照A”表示A车间的实验窖池和对照窖池，“B和对照B”表示B车间的实验窖池和对照窖池。)由表7可知，加菌球发酵一轮后的，池底窖泥的pH是有所改善的，两个车间实验中，其中A车间发酵结束后，己酸菌活菌数实验组和对照组都是有所增加，实验组的增幅比对照组的增幅较大。对于B车间发酵结束后实验组和对照组己酸菌活菌数都有不同程度的降低，但是对照组比实验组降低的幅度更大，侧面也表明加了“菌球”的实验组窖泥己酸菌活菌数还是优于对照组的，就己酸菌活菌数而言是有一定的提升效果。实施例9：窖池测试效果(4)酒醅发酵后的风味物质总含量提高，且己酸、己酸乙酯含量增多，乳酸乙酯含量减少表8加菌球发酵结束后出池酒醅的风味物质含量对比分析(单位：mg/L)样品乙酸乙酯己酸乙酯丁酸乙酯乳酸乙酯己酸乙酸丁酸AN1(+)53.69111.864.52445.11514.212090.78262.80对照AN1(/)61.8383.352.61593.58264.671781.68281.45BN1(+)43.62393.129.43333.061841.311840.45445.45对照BN1(/)39.2491.3311.87551.74476.951277.08255.98由表8可知，加菌球发酵结束后实验组和对照组出池酒醅的风味物质含量中，己酸乙酯含量增加量较多，己酸含量增加量较多，乳酸乙酯含量有降低，表中所在的对酒体风格影响作用较大的呈香物质的总量实验组比对照组是显著提升的。实施例10：窖池测试效果(5)提高基酒酒样中风味物质总含量，提高浓香型主体香己酸乙酯含量表9加菌球测试前后基酒酒样风味物质含量对比分析(单位：mg/L)样品己酸乙酯乙酸乙酯乳酸乙酯丁酸乙酯己酸乙酸丁酸AJ0(/)982.351532.461229.44123.47688.34159.54297.28对照AN0(/)1257.461574.821413.13130.48558.48148.25226.19AN1(+)2408.912791.081683.47204.70481.95581.81235.68对照AN1(/)2366.932364.411624.57182.31471.44486.06269.14BJ0(/)1146.321529.521592.91138.97644.43145.50266.09对照BN0(/)974.861408.881614.14140.80472.01141.03183.89BN1(+)3505.262143.211812.09230.57668.51543.49238.43对照BN1(/)2470.291875.271594.48167.92382.94447.54161.46注：(“+”表示加“菌球”，“/”表示未加“菌球”，“J0”表示加“菌球”前出池基酒样品，“J1”表示加“菌球”发酵结束后出池基酒样品，“A、B表示车间编号，“A和对照A”表示A车间的实验窖池和对照窖池，“B和对照B”表示B车间的实验窖池和对照窖池。)由表9可知，横向对比，实验组和对照组(不加菌)的窖池发酵一个周期后，酒样中四大酯含量呈增加的趋势，实验组相对对照组，浓香型的主体香己酸乙酯含量比实验组多，乳酸乙酯含量比实验组少；横向对比，实验组和对照组表现出呈酸类物质也略有升高，实验组比对照组己酸含量高，乙酸、丁酸含量接近。纵向对比，每个窖池加菌前后的含量比较，酯含量尤其是实验组己酯含量增幅相对对照组较大，乳脂增幅相对己酯的增幅小，酸含量增幅与对照组相比差别不大。目前已建立窖泥中厌氧混菌培养方法，完成菌球制作并投入使用，结果表明，菌球的投入能够使得己酸菌活跃程度高，提高白酒固态发酵过程中的己酸乙酯含量，且呈香物质的总量高、出池酒醅淀粉残余量小，发酵更充分。实施例11：制备菌球的优势厌氧菌的代表性16S核糖体RNA基因全长序列，RuminococcaceaebacteriumCPB6、Clostridiumtyrobutyricum、Lactobacillussp.strainGJG1、Lactobacillusacidipiscis、LachnospiraceaebacteriumBTY6、ClostridiumbeijerinckiiGJG2每个菌种提供1条代表性序列。>RuminococcaceaebacteriumCPB61gacgaacgctggcggcgtgcctaacacatgcaagtcgaacgaaactttttgcttcggtag61aaagtttagtggcgggacgggtgagtaacgcgtgaggaacctgcctttcagagggggata121atgtctggaaacggacactaataccgcatgacattttctgttcacatggacagaaaatca181aaggagcaatctgctgaaagatggactcgcgtccgattagctagatggtgagataatagc241ccaccatggcgacgatcggtagccggactgagaggttgaacggccacattgggactgaga301cacggcccagactcctacgggaggcagcagtgggggatattgcacaatggaggaaactct361gatgcagcaacgccgcgtgaaggaagacggtcttcggattgtaaacttttgtacctaggg421acgataatgacggtacctaggcagcaagctccggctaactacgtgccagcagccgcggta481atacgtagggagcgagcgtttgtccggatttactgggtgtaaagggtgcgtaggcggcca541agcaagtcagctgtgaaaactatgggcttaacccatagcctgcaattgaaactgtttggc601ttgagtgaagtagaggtaggtggaattcccggtgtagcggtgaaaatgcgtatgagattg661ggaggaacaccagtggcgaaggcgacctactgggctttaactgacgctgaagcacgaaag721catgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccatgctgtaaacgatgattactag781gtgtggggggtctgaccccttccgtgccggagttaacacaataagtaatccacctgtgga841gtacgaccgcaaggttgaaactcaaggaattgacgggggcccgcacaagcagtggagtat901gtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatccaactaacgaag961cagagatgcattaggtgcccttcggggaaagttgagacaggtggtgcatggttgtcgtca1021gctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttactgttagttg1081ctacgcaagagcactctagcaggactgccgttgacaaaacggaggaaggtggggacgacc1141gtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtactacaatggccgttaacag1201agagaagcgataccgcgaggtggagcgaacctcaaaaagcggtctcagttcggattgcag1261gctgaaacccgcctgcatgaagttggaattgctagtaatcgcggatcataatgccgcggt1321gaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagccggtaatacccg1381aagtcagtagtctaaccgcaaggaggacgctgccgaaggtaggattggcgactgtggtga1441agtcgtaacaaggtctacgatgtgatgcttgcacaagtgatccaatgtacagctcacg>Clostridiumtyrobutyricum1ctggcggcggctaccatgctagttcgagcgatgaaccccttcgggggtggattagcggcg61gacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctcaaagtgggggatagccttccgaaaggaa121gattaataccgcataaagccaagtttcacatggaatttggatgaaaggagtaattcgctt181tgagatggacccgcggcgcattagttagttggtggggtaatggcctaccaagacagcgat241gcgtagccgacctgagagggtgatcggccacattggaactgagatacggtccagactcct301acgggaggcagcagtggggaat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