结核分枝杆菌的利福平耐药性诊断标志物及其应用的制作方法

本发明涉及一种结核分枝杆菌的利福平耐药性诊断标志物及其应用。

背景技术

耐药结核病是全球结核病防控工作中面临的重大难题，尤其是耐多药结核病和广泛耐药结核病严重威胁人类身体健康，2013年报告显示虽然新发结核病患者减少，但耐多药结核病的诊治远远未达到预期目标。耐药结核病的及时有效监测是结核病防治工作的关键，目前我国结核病实验室对耐药结核病的诊断包括传统比例法药敏、bactecmgit960系统以及基于分子生物学的快速诊断方法等。

现有检测结核分枝杆菌异烟肼耐药的技术主要有包括两大类：基于培养的药敏检测、基于分子生物学基础的快速药敏检测。现有技术的缺点主要包括：耗时长，需要建立在分离培养的基础上进行药敏检测，分离培养需要4-8周时间，在此基础上进行后续的传统固体比例法(4-8周)或者液体药敏(1-2周)的时间；场地限制，两种培养方法均需要体积较的培养箱，为保证生物安全需要固定的培养房间；耐药靶点局限，新兴的以分子生物学为基础的快速诊断技术大大缩短了诊断周期1-2小时以内，但是受目前研究水平的限制，目前最优的xpertmtb/rif利福平耐药检测靶点局限于ropb基因的突变位点；而临床有xpertmtb/rif报告利福平耐药但临床利福平敏感的情况，提示利福平耐药可能有其它基因位点的突变。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌的利福平耐药性诊断标志物及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种结核分枝杆菌的利福平耐药性诊断标志物，由rv0840c、rv2386c、rv1130组成。

进一步地，当rv0840c、rv2386c、rv1130的表达量高于正常表达量时，判断结核分枝杆菌对利福平耐药。

一种用于检测结核分枝杆菌利福平耐药性的试剂盒，该试剂盒中含有定量rv0840c、rv2386c、rv1130表达量的试剂。

进一步地，当rv0840c、rv2386c、rv1130表达量高于正常表达量时，判断结核分枝杆菌对利福平耐药。

一种检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法，包括以下步骤：

1)定量待测结核分枝杆菌中rv0840c、rv2386c、rv1130表达量；

2)根据rv0840c、rv2386c、rv1130表达量，判断结核分枝杆菌利福平耐药性。

进一步地，当rv0840c、rv2386c、rv1130表达量高于正常表达量时，判断结核分枝杆菌对利福平耐药。

本发明的有益效果是：

本发明公开了结核分枝杆菌的利福平耐药性诊断标志物可实现结核分枝杆菌利福平耐药性的快速临床检测，并为治疗利福平耐药提供了潜在靶点。

附图说明

图1为利福平耐药菌株与对照组基因组甲基化水平的热图；

图2为利福平耐药过程中甲基化水平发生变化的基因经的kegg分析结果；

图3为利福平耐药菌株与对照组基因组转录组水平的热图；

图4为利福平耐药过程中表达水平发生变化的基因的kegg分析结果。

具体实施方式

基于目前的技术水平，本发明以利福平耐药新的分子标识为目标，以体外利福平梯度浓度药物筛选出的对照清晰的利福平耐药家系为研究对象，通过基因组甲基化水平、表达谱水平两个组学的检测，筛选出与对照相比甲基化水平降低最明显同时表达说水平明显升高的三个基因作为利福平耐药的新诊断标志物。本发明的分子标志物来源于两个组学水平的筛选，通过组学筛选可以全面的找到有意义的分子标志物，但是会增加误选的机会，为解决这个难题，我们选用分子表达过程中紧密联系的两个生物学过程(甲基化、基因转录)进行数据的相互验证，找出新的、差异最明显且两组学数据理论上互相支持的基因做为利福平耐药的诊断标志物。

本发明中筛选诊断标志物的实验步骤如下：

⑴耐药家系的构建

首先挑先h37rv单克隆菌株，扩增后保存为g0代菌株，同时准备好1麦氏浊度的菌液接种到利福平的梯度培养基上(培养基中利福平的浓度分别为2⁰、2^-1、2^-2、2^-3、2^-4μg/μl)，37℃培养箱中培养4周左右，取有菌落生长且菌量满足后续的冻存及传代的最高药物浓度培养基的菌株为g1代，以此类推，直至最高药浓度(who标准耐药浓度)培养上有足量细菌生长，定义为利福平耐药株模型构建成功。

⑵组学分析

扩增利福平耐药菌株与平行对照菌析，分别提取基因组、rna进行后续的甲基化组学、转录组学测序分析，经生物信息分析后筛选出甲基化水平降低最显著且表达水平升高最显著的三个基因作为利福平耐药诊断的新的分子标志物。组合目前成熟的各种基因检测方法即可开发出新的利福平耐药快速诊断试剂盒。

利福平耐药菌株与对照组相比基因组甲基化水平的热图分析：

结果见图1，每一条横线条代表一个基因，通过热图可以清晰的显示出两组样本中甲基化的差异。在利福平耐药发生过程中，有的基因甲基化水平升高，相对应基因在对照组中甲基化水平降低。

差异基因的信号通路富集分析：

将利福平耐药过程中甲基化水平发生变化的基因经kegg分析，结果见图2，即可得到这些差异基因所富集的细胞信号通路，图中的圆圈大小表示富集基因的数量，而颜色的深浅分别对应的富集相关程度。

利福平耐药菌株与对照组相比基因组转录组水平的热图分析：

结果见图3，每个实验组因转录组分析要求需要做三个重复，每一条横线条代表一个基因，通过热图可以清晰的显示出两组样本中同一基因表达水平的差异。在利福平耐药发生过程中，有的基因表达水平升高，相对应基因在对照组表达水平降低。

转录水平差异基因的信号通路富集分析：

将利福平耐药过程中表达水平发生变化的基因经kegg分析，结果见图4，即可得到这些差异基因所富集的细胞信号通路，图中的圆圈大小表示富集基因的数量，而颜色的深浅分别对应的富集相关程度。

两组学差异综合分析结果：

经过两组学的联合分析，最终筛选到在利福平耐药过程甲基化水平降低同时表达水平升高的最显著的三个基因rv0840c、rv2386c和rv1130即是利福平耐药的新的分子诊断靶点，并可能是潜在的治疗靶点。

实施例1

一种结核分枝杆菌的利福平耐药性诊断标志物，由rv0840c、rv2386c、rv1130组成，当rv0840c、rv2386c、rv1130的表达量高于正常表达量时，判断结核分枝杆菌对利福平耐药。

实施例2

一种用于检测结核分枝杆菌利福平耐药性的试剂盒，该试剂盒中含有定量rv0840c、rv2386c、rv1130表达量的试剂，当rv0840c、rv2386c、rv1130表达量高于正常表达量时，判断结核分枝杆菌对利福平耐药。

实施例3

一种检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法，包括以下步骤：

1)定量待测结核分枝杆菌中rv0840c、rv2386c、rv1130表达量；

根据rv0840c、rv2386c、rv1130表达量，判断结核分枝杆菌利福平耐药性，当rv0840c、rv2386c、rv1130表达量高于正常表达量时，判断结核分枝杆菌对利福平耐药。